一组鉴定丰悦和超红猕猴桃品种间杂交子代的引物

摘要

本发明涉及一组鉴定丰悦和超红猕猴桃品种间杂交子代的引物，属于植物遗传育种领域。本引物包括3个叶绿体和3个线粒体引物对：SEQ ID NO：7、8，SEQ ID NO：9、10，SEQ ID NO：11、12，SEQ ID NO：13、14，SEQ ID NO：15、16，SEQ ID NO：17、18。本方法是：①基因组DNA提取；②PCR扩增；③DNA测序；④序列分析；⑤杂交子代的鉴定。与现有技术相比，本发明操作简单、重复性好、稳定性高、不受环境影响；节省育种成本。

说明书

技术领域

本发明属于植物遗传育种领域，具体涉及一组鉴定丰悦和超红猕猴桃品种间杂交子代的引物，可加快猕猴桃育种进程。

背景技术

猕猴桃（属名：Actinidia）为雌雄异株的大型落叶木质藤本植物，其果实质地柔软，口感酸甜，具有丰富的营养价值，富含维生素和钙、钾、硒、锌、锗等微量元素，被誉为“水果之王”。目前，我国猕猴桃产量和面积均居世界第一，在世界猕猴桃产业中具有举足轻重的地位。

原产于我国的猕猴桃共有52个种，物种间具有广泛的果实表型、品质特性和遗传变异的丰富多样性。在生产上有较大栽培价值的种类是中华猕猴桃（Actinidia>chinensis）、美味猕猴桃（Actinidia>）和毛花猕猴桃（Actinidia>）等。在新品种培育过程中，以果形美观、优质耐贮、丰产和抗逆等为育种目标，常选择多个猕猴桃品种或种类作父母本进行杂交，从杂交子代中选出具有优良性状的个体进行培育。如超红是以果大、维生素C含量高和花为粉红色的毛花猕猴桃为母本，以中华猕猴桃花粉添加适量毛花猕猴桃花粉为父本进行杂交，从杂交一代选育出的新品种，具有长势强、花色艳丽、花瓣数多和花期长等特点。金艳是从以毛花猕猴桃株系6113作为母本，以中华猕猴桃作父本的杂交子代中经多代选育而形成的新品种。同时早期也采取直接野生资源中选择优株，经多代子代鉴定培育而成，如中华猕猴桃黄肉品种丰悦就是从湖南野生资源中选育而成的品种，具有细嫩多汁、味甜、成花能力强、抗逆（抗高温、抗病）性强和早熟等特点。

在新品种培育过程中常使用多个猕猴桃物种间或品种间杂交，在管理中有时会出现群体间弄混的现象，因此准确判断一个杂交子代是否是目标杂交组合的子代是育种过程中的必要环节。但是，猕猴桃杂交子代早期的物种特征性状不明显，不能通过简单的性状判别去鉴定是否为真实的种间杂交。近年来，分子标记技术在物种鉴定中被广泛应用，具有方法稳定、不受表型及环境变异影响等优点，在判别种间杂交后代的真实性、缩短育种周期和推动作物育种发展方面具有独特优势。

根据猕猴桃子代的叶绿体基因属于父系遗传，线粒体基因属于母系遗传的遗传特点，可通过发掘猕猴桃不同物种叶绿体和线粒体基因组特征序列，通过开发系列引物，基于简单PCR扩增出父本叶绿体和母本线粒体的特征DNA序列，判别子代是否为种间杂交后代。

发明内容

本发明的目的提供一组鉴定丰悦和超红猕猴桃品种间杂交子代的引物，鉴定丰悦和超红猕猴桃品种间杂交子代的方法，加快猕猴桃育种的进程。

本发明的目的是这样实现的：

一、一组鉴定丰悦和超红猕猴桃品种间杂交子代的引物

本发明通过比较丰悦和超红的叶绿体和线粒体基因组序列，开发出一组用于鉴定丰悦和超红杂交子代的引物，分别包含叶绿体和线粒体分子标记的3对引物：

1）Kiwi-cp20：

F：5’-CCTCCATTTCTCCTACCCGC-3’，R：5’-TGTGATGCTGGGATCTTGGG-3’；

2）Kiwi-cp25：

F：5’-CCCTGTCCTACCTTTCGCAG-3’，R：5’-TGACGGACAAATCACTCCCG-3’；

3）Kiwi-cp26：

F：5’-GCATCGACCCAGGAAGACTC-3’，R：5’-TTGTTTCAAGGCCGACCCTA-3’；

4）Kiwi-mt13：

F：5’-AGATGGAGGCACAACTGAGC-3’，R：5’-GCCATGAAGTGCGCTATGTG-3’；

5）Kiwi-mt14：

F：5’-CATCGACTCATCCCGTCTCG-3’，R：5’-CCCGGATCAGCATCTGAGTC-3’

6）Kiwi-mt17：

F：5’-GAGGGTGGGAGTGCAATTGA-3’，R：5’-AGCCGGTACTACTTGCCCTA-3’。

二、准确快速鉴定丰悦和超红猕猴桃品种间杂交子代的方法

本方法在童期就可以开展分子鉴定、节省育种成本。

本方法包括以下步骤：

①基因组DNA提取：利用CTAB法从丰悦和超红及待检测样品树皮中提取基因组DNA；

②PCR扩增：以上一步骤提取的基因组DNA为模板，以权利要求1所述6个分子标记的上下游引物为扩增引物，进行PCR扩增反应，每个PCR反应体系包含1个DNA样本和1对引物；PCR反应体系为40μL，包含DNA模板30～50ng，正/反向引物各0.25μM，2×PCR Mastermix 20.0μL，ddH₂O补足至40μL；PCR反应参数为：94℃预变性5>

③DNA测序：上一步骤的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测应为一条清晰且大小特定的条带，大小参考SEQ ID NO：1-6，以每对引物的上游引物为测序引物，对相应的PCR产物进行Sanger法测序，获得丰悦和超红及待检测样品的6个片段的DNA序列；

④序列分析：将每对引物扩增、测序所得的所有个体的DNA序列以fasta格式存为一个文件，利用ClustaW软件对每个文件中的DNA序列进行线性排列，统计所有多态位点的基因型；

⑤杂交子代的鉴定：根据叶绿体父系遗传和线粒体母系遗传的规律，判别子代是否是丰悦和超红的杂交后代，对于叶绿体分子标记，子代基因型与父本完全相同；对于线粒体分子标记，子代基因型与母本完全相同。

与现有技术相比，本发明具有下列优点和积极效果：

①操作简单、重复性好、稳定性高、不受环境影响；

②节省育种成本。

附图说明

图1为3个叶绿体分子标记和3个线粒体分子标记在丰悦和超红及待检测子代中的基因分型；

所展示的3个子代的叶绿体分子标记基因型与超红相同，线粒体分子标记基因型与丰悦相同，因此，子代被鉴定为以超红为父本、丰悦为母本的杂交子代。

具体实施方式

以下将通过具体实施例结合附图对本发明做进一步的阐述。

实施例中所用材料有：用于杂交育种的亲本丰悦和超红各一个样本，具有育种潜力的杂交子代3个。

1、叶绿体和线粒体分子标记的开发

对丰悦和超红的叶绿体和线粒体基因组序列进行线性比对，鉴定出叶绿体和线粒体基因组变异位点；分别针对3个叶绿体和线粒体基因组变异位点进行引物设计，设计参数和要求如下：（1）上下游引物序列距离变异位点至少100bp；（2）引物序列长度为19～23bp；（3）引物序列GC含量为40%～60%；（4）扩增子长度为600～1000bp；这3对叶绿体分子标记的引物和3对线粒体分子标记的引物见下表：

2、基因组DNA提取

通过CTAB法从丰悦和超红及待检测子代的树皮样本中提取基因组DNA，具体步骤如下：

A、用液氮对新鲜树皮进行研磨，并转移至2ml离心管中；

B、向离心管中加入1ml 60℃预热的洗液，震荡摇匀后，10000rpm离心8min，去上清；

C、向离心管中加入1mL 60℃预热的3×CTAB提取缓冲液，震荡摇匀，60℃水浴60min，期间每隔15min摇晃一次，然后10000rpm离心8min，取上清至新的2ml离心管中；

D、向离心管中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），震荡摇匀10min，12000rpm离心10min，取上清至新的2ml离心管中；

E、向离心管中加入等体积的氯仿-异戊醇（24：1），震荡摇匀10min，12000rpm离心10min，取上清至新的2ml离心管中；

F、向离心管中加入等体积的预冷的异丙醇和1/10体积的3M NaAc，混匀后置于-20℃至少30min；10000rpm 4℃离心10min，弃上清；

G、用预冷的75%乙醇清洗沉淀后干燥DNA（自然风干或37℃风干）；

H、利用50μLTE缓冲液溶解DNA。

3、PCR扩增

分别以丰悦和超红及待检测子代样品的基因组DNA为模板，分别以Kiwi-cp20、Kiwi-cp25、Kiwi-cp26、Kiwi-mt13、Kiwi-mt14、Kiwi-mt17的引物对为扩增引物进行PCR反应。PCR反应体系为40μL，包含DNA模板30～50ng，正/反向引物各0.25μM，2×PCR Mastermix 20.0μL，ddH₂O补足至40μL；PCR反应参数为：94℃预变性5>

4、DNA测序

以每对引物的上游引物为测序引物，对相应的PCR产物进行Sanger法测序，获得丰悦和超红及待检测样品的6个分子标记片段的DNA序列。

5、基因分型

将每个分子标记的所有个体的序列进行线性比对，统计所有变异位点的基因型；如图1所示，叶绿体分子标记引物Kiwi-cp20、Kiwi-cp25和Kiwi-cp26扩增的片段序列中，分别发现有1、5和6个SNP位点；线粒体分子标记引物Kiwi-mt13、Kiwi-mt14和Kiwi-mt17扩增的片段序列中，分别发现有3、2和1个SNP位点。

6、杂交子代鉴定

子代鉴定的理论依据为：叶绿体基因组为父系遗传；线粒体基因组为母系遗传。如图1所示，3个子代个体叶绿体分子标记的基因型全与父本超红相同，符合叶绿体父系遗传的特性；线粒体分子标记的基因型全与母本丰悦相同，符合线粒体母系遗传的特性；因此，所鉴定的3个子代全为以超红为父本、以丰悦为母本的杂交子代。

序列表

<110>中国科学院武汉植物园

<120>一组鉴定丰悦和超红猕猴桃品种间杂交子代的引物

<140>

<141>

<160>18

<210>1

<211>674

<212>DNA

<400>

ACAAGTGTATAATGTCCACTGGAACGTCCGTGGATTTTGTCATCAACTTGATGAATTAATTTCAAGATATAAGGCTTTCCTATTATAACAGGTTGTTCAAAAGGATCCCCTGTTCTTCCATCAAATATTCTACTTTTTCCTGGATACTCGGGTTCAAATACCCACGGATTCGCTGTTTGCTTACTGGCTTCATATAATTCAGAAAACACTAGTTTTCGCGAAGCTTCTTGTTCATATCGCTCATCAAAAGGTGCTATTCGATAATGTCTGGCTAGCAGACTCCCCGCTAACCCGAGTGAACATTCAAATATCTGTCCTACATTCATTCGTGAAGGTACTCCTAATGGGTTGAAGACCATATCGACAGGTCTTCCATCTTGCAAATAGGGCATATCTTGTCTAGGCAAAATTTTTGAAATGATACCTTTATTTCCATGTCTTCCAGCTACTTTATCCCCTACTTTGATTTCACGTTTCTGTAAAATATATACACGAATCGTTTCTGGATTATAATTAGAACCCCCCTTTTTCTGGATCCATCTCACATCAATAACTCGACCCCTACCACCGGTAGGTAATTTTAGGCAAGTTTCCTTTGAAGTAGATACCTGAATGCCAAGTATGGCTCGTAATAATCTCTCTTCCGGAGCATACGACGATTCCTCCACCATCTG；

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<211>638

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<210>4

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<210>5

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<212>DNA

<400>

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<211>20

<212>DNA

<400>

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