基于光镊与表面增强荧光技术相结合的检测体系及构建

摘要

本发明涉及种基于光镊与表面增强荧光技术相结合的检测体系，利用SiO

说明书

技术领域

本发明基于光镊与表面增强荧光技术相结合的检测体系及构建，涉及荧光检测技术，基于光镊技术与表面增强荧光技术相结合的方法，用于表面增强荧光中精准增强特定位置的荧光分子的信号并实现实时分析，提高荧光检测的灵敏度。

背景技术

荧光检测作为一种重要的现代光谱技术，具有灵敏度高、方法多样等优点，被广泛应用于医学诊断和生物技术领域。但是，对于痕量分析或弱荧光分子体系，荧光检测技术的灵敏度比较低，限制了其应用范围，所以，提高荧光检测的灵敏度是荧光技术当前研究的热点。

早在上世纪70年代，K.H.Drexhage发现金属表面增强荧光现象并进行了详细的解释。利用金属纳米结构对电磁场增强效应进行分子荧光的改性研究是近年来国际研究热点之一。目前，众多的研究者已经在金属纳米薄膜、金属纳米颗粒等纳米结构表面实现了荧光增强。依据的基本原理：对金属纳米薄膜，一束激光照射在光滑的金属薄膜表面，金属的自由电子与入射光场相互耦合共振，形成的一种沿表面传输的电磁波，我们称之为表面等离极化激元。这种耦合模式具有两个最明显的特征，即表面局域和近场增强。表面局域是指表面等离极化激元被束缚于金属的表面，以表面等离子体波的形式存在。近场增强是指这种耦合的电磁场强度在金属表面附近会大于原先用来激发产生表面等离极化激元的入射光场强度，当荧光分子处于这种金属表面附近时，荧光信号明显增强；对金属纳米颗粒，由于金属纳米颗粒的尺度很小，入射光作用到金属纳米颗粒上时整个纳米颗粒都将处于光场的作用中。因此在入射光的电场作用下，纳米颗粒内部的电子云将会与原子核发生偏离，由于两者之间具有库仓力，因此电子云将会在外界光场作用下围绕原子核不停的来回振荡，这种振荡就是局域表面等离子体振荡。特别的，当入射光的频率与电子云振荡的频率相同时，将会发生局域表面等离子共振，产生局域表面等离激元。共振发生时，金属纳米颗粒将会大量吸收入射光场的能量并将其限域在其表面附近，从而产生很强的局域场，所以，当荧光分子处于金属纳米颗粒附近时，荧光信号增强。

间隙（gap）结构是近年来应用的很广泛的复合金属结构之一，主要是指金属纳米结构之间存在纳米级的距离, 而这种距离一般用金属氧化物，Si02，PMMA，或者聚电解质等等作为隔离层来实现。在间隙结构中，以金属纳米颗粒和金属薄膜为例，金属纳米颗粒表面产生的局域表面等离极化激元与金属薄膜表面产生的表面等离极化激元发生强烈地耦合效应，使得处于间隙结构里地荧光分子的荧光信号被极大地增强。

最早开始系统地研究金属增强荧光信号的是来自美国的Lakowicz小组，他们将只能发微弱荧光的DNA分子溶液灌入两块表面沉积了银岛膜(粗糖的银颗粒)的平行玻璃构成的容器内，由于表面等离子体的局域场增强作用，当用287nm激发光照射时发现DNA的荧光光强度比没有银岛膜存在时增加了80倍。Brown大学的J.H. Song等人利用局域表面等离极化激元与表面等离极化激元耦合效应，实现了更高的增强效应。他们以CdSe/ZnS量子点与PMMA混合薄膜作为掩模利用电子束刻烛技术得到了圆柱型孔洞阵列，然后沉积Ag，得到了Ag的周期性阵列与薄膜复合结构。经过检测，荧光信号是没有Ag阵列存在时的50倍左右，这就说明荧光信号增强与金属纳米结构的尺寸有着密不可分的关系。但是，使用电子束刻蚀技术，成本比较高，而且每次只能对一块很小的区域进行操作，所以，这个方法在间隙结构里应用有限。我国中科大的明海教授课题组将掺杂 RhB 的PMMA介质放在Ag纳米块和Ag膜之间，利用 局域表面等离极化激元与表面等离极化激元的强耦合使得RhB 的荧光强度得到了521倍增强。 这里，Ag纳米块与Ag的薄膜形成间隙结构，通过不停地制备不同厚度的混合介质层，得到最大的增强效果，操作起来周期比较长。也有研究者用直径70nm左右，长度1-3um的Ag纳米线和光滑的Ag膜组成一个间隙结构，间隙距离在15-70nm，这个间隙由1-2层的PbS纳米晶控制，使用633nm的激光激发，用100倍的物镜聚焦和搜集信号，处于这个间隙的PbS 纳米晶的荧光信号被极大地增强。但是，对于这种间隙结构，想要精准地去激发间隙结构里的荧光分子是比较困难的。

综上，对于间隙结构，通常对样品的处理是比较繁琐的，有时还用到电子束刻蚀技术，成本比较高，周期较长；此外，我们还不能控制金属纳米颗粒和待测分子之间的距离，即不能进行定位，不能精准激发和测定，应用范围很有限。为了克服这些不足，有些研究者就在间隙结构里引入了光镊技术，用来检测拉曼。

光镊又称单光束粒子阱，能对纳米至微米级的粒子进行操纵和捕获，简单来讲，就是用一束高度汇聚的激光形成的三维梯度势阱来俘获、操纵控制微小粒子的技术。但是，对于光镊与表面增强荧光相结合的检测体系，研究的热点为光镊捕获单个的金属纳米颗粒，比如Ag纳米颗粒对特定位置的荧光分子进行增强，由于单个纳米颗粒对荧光信号的增强有限，所以增强效果并不理想。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种基于光镊与表面增强荧光技术相结合的检测体系。

本发明的再一目的在于：提供基于光镊与表面增强荧光技术相结合的检测体系的构建方法。

本发明目的通过下述技术方案实现：一种基于光镊与表面增强荧光技术相结合的检测体系，利用SiO₂@Ag复合微球和Ag膜，其中，同时采用SiO₂@Ag复合微球和Ag纳米薄膜增强荧光分子信号，将SiO₂@Ag复合微球作为手柄，在上面负载金属纳米颗粒，用光镊系统操控SiO₂@Ag复合微球，捕获激光为975nm的远红外激光，荧光部分使用532nm的激发光，主动寻找待测荧光分子，进行特定位置的扫描分析和实现实时监测。

所述的光镊系统购于Thorlabs，为Thorlabs系统。

本发明提供一种基于光镊与表面增强荧光技术相结合的检测体系的构建方法，采用三明治结构，以上、下玻璃片作为上、下基片，从上到下依次是：上基片、Ag纳米薄膜、聚电解质层（PE层）、荧光分子层、下基片，两块基片至少用双面胶粘在一起，中间是SiO₂@Ag复合微球溶液。

进一步的，所述的SiO₂@Ag复合微球溶液是20uL，用双面胶和凡士林封在上下基片间。

在上述方案基础上，所述的上基片上直接负载一层单层Ag纳米薄膜，具体操作是：于烧杯中加入12mL Ag溶胶、6mL环己烷、5mL无水乙醇，接着除去大部分环己烷，用干净的玻片捞起Ag纳米薄膜，晾干得载有Ag纳米薄膜基片。

在上述方案基础上，在所述的Ag纳米薄膜上负载聚电解质层，步骤为：

（1）载有Ag纳米薄膜基片浸入1mol/L NaCl 溶液配制的PDDA（0.003mol/L）溶液中，10min后取出，去离子水冲洗该基片表面数次；

（2）将载有Ag纳米薄膜基片浸入1mol/L NaCl 溶液配制的PSS（0.003mol/L）溶液中，10min后取出，去离子水冲洗该基片表面数；

（3）重复（1）、（2）两次，再重复（1）一次，Ag纳米薄膜表面共吸附了7层聚电解质单层，即依次是PDDA、PSS、PDDA、PSS、PDDA、PSS、PDDA层，共3.5个双层的聚电解质层。

在上述方案基础上，在所述的聚电解质层上负载荧光分子，方法是：将吸附了聚电解质层的Ag纳米薄膜基片浸入2.5*10^-5mpl/L表面带正电荷的阴离子型的Cy3荧光分子（带负电荷）溶液中30min，去离子水冲洗多次，N₂吹干。

本发明与传统的间隙结构相比，因为引入光镊，可以进行定位检测和实时分析；与光镊操控单个金属纳颗粒进行荧光增强相比，在SiO₂@Ag复合微球上负载较多的金属纳米颗粒，在定位检测的同时可以获得更高的增强效果。本发明构建较为简单，可以实时检测特定位置的弱荧光物质的荧光增强信号。

附图说明

图1 本发明基于光镊与表面增强荧光技术相结合的检测体系的构建的三明治结构示意图；

图2为图1的局部放大示意图；

图3荧光检测图；

图中标号说明：

图1和图2中

10——三明治结构；

11、12——上、下玻璃片；

13——Ag纳米薄膜；

14——聚电解质层；

15——荧光分子层；

16——SiO₂@Ag复合微球溶液

图3中

1——无Ag膜处1SiO₂@Ag；

2——Ag膜处无1SiO₂@Ag；

3——Ag膜处1SiO₂@Ag。

具体实施方式

一种基于光镊与表面增强荧光技术相结合的检测体系，利用SiO₂@Ag复合微球和Ag膜，同时采用SiO₂@Ag复合微球和Ag纳米薄膜增强荧光分子信号，将SiO₂@Ag复合微球作为手柄，在上面负载金属纳米颗粒，用光镊系统操控SiO₂@Ag复合微球，捕获激光为975nm的远红外激光，荧光部分使用532nm的激发光，主动寻找待测荧光分子，进行特定位置的扫描分析和实现实时监测。

检测体系中的光镊系统购于Thorlabs，使用的捕获激光为975nm的远红外激光，荧光部分使用532nm的激发光。构建如图1和图2所示：

基于光镊与表面增强荧光技术相结合的检测体系的构建，采用三明治结构，以上、下玻璃片11、12作为上、下基片，从上到下依次是：上基片、Ag纳米薄膜13、聚电解质层14（PE层）、荧光分子层15、下基片，两块基片至少用双面胶粘在一起，中间是SiO₂@Ag复合微球溶液16。

构建按下述步骤：

1）化学还原法制备Ag纳米颗粒：500mL烧杯中，加入0.0600g AgNO3、300mL去离子水、沸腾后加入6mL1%柠檬酸三钠溶液（0.0600g 柠檬酸三钠溶于6mL去离子水中），加热沸腾1h。冷却后，离心水洗3次，得表面带负电荷的Ag纳米颗粒备用。

2）SiO₂微球的烷基化：使用硅烷偶联剂APTMS对SiO₂微球进行烷基化，使其表面带上正电荷，具体操作：4m离心管中，依次加入>2微球备用。

3）SiO₂@Ag复合微球的制备：烷基化后的SiO₂微球表面带正电荷，而制备的Ag纳米颗粒表面带负电荷，设置不同比例的SiO₂:AgNPs，混合后，摇床反应5min（室温、70>

4）玻璃基片的表面清洁：依次在以下液体中超声30min，2% Hellmanex洗液；超纯水；丙酮；超纯水；甲醇；超纯水，去除玻片表面的油脂、松香、蜡等有机物杂质等，N₂吹干后于浓硫酸中浸泡12h，超纯水超声30min，N₂吹干备用。

5）Ag纳米薄膜的制备：50mL烧杯中依次加入12mL Ag溶胶、6mL环己烷、5mL无水乙醇，Ag NPs迅速转移至水溶液和环己烷的界面；除去上层大部分环己烷， 由于界面张力，形成Ag纳米颗粒的单层膜；用干净的玻璃基片捞起液面表面的Ag纳米颗粒形成的单层膜，于通风厨中晾干备用。

6）荧光分子负载于Ag纳米薄膜上：Ag纳米薄膜带负电荷，本发明中使用的荧光分子Cy3是阴离子型的荧光染料，为了把荧光分子固定在Ag纳米薄膜上，先在Ag纳米薄膜上组装聚电解质层，步骤是：

（1）将带负电荷的Ag膜基片浸入与其带正电荷的0.003mol/L PDDA溶液（1mol/L的NaCl溶液配制）中，10min后取出，此时由于静电吸附，Ag膜表面电荷反转为正电荷，去离子水冲洗基片表面数次；

（2）将Ag膜转移到带负电的0.003mol/L PSS溶液（1mol/L的NaCl溶液配制）中，10min后取出，Ag膜表面就会吸附一层聚阴离子电解质 ，使其表面又带上负电荷，去离子水冲洗基片表面数；

（3）重复（1）（2）两次，再重复（1）一次，即最后Ag膜表面吸附的是PDDA层，带正电荷。聚电解质层组装完成后，置于2.5*10^-5mol/L>2吹干备用。

7）制备“三明治”样品结构：利用双面胶将负载了荧光分子的上基片和下基片粘在一起，中间滴加20uL的SiO₂@Ag复合微球溶液，进行定位荧光检测。

检测结果：

如图3所示，1为无Ag膜处1SiO₂@Ag；2为Ag膜处无1SiO₂@Ag；3为Ag膜处1SiO₂@Ag，无Ag膜处1SiO₂@Ag和Ag膜处无1SiO₂@Ag波长对荧光强度影响不大，为近似水平线；本发明Ag膜处1SiO₂@Ag3的波长对荧光强度响应，经计算，本发明基于光镊与表面增强荧光技术相结合的检测体系，荧光增强了41倍。