一种乙型肝炎病毒基因组DNA的5‑乙炔基‑2’脱氧尿嘧啶核苷的标记和检测方法

摘要

本发明公开了一种乙型肝炎病毒基因组DNA的5‑乙炔基‑2’脱氧尿嘧啶核苷的标记和检测方法，具体的包括：(1)扩增NTCP基因，构建NTCP真核表达质粒pcDNA‑NTCP，将pcDNA‑NTCP转入Huh7肝癌细胞中构建NTCP稳定表达的Huh7‑NTCP细胞系；(2)使用EdU处理HepG2.2.15细胞，获取含EdU‑HBV的细胞上清，使用PEG8000处理，浓缩后进行HBV基因组拷贝数定量；(3)将HBV细胞传代培养至细胞汇合度为50‑80％时，使用EdU‑HBV感染Huh7‑NTCP细胞，然后进行EdU‑HBV荧光检测。本发明与现有技术相比，操作简单，图像结果无需进行后期处理，且各染色结果互不干扰。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种乙型肝炎病毒基因组DNA的5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷的标记和检测方法。

背景技术

乙型肝炎病毒简称乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)，是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)。HBV只对人和猩猩有易感性，其慢性感染与肝硬化及肝癌关系密切，是肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)最为重要的诱发因素。血清学证据证实全球人口中有30％曾感染过HBV，其中约2.5亿人是HBV慢性感染者，但迄今HBV致病机制仍未阐明。HBV具有严格的种属特异性，其自然宿主仅限于人和猩猩，且HBV病毒基因组虽仅包含3200bp，但结构有效，复制周期特殊，缺乏良好的动物模型和病毒标记技术严重限制了HBV相关机制研究。

HBV感染依赖于肝细胞表面特异性受体钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)，决定了HBV感染的种属和组织特异性。HBV病毒结合受体NTCP入侵肝细胞后，病毒松散环状基因组DNA(RC-DNA)进入细胞核，经过修复形成共价闭合的环状DNA(cccDNA)，并结合宿主细胞组蛋白、病毒核心蛋白等以微小染色体形式存在。cccDNA转录形成pgRNA和亚基因组RNA，在Pol蛋白作用下，pgRNA在核衣壳内逆转录形成RC-DNA，包裹囊膜形成成熟病毒粒子，而RC-DNA还可转运胞核内再次形成cccDNA。cccDNA是HBV转录的唯一模板和体内病毒储存库，也是HBV持续存在的主要原因。

目前HBV感染及与细胞相互作用的分子机制等诸多方面仍不甚清楚，如HBV结合NTCP受体后，如何进一步侵染宿主细胞，cccDNA如何形成、维持及转录调控等，严重限制了HBV相关肝病的机制研究及针对HBV特异性治疗靶点的开发。建立HBV基因组DNA标记和检测方法，有助于HBV侵染和转录调控的分子机制研究，对探寻抑制和阻断HBV复制的潜在靶点具有重要的意义，然而迄今为止鲜有关于HBV基因组DNA标记和检测方法的报道。

发明内容

基于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种HBV基因组DNA的5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷的标记和检测方法，为HBV侵染过程和cccDNA维持及转录调控的分子机制等研究提供了重要的研究工具。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，公开了了5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷在对HBV基因组DNA进行标记和检测的应用；

本发明的第二方面，公开了一种HBV基因组DNA的5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷的标记和检测方法，所述方法包括如下步骤：

(1)扩增NTCP基因，构建NTCP真核表达质粒pcDNA-NTCP，将pcDNA-NTCP转入Huh7肝癌细胞中构建NTCP稳定表达的Huh7-NTCP细胞系；

(2)使用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)处理HepG2.2.15细胞，获取含EdU-HBV的细胞上清，使用PEG8000处理，离心，弃上清，对沉淀中进行HBV基因组拷贝数定量；

(3)将Huh7-NTCP细胞传代培养至细胞汇合度为50-80％时，使用EdU-HBV感染Huh7-NTCP细胞，然后进行EdU-HBV荧光检测。

在本发明的一个具体实施方案中，步骤(1)包括：

1)扩增NTCP基因，插入载体pcDNA3.0中，构建了NTCP真核表达质粒pcDNA-NTCP；

2)将pcDNA-NTCP转染Huh7细胞，使用遗传霉素G418进行筛选；

3)挑取遗传霉素G418抗性阳性克隆，使用间接免疫荧光试验(IFA)和qRT-PCR检测NTCP表达；

4)选择NTCP高表达克隆，扩大培养；

5)感染HBV，用ELISA检测HBsAg，确定Huh7-NTCP细胞系支持HBV感染性。

优选的，对NTCP基因进行扩增时的选用的扩增引物为：

pC3NTCP-F:CCCAAGCTTGCCACCATGGAGGCCCACAACGCGTCTG；

pC3NTCP-R:CCGCTCGAGCTAGGCTGTGCAAGGGGAGCAG；

优选的，对构建的pcDNA-NTCP质粒进行线性化，进一步优选的，对pcDNA-NTCP质粒进行线性化的所用的线性化酶为PvuI内切酶；

优选的，对NTCP扩增基因和pcDNA3.0进行酶切选用的限制性内切酶为HindIII和XhoI；

优选的，遗传霉素G418的使用浓度为700ug/ml，使用遗传霉素G418进行筛选的时间为4-6周；

优选的，进行qRT-PCR时，选用GAPDH为内参，各引物序列分别为：

hNTCP-qF:GGGACATGAACCTCAGCATT；

hNTCP-qR:CGTTTGGATTTGAGGACGAT；

hGAPDH-qF:GGAGTCCACTGGCGTCTTCAC；

hGAPDH-qR:GAGGCATTGCTGATGATCTTGAGG；

在本发明的一个具体实施方案中，步骤(2)包括：

1)将HepG2.2.15肝癌细胞使用MEM培养基进行传代培养，细胞长满后，更换含10μMEdU和2％胎牛血清FBS的MEM培养基进行培养3d，收集细胞上清；然后再补加含10μM EdU和2％FBS的MEM培养基继续培养并再收集细胞上清一次；

2)对收集的细胞上清进行病毒纯化，去除细胞碎片及杂质，然后向细胞上清中加入PEG8000，冰上缓慢混匀4-6h；离心，弃上清，沉淀重悬后进行HBV基因组拷贝数定量；

优选的，步骤2)中PEG8000的加入量为使PEG8000的终浓度达到5-10％；

优选的，步骤2)中离心条件为3000-5000rpm，4℃离心20min；

优选的，步骤2)中对沉淀中进行HBV基因组拷贝数定量分析的具体方法为：对浓缩的HBV采用PCR-荧光探针法进行HBV基因组拷贝数定量分析；

在本发明的一个具体实施方式中，步骤(3)包括：

1)Huh7-NTCP细胞传代，汇合度50-80％时，用含4％PEG8000和10％FBS的DMEM稀释EdU-HBV后感染Huh7-NTCP细胞；

2)感染2-12h后，弃去上清，用PBS洗3遍后，更换含10％FBS的MEM培养基，继续培养；

3)到预期时间点后，进行EdU-HBV荧光检测。弃去培养基，PBS洗一遍后，用4％多聚甲醛室温固定30min；

4)弃去固定液，加入甘氨酸，室温孵育后，弃去甘氨酸溶液，PBS洗一遍；

5)加入TritonX-100，室温孵育后，弃去打孔液，PBS洗三遍；

6)加入荧光染色反应液，室温避光孵育后，弃去染色液后，PBS洗三遍；

7)用甲醇继续冲洗；

8)用DAPI染色液避光染色；

9)PBS冲洗后，用抗荧光淬灭剂封片和荧光共聚焦显微镜分析；

优选的，步骤4)中甘氨酸的浓度为2mg/ml；

优选的，步骤6)中荧光染色反应液的配置方法为：以1ml染色液配置，所属反应缓冲液50ul，催化缓冲液10ul，荧光染料Alexa Fluor 488azide溶液3ul，缓冲添加剂10mg，ddH₂O938ul。

本发明的第三方面，公开了上述方法在HBV感染动态分析、抗病毒药物筛选、细胞与HBV相互作用、HBV DNA结合蛋白中的应用。

本发明首次利用EdU对HBV的DNA进行标记，EdU(5’-Ethynyl-2’-deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子中，并通过基于点击化学(click chemistry)的方法，与含叠氮基的荧光染料或生物素等分子结合，完成荧光标记或进行DNA介导的免疫沉淀反应。但是迄今尚未有关于使用EdU对HBV进行标记的报道，发明人在研究中发现不同浓度的EdU对HBV的产量和细胞的状态影响较大，进而影响HBV对肝细胞的感染能力，因此选择合适浓度的EdU对结果影响极大，申请人通过优化试验步骤和工艺参数，最终得到了上述乙型肝炎病毒基因组DNA的5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷的标记和检测方法，同时，在制备pcDNA-NTCP质粒后，申请人意外发现，将pcDNA-NTCP质粒进行线性化，可以增加DNA整合效率和阳性细胞克隆的比例，同时考虑到线性化后必须不能影响目的基因表达，经过大量筛选，最终确定选用PvuI内切酶作为对pcDNA-NTCP质粒进行线性化的线性化酶；经过试验验证，本申请制备得到的EdU-HBV具有和亲本病毒相近的感染能力，为进一步探讨HBV感染动态分析、抗病毒药物筛选、细胞与HBV相互作用、寻找HBV DNA结合蛋白奠定了基础。

本发明与现有技术相比，操作简单，同时，在标记过程中，本发明将EdU掺入染色、DAPI复染与HBV相结合，经本发明标记和检测方法得到的图片标记颜色鲜亮，信号强度强，图像结果无需进行后期处理，且各染色结果互不干扰。

附图说明

图1(a)为NTCP基因扩增图，图1(b)为pcDNA-NTCP质粒酶切图；

图2(a)为pcDNA-NTCP质粒进行线性化酶切图(其中，M道为15000bp DNA ladder电泳图，1道为使用PvuI内切酶进行pcDNA-hNTCP线性化电泳图；2道为对照组电泳图)；

图2(b)为pcDNA质粒图谱(含PvuI酶切位点)；

图3为Huh7-NTCP阳性克隆qPCR分析NTCP表达水平图；

图4为Huh7-NTCP细胞克隆IFA鉴定图；

图5为EdU-HBV和HBV感染性比较柱状图；

图6为点击化学反应和荧光检测感染的EdU-HBV图；

图7为EdU-HBV感染不同时间的定位变化图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

实施例1 Huh7-NTCP细胞系的建立

1.扩增NTCP基因，插入载体pcDNA3.0中，构建了NTCP真核表达质粒pcDNA-NTCP，具体的，将扩增后的NTCP基因和载体pcDNA3.0分别进行HindIII、XhoI双酶切反应，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测其产物并使用PvuI内切酶对构建的NTCP-pcDNA质粒进行线性化，以增加DNA整合效率和阳性细胞克隆的比例；利用T4DNA连接酶连接上述线性质粒载体pcDNA3.0及NTCP基因。扩增NTCP基因引物如下所示：

pC3NTCP-F:cccAAGCTTgccaccatggaggcccacaacgcgtctg

pC3NTCP-R:ccgCTCGAGctaggctgtgcaaggggagcag

2.pcDNA-NTCP转染Huh7细胞，700ug/ml G418筛选4-6周

3.挑取G418抗性阳性克隆，IFA和qRT-PCR检测NTCP表达

qRT-PCR所用引物：

hNTCP-qF:GGGACATGAACCTCAGCATT

hNTCP-qR:CGTTTGGATTTGAGGACGAT

hGAPDH-qF:GGAGTCCACTGGCGTCTTCAC

hGAPDH-qR:GAGGCATTGCTGATGATCTTGAGG

4.选择NTCP高表达克隆，扩大培养

5.感染HBV，用ELISA检测HBsAg，确定Huh7-NTCP细胞系支持HBV感染性

实施例2 EdU-HBV的制备

材料：

5-ethynyl-2’-deoxyuridine(EdU)(Sigma)in DMSO

HepG2.2.15cell

HBV基因组DNA定量试剂盒(QiaGen)

PEG8000(Sigma)

步骤:

1. 1x10⁷HepG2.2.15细胞传代于T75培养瓶中

2.培养24h后，更换含10μM EdU和2％FBS的MEM，2d后收集细胞上清，然后再补加含10μM EdU和2％FBS的MEM，2d后再收集细胞上清一次

3.收集的细胞上清，进行病毒纯化：首先用0.45um滤膜(Millipore)进行过滤或12000rpm离心2min，去除细胞碎片等杂质

4.上清转移至另一50ml离心管中，加入终浓度为5-10％PEG8000，冰上缓慢混匀4-6h

5. 3000-5000rpm 4℃离心20min

6.弃上清，沉淀用原培养上清1/10体积的DMEM培养基重悬，小份分装后冻存于-80℃。

7.浓缩的HBV用QIAGEN公司的HBV核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行HBV基因组拷贝数定量，简要步骤：样本处理

1)加入100ul样本前处理液，加入50ul标准品+50ul PBS，振荡混匀定量标准品1-4:3x10^7、2.5x10^5、2.5x10^4、7x10^2(单位：IU/ml)，阳性对照，阴性对照样品做同样处理

2)15000rpm离心10min，吸进上清(勿碰沉淀，富集的病毒粒子)

3)加入25ul裂解液，彻底振荡混匀(3-5min)，100℃金属浴或沸水浴10min(裂解病毒粒子)

4)4℃，15000rpm离心10min

5)配制qPCR mix

6)加样：

22.5ul qPCR mix

2.5ul样本上清

PCR扩增条件：

37℃5min(消除UTP-DNA)；

95℃5min(变活UNG酶)；

95℃15s；

60℃40s；扩增45cycle，60℃采集信号。

实施例3病毒感染

1.Huh7-NTCP细胞传代，汇合度50-80％时，用含4％PEG8000和10％FBS的DMEM稀释EdU-HBV和HBV后感染Huh7-NTCP细胞(100-1000Geq/cell)；

2.感染2-12h后，弃去上清，用PBS洗3遍后，更换2％培养基，预期时间点检测HBsAg分泌和进行EdU-HBV荧光检测。

实施例4 EdU-HBV感染荧光检测

1.EdU-HBV和HBV感染Huh7-NTCP细胞感染6h后，弃去培养基，PBS洗一遍后，用4％多聚甲醛室温固定30min；

2.弃去固定液，加入2mg/ml甘氨酸，室温孵育5min后，弃去甘氨酸溶液，PBS洗一遍，

3.加入0.5％TritonX-100，室温孵育10min后，弃去打孔液，PBS洗3遍；

4.加入荧光染色反应液(1ml染色液配制：反应缓冲液50ul，催化缓冲液10ul，荧光染料Alexa Fluor 488azide溶液3ul，缓冲添加剂10mg，ddH₂O>

5.用甲醇继续洗2遍，每次5min；PBS洗1次；

6.用DAPI染色液避光染色5min；

7.PBS洗3遍后，用抗荧光淬灭剂封片和荧光共聚焦显微镜分析。

实施例5 HBsAg ELISA检测

1.EdU-HBV和HBV感染Huh7-NTCP细胞感染12h后，弃去培养基，PBS洗一遍后，补加培养基继续培养12h后，收集细胞上清；

2.上清用PBS 5x稀释后加入至反应孔，100ul/孔，37℃反应1h；

3.加入50ul HRP酶标记抗体，37℃继续反应30min；

4.PBST洗3-5遍；

5.分别加入50ul显色液A和显色液B；

6. 37℃反应30min后，加入50ul终止液于450nm波长下读取OD值。

本发明乙型肝炎病毒(HBV)基因组DNA的EdU标记方法建立，是HBV标记的一种新的方法。通过实施例5对感染Huh7-NTCP细胞系后的HBsAg检测分析表明本发明得到的EdU-HBV具有和亲本病毒相近的感染能力；荧光分析表明EdU-HBV可以被特异性检测到，感染不同时间检测显示了EdU-HBV病毒早期从胞浆迁移至胞核的变化。