同步检测黄曲霉毒素和甲萘威混合污染的时间分辨荧光免疫层析试剂盒、制备方法及应用

摘要

本发明涉及一种同步检测黄曲霉毒素和甲萘威混合污染的时间分辨荧光免疫层析试剂盒、制备方法及其应用。它包括免疫层析时间分辨荧光试纸条和含有铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、铕标记的甲萘威单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中：所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条的检测线上分别上包被黄曲霉毒素‑牛血清白蛋白偶联物和甲萘威‑卵清白蛋白偶联物；所述的抗甲萘威单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO.C201654的杂交瘤细胞株Jnw1D2分泌产生的。其可用于样品中黄曲霉毒素、甲萘威含量的同步检测，具有操作简单、快速、灵敏度高的特点。

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种同步检测黄曲霉毒素和甲萘威混合污染的时间分辨荧光免疫层析试剂盒、制备方法及其应用。

背景技术

黄曲霉毒素是一类主要的真菌毒素污染物，毒性强、污染广，被世界卫生组织划分为一类致癌物。其毒性表现在对动物致癌、致突变、致畸，可引起DNA损伤和免疫抑制。黄曲霉毒素污染可发生在种植、收获和贮藏、运输、消费等各环节，污染的产品多以谷物、坚果为主，在其他产品如肉、蛋、奶中也均有检出。甲萘威是一种被广泛用于蔬菜、水果、谷物等农作物的一类氨基甲酸酯类农药，对害虫具有较好的防治效果，然而由于其在农业生产上的滥用和违禁使用，使其对人们的饮食安全造成重大威胁，我国规定甲萘威在谷物中限量0.5-1μg/mL，蔬菜中限量为1μg/mL。黄曲霉毒素与甲萘威在谷物中往往会造成同时污染，需要研制一种方便快捷的检测技术对两类污染物进行同时检测。

目前，黄曲霉毒素与甲萘威的检测方法主要有液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法等。这些方法稳定性好、灵敏度高、准确性好，但是前处理步骤复杂，样品检测成本高。免疫层析法克服了上述不足，其以抗原抗体特异性反应为基础，用硝酸纤维素将抗原固定，使层析过程中游离靶标物与检测线上的抗原竞争结合已标记抗体，通过结合在检测线上标记物的量计算样品中靶标物的含量。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种能同步检测黄曲霉毒素、甲萘威混合污染的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒、制备方法及其应用。该时间分辨荧光免疫层析试剂盒可用于样品中黄曲霉毒素、甲萘威含量的同步检测，具有操作简单、快速、灵敏度高的特点。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：

同步检测黄曲霉毒素、甲萘威混合污染的免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于：它包括免疫层析时间分辨荧光试纸条和含有铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、铕标记的甲萘威单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中：所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线位于质控线下方，个数为2条，检测线上分别上包被黄曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物和甲萘威-卵清白蛋白偶联物；所述的抗甲萘威单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO.C201654的杂交瘤细胞株Jnw1D2分泌产生的。该杂交瘤细胞株已于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C201654。

按上述方案，所述铕标记的抗甲萘威单克隆抗体是按照以下方法制备得到的：将甲萘威单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中振摇反应2h以上，离心去上清，封闭得到目标产物；所述铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体是按照以下方法制备得到的：将黄曲霉毒素单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中振摇反应2h以上，离心去上清，封闭得到目标产物

按上述方案，所述的活化方法为取铕标记试剂，用硼酸缓冲液中超声分散，然后加缓慢加入碳二亚胺溶液，振荡活化，离心去上清液，用硼酸缓冲液复溶，备用。所述的活化时间为15-30min。

按上述方案，所述的封闭液为含0.5-1％BSA的硼酸缓冲液。

按上述方案，所述铕标记试剂以有效量计与黄曲霉毒素单克隆抗体的质量比为1:(0.001-0.1)，铕标记试剂以有效量计与甲萘威抗体的质量比为1:(0.001-0.1)。

按上述方案，所述铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体冻干品是将铕标记的单克隆抗体加入抗体保护液中冻干的；

所述铕标记的抗甲萘威单克隆抗体冻干品是将铕标记的抗甲萘威单克隆抗体加入抗体保护液中冻干的；

所述的抗体保护液为0.01％-0.30vt％(体积分数)的吐温-20、0.5-1.5wt％蔗糖和0.1-1wt％牛血清蛋白(BSA)水溶液；

按上述方案，所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中的吸水垫长15-35mm，宽3-5mm；样品垫长12-18mm，宽2-5mm，相邻各垫的交叠长度为1-3mm；所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中检测垫上靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为6-15mm，每相邻两条检测线之间的间距为1.5-4.5mm，靠近质控线的检测线与质控线的间距为4-10mm；所述的样品反应瓶为1-5mL的卡口瓶。

按上述方案，所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物的包被量为0.4～0.8μg，每厘米检测线所需的甲萘威-卵清白蛋白偶联物的包被量为0.8-1.0μg；所述样品反应瓶中铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体冻干品的含量为0.1-0.3μg，所述样品反应瓶中铕标记的抗甲萘威单克隆抗体冻干品的含量为0.2- 0.4μg；

按上述方案，所述的时间分辨荧光试纸条的制备方法如下：

(1)将吸水纸剪裁为吸水垫；

(2)检测垫的制备：

将黄曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物、甲萘威-卵清白蛋白偶联物配制成浓度为0.25-2mg/mL的包被液，用划膜方式将其于硝酸纤维素膜上进行分别间隔包被，得到2条检测线，然后于37-40℃条件下干燥30-60分钟；

将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.1-0.45mg/mL的包被液，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.4～0.8μg，然后于37-40℃条件下干燥30-60分钟；

(3)样品垫的制备：

将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37-40℃条件下干燥4-10小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；

(4)免疫层析时间分辨荧光试纸条的组装：

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，即得免疫层析时间分辨荧光试纸条；

按上述方案，所述免疫层析时间分辨荧光试纸条的制备中配制黄曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物包被液、甲萘威-卵清白蛋白偶联物包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有牛血清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；

配制兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；

所述免疫层析时间分辨荧光试纸条的制备中使用的封闭液为：每100mL中含有卵清白蛋白0.5-2g，蔗糖2g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g；

上述免疫层析时间分辨荧光免疫层析试剂盒在黄曲霉毒素、甲萘威含量检测中的应用：将待测样品经前处理获得待测样品溶液后，加入样品反应瓶中，混匀，插入时间分辨荧光试纸条，37℃反应6分钟后，用时间分辨荧光测试仪进行检测，获得免疫层析时间分辨荧光试纸条上检测线(T)荧光强度与质控线(C)荧光强度的比值；基于预先获得的免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)分别与黄曲霉毒素、甲萘威浓度的关系曲线，获得待测样品溶液中黄曲霉毒素、甲萘威的含量，最后经换算即得待测样品中黄曲霉毒素、甲萘威的含量；

按上述方案，所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)分别与黄曲霉毒素、甲萘威浓度的关系曲线是采用以下方法得到的：

(1)配制得到一系列梯度浓度的黄曲霉毒素标准品溶液；配制得到一系列浓度的甲萘威标准品溶液。

(2)将适量上述各梯度浓度的黄曲霉毒素、甲萘威标准品溶液分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入免疫层析时间分辨荧光试纸条，37℃反应10分钟，用时间分辨荧光免疫分析仪检测得到各免疫层析时间分辨荧光试纸条上检测线(T)和质控线(C)的荧光强度值，由此获得各免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)；

(3)经拟合得到免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)与黄曲霉毒素浓度的关系曲线；经拟合得到免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)与甲萘威浓度的关系曲线；

本发明的有益效果：

(1)快速、同步检测黄曲霉毒素、甲萘威。本发明提供的免疫层析时间分辨荧光试剂盒能在一条试纸条上实现对黄曲霉毒素、甲萘威两种真菌毒素的同步、快速检测，使用的抗体均为单克隆抗体，特异性好、灵敏度高，两者之间无干扰，简单、快速。

(2)灵敏度高。本发明提供的免疫层析时间分辨荧光试剂盒对检测溶液中黄曲霉毒素的最低检测限为0.02ng/mL，对甲萘威的最低检测限为0.01ng/mL，该检测限能满足欧盟对食品中的限量要求。

(3)样品前处理方法简单。样品前处理只需要将甲醇水提取液加入样品中超声提取5-10分钟，然后静置5-10分钟，取上清液稀释即可进行检测，整个样品前处理过程简单、快速。

附图说明

图1为本发明提供的黄曲霉毒素、甲萘威时间分辨荧光免疫层析试纸条的结构示意图。图中：1吸水垫、2检测垫、3样品垫、4质控线、5甲萘威检测线、6黄曲霉毒素检测线。

具体实施方式

实施例1抗甲萘威单克隆抗体的获得

杂交瘤细胞株Jnw1D2的筛选

1.动物免疫

购买6周龄BALB/c小鼠6只，用6-(1-萘氧基甲酰胺)-己酸(CNH)偶联牛血清白蛋白(BSA)，获得甲萘威完全抗原CNH-BSA，免疫小鼠。第一次免疫将甲萘威完全抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于3周后进行，采用弗氏不完全佐剂与等体积的甲萘威完全抗原乳化，于小鼠颈背部皮下多点注射。第三次与第四次免疫分别与上一次免疫间隔两周，免疫方式与第二次相同。四次免疫剂量相同，仅为100μg/只。第三次免疫后第7天，小鼠尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行加强免疫，免疫剂量为之前量的2倍。

2.细胞融合

于加强免疫3天后，采用50％(重量百分数)的聚乙二醇即PEG(分子量为1450)作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下脱颈处死待融合小鼠，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5：1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，1200rpm，离心5min。弃去上清，控干，加入1mL PEG，融合1分钟，缓慢加入RPMI-1640基础培养液，离心，弃上清，沉淀即为融合细胞，用20mL HAT完全培养基重悬，将悬起的细胞加入到80mL半固体培养基中，混匀后加到6孔细胞培养板上，2mL/孔，置于37℃二氧化碳培养箱培养。

所述的含1％HAT的细胞完全培养基含有20％(体积百分数)胎牛血清，75％(体积百分数)RPMI-1640基础培养液，1％(重量百分数)L-谷氨酰胺，1％(体积百分数)HEPES，1％(体积百分数)双抗(10000单位每毫升青霉素和10000微克每毫升链霉素)，2％(体积百分数)生长因子(HFCS)和1％(重量百分数)次黄嘌呤-氨基蝶岭-胸腺嘧啶核苷即HAT和甲基纤维素购于sigma-Aldrich公司。

3.细胞株的筛选及克隆

待细胞融合后2-3周，细胞集落长至肉眼可见时，用微量移液器将克隆从培养基中挑出，转移至96孔细胞培养板采用HAT液体培养，待细胞长至2/3孔底时，吸取培养上清进行检测。采用两步筛选法，第一步采用间接ELISA方法，筛选出抗甲萘威而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用甲萘威作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔(吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50％时的竞争原浓度亦IC50值较小)，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步法进行检测，如此重复亚克隆4-5次后，获得杂交瘤细胞株Jnw1D2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201654。

4.抗甲萘威单克隆抗体杂交瘤细胞株Jnw1D2抗体可变区序列测定。

(1)提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株Jnw1D2的总RNA；

(2)合成cDNA：以步骤1获得的总RNA为模板，oligo(dT)15为引物，按照SuperScript^TM-2II反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo(dT)15由Invitrogen购得；

(3)PCR法克隆可变区基因：根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以cDNA为模板扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为：94℃30s、58℃45s、72℃1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过1％(重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接在载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5’-ACG ACG TTG TAA AAC GAC GGC-3’(21mer)和轻链可变区引物为5’-ACG ACG TTG TAA AAC GAC GGC-3’(21mer)和5’-CAG GGG CCAGTG GAT AGA CAG ATG G-3’(21mer)。

得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长339bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由113个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示。轻链可变区编码基因序列长315bp,序列如SEQ ID NO:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由105个氨基酸组成，序列如SEQ IDNO:4所示。

5.抗甲萘威单克隆抗体的制备纯化、亚型和特性鉴定

将获得的抗甲萘威单克隆抗体杂交瘤细胞株Jnw1D2注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μL，室温混合30-60min，4℃静置2h以上。12000r/min，4℃离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH至7.4，冰浴中缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后12000r/min，4℃离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10体积的摩尔浓度为0.01mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/LPBS透析两天，再改用PB透析两天，将透析袋中蛋白溶液取出，离心，收集上清，弃沉淀，放入-70℃预冻后放入冻干机中冻干。收集冻干粉，即为纯化好的抗甲萘威单克隆抗体；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得。

用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株Jnw1D2分泌的抗甲萘威单克隆抗体的亚型为IgG2b。通过酶联免疫吸附法(ELISA)测得抗体的效价可达1.6×10⁴。对甲萘威的50％抑制浓度IC₅₀为0.668ng/kg，与克百威、涕灭威、灭多威等无交叉反应。

实施例2抗黄曲霉毒素单克隆抗体的获得

抗黄曲霉毒素单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201018的杂交瘤细胞株1C11分泌产生，具体根据授权号为CN201010245095.5的专利中报道的方法预先制得，制备方法为：将获得的杂交瘤细胞株1C11注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗黄曲霉毒素单克隆抗体。其中，纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，过滤后的腹水于4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30-35μL，室温混合30-60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，然后用冷冻真空干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，加水定容到100mL所得；

实施例3同步检测黄曲霉毒素、甲萘威时间分辨荧光试剂盒及其应用

定量检测黄曲霉毒素、甲萘威的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，包括荧光试纸条、含有铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、铕标记的甲萘威单克隆抗体、样品反应瓶，所述的荧光试纸条如图1所示，包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，免疫层析时间分辨荧光试纸条中的吸水垫长18mm，宽4mm；检测垫长25mm，宽4mm；样品垫长15mm，宽4mm，相邻各垫的交叠长度为1mm；所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和2条检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，包被量为0.4μg/cm，质控线所述检测线位于质控线下方，个数为2条，检测线上分别上包被黄曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物和甲萘威-卵清白蛋白偶联物，包被量分别为0.4μg/cm和1μg/cm，包被黄曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为8mm，质控线和包被黄曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物的检测线的间距4mm，两条检测线的间距4mm。

所述荧光试纸条的获得：

(1)吸水垫的制备

将吸水纸剪裁成长18mm，宽4mm的规格，即得吸水垫；

(2)检测垫的制备

检测线的包被：

将甲萘威包被抗原(甲萘威-卵清白蛋白偶联物，用6-(1-萘氧基甲酰胺)-己酸(CNH)偶联卵清白蛋白获得)用包被缓冲液配制成浓度为1mg/mL的包被液；于距硝酸纤维素膜上沿12mm的位置，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需包被抗原的包被量为1.0μg，然后于37℃条件下干燥60分钟；

将黄曲霉毒素包被抗原(黄曲霉毒素-牛血清白蛋白)用包被缓冲液配制成浓度为0.25mg/mL的包被液；于距硝酸纤维素膜上沿8mm的位置，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需包被抗原的包被量为0.4μg，然后于37℃条件下干燥60分钟；

所述的包被缓冲液为：每10mL中含有牛血清白蛋白BSA 0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；

质控线的包被：

将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配成浓度为0.25mg/mL的包被液；于距靠近包被黄曲霉毒素包被抗原的检测线4mm的位置，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.4μg，然后于37℃条件下干燥2小时；

所述的包被缓冲液为：

每10mL中含有牛血清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；

所述的硝酸纤维素膜长25mm，宽4mm。

(3)样品垫的制备：

将玻璃纤维膜剪裁成长15mm，宽4mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；

所述的封闭液为2.9g十二水磷酸氢二钠，0.3g二水合磷酸二氢钠，1.0g Tween-20，1.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVPK-30)，0.25g EDTA，0.5g牛血清白蛋白BSA，0.02g叠氮钠，加水定容至100mL所得；

(4)荧光试纸条的组装：

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，即得荧光试纸条。

所述铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体的获得：

取0.2mol/L pH 8.18的硼酸缓冲液800μL，加入200μL铕标记试剂(粒径100nm，固形物含量1％)，振荡混匀。超声3S。加入40μL 15mg/mL EDC溶液，振荡混匀15min。13000r/min，10℃，离心10min，去上清液，加入1mL硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，超声3S。加入20μg黄曲霉毒素单克隆抗体，混匀，250r/min、25℃下摇床过夜。再次离心去上清，加入1mL含0.5％BSA的硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，超声10min，25℃下摇床2h，得目标产物铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体。上述铕标记试剂可购于上海优你生物科技有限公司，但不限于此。

所述铕标记的抗甲萘威单克隆抗体的获得：

取0.2mol/L pH 8.18的硼酸缓冲液800μL，加入200μL铕标记试剂(粒径100nm，固形物含量1％)，振荡混匀。超声3S。加入40μL 15mg/mL EDC溶液，振荡混匀15min。13000r/min，10℃，离心10min，去上清液，加入1mL硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，超声3S。加入20μg抗甲萘威单克隆抗体，混匀，250r/min、25℃下摇床过夜。再次离心去上清，加入1mL含0.5％BSA的硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，超声10min，25℃下摇床2h，得目标产物铕标记的抗甲萘威单克隆抗体。上述铕标记试剂可购于上海优你生物科技有限公司，但不限于此。

所述样品反应瓶的获得:将上述铕标记抗黄曲霉毒素单克隆抗体以1：300(V:V)的比例，上述铕标记抗甲萘威单克隆抗体以1：250(V:V)的比例加入到一定体积的抗体保护液中用冻干机冻干，取铕标记抗黄曲霉毒素单克隆抗体冻干品0.1μg和铕标记抗甲萘威单克隆抗体冻干品0.3μg放入样品反应瓶中。所述的抗体保护液为0.01vt％的吐温-20、0.5wt％蔗糖和1wt％牛血清蛋白(BSA)。

上述的时间分辨荧光免疫层析试纸条黄曲霉毒素、甲萘威定量检测中的应用：

1.荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与黄曲霉毒素、甲萘威浓度的关系曲线的建立：

(1)对经高效液相色谱法(HPLC)检测为黄曲霉毒素和甲萘威为阴性的谷物进行样品前处理。取谷物样品25g，添加80％甲醇水溶液100mL，均质提取5分钟，静置，过双层滤纸，搜集滤液，以1：4的比例进行稀释。

(2)对上述谷物样品稀释液进行标准品物质加标，制备混合标准品溶液。将黄曲霉毒素/甲萘威以1：10的比例添加配得各黄曲霉毒素和甲萘威浓度梯度的混合标准品溶液。黄曲霉毒素浓度分别为1.5ng/mL、0.5ng/mL、0.15ng/mL、0.05ng/mL、0.015ng/mL、0.005ng/mL的黄曲霉毒素标准品溶液和15ng/mL、5ng/mL、1.5ng/mL、0.5ng/mL、0.15ng/mL、0.05ng/mL；

(3)取黄曲霉毒素与甲萘威混合标准品溶液300μL加入样品瓶，加入到含有铕标记的单克隆抗体的样品反应瓶中，混匀，将荧光试纸条样品垫一端插入反应瓶中，37℃反应10分钟，上机检测。检测仪器为时间分辨荧光免疫分析仪，激发波长365nm，发射波长615nm。检测得到各荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)；

(4)分别以黄曲霉毒素和甲萘威标准品浓度为横坐标，各浓度标准品溶液相应的检测线与质控线荧光强度的比值即T/C值为纵坐标，拟合得到关系曲线。该方法的有效检测范围为甲萘威0.1-1ng/mL；黄曲霉毒素0.02-0.85ng/mL。

2.谷物样品中黄曲霉毒素和甲萘威含量的加标回收实验：

取谷物样品25g，添加80％甲醇水溶液100mL，均质提取5分钟，静置，过双层滤纸，搜集滤液，以1：1的比例进行稀释。向其中分别准确添加黄曲霉毒素(甲萘威)标准品0.1ng/mL、0.5ng/mL和0.8ng/mL，取上述待测样品检测液300μL加入到含有铕标记的单克隆抗体的样品反应瓶中，混匀，将荧光试纸条样品垫一端插入反应瓶中，37℃反应10min，上机检测。检测仪器为时间分辨荧光免疫分析仪，激发波长365nm，发射波长615nm。检测得到各荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)；然后将其代入上述得到的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与标准品物质浓度的关系曲线，得到样品溶液中的黄曲霉毒素与甲萘威物质浓度，然后根据稀释倍数即可求得样品中黄曲霉毒素与甲萘威物质含量。测得谷物样品中的黄曲霉毒素加标回收率依次为：106.5％，90.2％，86.1％；甲萘威加标回收率依次为：104.1％，89.5％，83.7％。

实施例5

定量检测黄曲霉毒素、甲萘威的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，包括荧光试纸条、含有铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、铕标记的甲萘威单克隆抗体、样品反应瓶，所述的荧光试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为2mm，免疫层析时间分辨荧光试纸条中的吸水垫长18mm，宽3mm；检测垫长25mm，宽3mm；样品垫长15mm，宽3mm，相邻各垫的交叠长度为2mm；所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和2条检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，包被量为0.6μg/cm，质控线所述检测线位于质控线下方，个数为2条，检测线上分别上包被黄曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物和甲萘威-卵清白蛋白偶联物，包被量分别为0.6μg/cm和0.6μg/cm，靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为12mm，质控线和第一条检测线的间距3mm，两条检测线的间距3mm。

所述的样品反应瓶中铕标记抗黄曲霉毒素单克隆抗体冻干品0.2μg和铕标记抗甲萘威单克隆抗体冻干品0.2μg放入样品反应瓶中。所述的抗体保护液为0.1vt％(体积分数)的吐温-20、1wt％蔗糖和0.5wt％牛血清蛋白(BSA)水溶液；铕标记抗黄曲霉毒素单克隆抗体制备中铕标记试剂以有效量计与黄曲霉毒素单克隆抗体的质量比为1:0.1，铕标记抗甲萘威单克隆抗体制备中铕标记试剂以有效量计与甲萘威抗体的质量比为1:0.1。

坚果样品中黄曲霉毒素和甲萘威含量的加标回收实验：取坚果样品5g，添加80％甲醇水溶液20mL，均质提取5分钟，静置，过双层滤纸，搜集滤液，以1：1的比例进行稀释。向其中分别准确添加黄曲霉毒素(甲萘威)标准品0.005ng/mL、0.01ng/mL和0.1ng/mL(0.05ng/mL、0.1ng/mL和1ng/mL)，取上述待测样品检测液300μL加入到含有铕标记的单克隆抗体的样品反应瓶中，混匀，将荧光试纸条样品垫一端插入反应瓶中，37℃反应10 min，上机检测。检测仪器为时间分辨荧光免疫分析仪，激发波长365nm，发射波长615nm。检测得到各荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)；然后将其代入上述得到的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与标准品物质浓度的关系曲线，得到样品溶液中的黄曲霉毒素与甲萘威物质浓度，然后根据稀释倍数即可求得样品中黄曲霉毒素与甲萘威物质含量。测得坚果样品中的黄曲霉毒素加标回收率依次为：103.0％，92.0％，85.4％；甲萘威加标回收率依次为：108.5％，91.5％，80.9％。

序列表

＜110＞中国农业科学院油料作物研究所

＜120＞同步检测黄曲霉毒素和甲萘威混合污染的时间分辨荧光免疫层析试剂盒、制备方法及应用

＜160＞4

＜210＞1

＜211＞339bp

＜212＞DNA

＜213＞小鼠

＜400＞ 1

caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag50

cctgtccatc acttgcactg tctctgggct ttcattaacc agctatggtg100

tacactgggt tcgtcaggcc ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta150

atttggggtg gtggaaacac aaattataat tcggctctca tgtccagact200

gagcatcagc aaagacaact ccaggagcca agttttctta agaatgaaca250

gtctgcaaat tgatgacaca gccatgtact attgtgccag aggcaggatg300

gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctcgtca339

＜210＞1

＜211＞315bp

＜212＞DNA

＜213＞小鼠

＜400＞ 2

gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga 50

aagagtcact atcacttgca aggcgagtca ggacattagt agctatttag100

gctggttaca gcagaaacca gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt150

gcaaacacat tggtagaagg ggtcccatcc agattcagtg gcagtggatc200

tggggaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat gaagatatgg250

gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg300

gggaccaagc tggaa315

＜210＞1

＜211＞113

＜212＞PRT

＜213＞小鼠

＜400＞ 3

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile

1 5 101520

Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala

25303540

Pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn

45505560

Ser Ala Leu Met Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Arg Ser Gln Val Phe Leu

65707580

Arg Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Met

81859095100

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

105 110 113

＜210＞1

＜211＞105

＜212＞PRT

＜213＞小鼠

＜400＞ 4

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr

1 5 101520

Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Gly Thr Leu Gln Gln Lys Pro

25303540

Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Thr Leu Val Glu Gly Val Pro Ser

45505560

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Glu Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Thr

65707580

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

859095100

Gly Thr Lys Leu Glu

105