eLtaS蛋白作为预防和治疗胰岛素抵抗相关疾病的药物靶点的应用

摘要

本发明公开了eLtaS蛋白作为预防和治疗胰岛素抵抗相关疾病的药物靶点的应用。实验证明，eLtaS蛋白可抑制胰岛素与膜受体蛋白结合、抑制胰岛素与靶细胞结合、降低胰岛素介导的受体磷酸化、抑制胰岛素介导的细胞信号通路的关键分子的活化、抑制胰岛素介导的糖转运能力、抑制胰岛素介导的糖摄取能力、抑制胰岛素的降糖作用、提高血清中甘油三酯的浓度、提高餐后血糖浓度、降低糖耐量等等。因此，eLtaS蛋白可作为预防和治疗胰岛素抵抗相关疾病的药物靶点，具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及eLtaS蛋白作为预防和治疗胰岛素抵抗相关疾病的药物靶点的应用。

背景技术

胰岛素抵抗(insulin resistanc，IR)是指胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，临床研究发现，约25％的正常人群存在胰岛素抵抗，约75％的糖耐量低减(IGT)人群存在胰岛素抵抗，II型糖尿病患者胰岛素抵抗的发生率为85％左右。胰岛素抵抗是多种病理变化的始动因素，是II型糖尿病、肥胖、高血压、高脂血症、高胆固醇、冠心病、胰岛素抵抗综合征、葡萄糖耐量受损、高胰岛素血症等代谢综合征的共同发病基础，会招致多种器官损害和功能伤害，最后导致动脉硬化、肾病、心脏病变、脑血管病变、高尿酸、痛风、脂代谢紊乱、非酒精性脂肪肝等合并症。对胰岛素抵抗的有效控制有助于包括胰岛素抵抗综合征、II型糖尿病、心脑血管病和代谢综合征等相关疾病的临床防治，但目前针对上述疾病主要采取综合治疗方法，包括饮食控制、运动疗法、使用胰岛素增敏剂降低血糖以及利用药物控制血压和血脂等，由于缺乏消除其根本致病原因——胰岛素抵抗的有效靶点，导致现有治疗方法疗效有限，而且现有药物也存在诸多副作用。

目前研究认为多种因素参与了胰岛素抵抗的发生发展过程，包括遗传因素、肥胖、血浆游离脂肪酸水平增高、炎症因子水平升高等等，但是，目前导致胰岛素抵抗的机制并未明确解析，从而导致拮抗胰岛素抵抗的可选的药物靶点及有效的治疗药物非常有限，缺乏直接拮抗胰岛素抵抗进而从源头防治其所致疾病的有效方法。寻找并确认直接导致胰岛素抵抗的关键分子并进一步拮抗其功能，将为胰岛素抵抗导致的相关疾病的治疗提供新的途径。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何预防胰岛素抵抗相关疾病。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了抑制eLtaS蛋白活性和/或表达量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能可为如下A1)至A14)中的至少一种：A1)预防和/或治疗胰岛素抵抗；A2)预防胰岛素抵抗相关疾病；A3)治疗胰岛素抵抗相关疾病；A4)促进胰岛素与膜受体蛋白结合；A5)促进胰岛素与靶细胞结合；A6)提高胰岛素介导的受体磷酸化；A7)促进胰岛素介导的细胞信号通路；A8)促进胰岛素介导的细胞信号通路的关键分子的活化；A9)促进胰岛素介导的糖转运能力；A10)促进胰岛素介导的糖摄取能力；A11)促进胰岛素的降糖作用；A12)降低血清中甘油三酯的浓度；A13)降低餐后血糖浓度；A14)提高糖耐量。

eLtaS蛋白作为药物靶点在制备产品中的应用也属于本发明的保护范围；所述产品的功能可为如下A1)至A14)中的至少一种：A1)预防和/或治疗胰岛素抵抗；A2)预防胰岛素抵抗相关疾病；A3)治疗胰岛素抵抗相关疾病；A4)促进胰岛素与膜受体蛋白结合；A5)促进胰岛素与靶细胞结合；A6)提高胰岛素介导的受体磷酸化；A7)促进胰岛素介导的细胞信号通路；A8)促进胰岛素介导的细胞信号通路的关键分子的活化；A9)促进胰岛素介导的糖转运能力；A10)促进胰岛素介导的糖摄取能力；A11)促进胰岛素的降糖作用；A12)降低血清中甘油三酯的浓度；A13)降低餐后血糖浓度；A14)提高糖耐量。

上述应用中，所述产品可为药物。

上述应用中，所述A5)中，所述靶细胞可为HepG2细胞或C2C12细胞。

上述应用中，所述A10)中，所述胰岛素可为外源胰岛素或内源胰岛素。

上述应用中，所述A12)中，所述降低血清中甘油三酯的浓度可为降低哺乳动物血清中甘油三酯的浓度。

上述应用中，所述A13)中，所述降低餐后血糖浓度可为降低哺乳动物餐后血糖浓度。

上述应用中，所述A14)中，所述提高糖耐量可为提高哺乳动物糖耐量。

eLtaS蛋白在制备产品中的应用也属于本发明的保护范围；所述产品的功能可为如下C1)至C13)中的至少一种：C1)制备胰岛素抵抗的动物模型；C2)制备胰岛素抵抗相关疾病的动物模型；C3)抑制胰岛素与膜受体蛋白结合；C4)抑制胰岛素与靶细胞结合；C5)降低胰岛素介导的受体磷酸化；C6)抑制胰岛素介导的细胞信号通路；C7)抑制胰岛素介导的细胞信号通路的关键分子的活化；C8)抑制胰岛素介导的糖转运能力；C9)抑制胰岛素介导的糖摄取能力；C10)抑制胰岛素的降糖作用；C11)提高血清中甘油三酯的浓度；C12)提高餐后血糖浓度；C13)降低糖耐量。

上述应用中，所述C1)或所述C2)中，所述动物可为C57BL/6J小鼠。

上述应用中，所述C4)中，所述靶细胞可为HepG2细胞或C2C12细胞。

上述应用中，所述C9)中，所述胰岛素可为外源胰岛素或内源胰岛素。

上述应用中，所述C11)中，所述提高血清中甘油三酯的浓度可为提高哺乳动物血清中甘油三酯的浓度。

上述应用中，所述C12)中，所述提高餐后血糖浓度可为提高哺乳动物餐后血糖浓度。

上述应用中，所述C13)中，所述降低糖耐量可为降低哺乳动物糖耐量。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种产品。

本发明所提供的产品，其含有抑制eLtaS蛋白活性和/或表达量的物质；所述产品的功能可为如下A1)至A14)中的至少一种：A1)预防和/或治疗胰岛素抵抗；A2)预防胰岛素抵抗相关疾病；A3)治疗胰岛素抵抗相关疾病；A4)促进胰岛素与膜受体蛋白结合；A5)促进胰岛素与靶细胞结合；A6)提高胰岛素介导的受体磷酸化；A7)促进胰岛素介导的细胞信号通路；A8)促进胰岛素介导的细胞信号通路的关键分子的活化；A9)促进胰岛素介导的糖转运能力；A10)促进胰岛素介导的糖摄取能力；A11)促进胰岛素的降糖作用；A12)降低血清中甘油三酯的浓度；A13)降低餐后血糖浓度；A14)提高糖耐量。

上述产品中，所述A5)中，所述靶细胞可为HepG2细胞或C2C12细胞。

上述产品中，所述A10)中，所述胰岛素可为外源胰岛素或内源胰岛素。

上述产品中，所述A12)中，所述降低血清中甘油三酯的浓度可为降低哺乳动物血清中甘油三酯的浓度。

上述产品中，所述A13)中，所述降低餐后血糖浓度可为降低哺乳动物餐后血糖浓度。

上述产品中，所述A14)中，所述提高糖耐量可为提高哺乳动物糖耐量。

所述产品可为药物。

上述任一所述eLtaS蛋白可为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2)在a1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

上述任一所述胰岛素抵抗相关疾病可为如下B1)至B16)中的至少一种：B1)胰岛素抵抗综合征；B2)代谢综合征；B3)肥胖；B4)高血糖；B5)糖尿病；B6)冠心病；B7)高血压；B8)高血脂；B9)高胆固醇；B10)脂代谢紊乱；B11)心脑血管疾病；B12)高胰岛素血症；B13)高尿酸；B14)葡萄糖耐量受损；B15)非酒精性脂肪肝；B16)痛风。

上述任一所述哺乳动物可为鼠或人。所述鼠具体可为C57BL/6J小鼠。

实验证明，eLtaS蛋白可抑制胰岛素与膜受体蛋白结合、抑制胰岛素与靶细胞结合、降低胰岛素介导的受体磷酸化、抑制胰岛素介导的细胞信号通路的关键分子的活化、抑制胰岛素介导的糖转运能力、抑制胰岛素介导的糖摄取能力、抑制胰岛素的降糖作用、提高血清中甘油三酯的浓度、提高餐后血糖浓度、降低糖耐量等等。因此，eLtaS蛋白可作为预防和治疗胰岛素抵抗相关疾病的药物靶点，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例2步骤一的实验结果。

图2为实施例3步骤一的实验结果。

图3为实施例3步骤二的实验结果。

图4为实施例4步骤一的实验结果。

图5为实施例4步骤二的实验结果。

图6为实施例5的实验结果。

图7为实施例6的实验结果。

图8为实施例7的实验结果。

图9为实施例8的实验结果。

图10为实施例9步骤二中1的实验结果。

图11为实施例9步骤二中2的实验结果。

图12为实施例9步骤二中3的实验结果。

图13为实施例9步骤二中4的实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

胰岛素、完全免疫佐剂和不完全免疫佐剂均为Sigma-Aldrich公司的产品，产品目录号依次为I2767、F5881和F5506。2-NDBG为Thermo Fisher公司的产品，产品目录号为N13195。protein A树脂、TMB显色液、PCR产物回收试剂盒、限制性内切酶EcoRI、限制性内切酶XhoI和ProteinIso Ni-NTA Resin均为北京全式金生物技术有限公司的产品，产品目录号依次为DP301-01、HE101-01、EP101-01、JE201-01、X201-01和DP101-01。C2C12细胞为北京协和细胞资源中心的产品，产品目录号为3111C0001CCC000099。表面等离子共振传感器和CM5传感芯片均为GE Healthcare公司的产品，产品目录号分别为Biacore T200和29104988。C57BL/6J小鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司产品，产品目录号为213。

制备兔抗eLtaS抗体的步骤具体如下：(1)取1mg实施例1纯化获得的eLtaS蛋白，加入1mL pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液进行溶解，再加入1mL完全免疫佐剂，进行混合，得到混合液1；取0.5mg实施例1纯化获得的eLtaS蛋白，加入1mL pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液进行溶解，再加入1mL不完全免疫佐剂，进行混合，得到混合液2；(2)取健康的大耳白兔，背部皮下多点注射混合液1；(3)取完成步骤(2)三周后的大耳白兔，背部皮下多点注射混合液2；(4)取完成步骤(3)两周后的大耳白兔，背部皮下多点注射混合液2；(5)取完成步骤(4)一周后的大耳白兔，利用动脉插管收取大耳白兔血液并分离血清，然后利用protein A树脂纯化，获得兔抗eLtaS抗体。

封闭液：含5％(5mg/100mL)BSA的pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液。

洗涤液：含0.5‰(0.5mg/1000mL)吐温-20的pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液。

Hfq蛋白和载体pET-28(a)均记载于如下文献中：刘玉，吴娜，高亚萍等.金黄色葡萄球菌Hfq蛋白体外聚体生成和生物学功能的研究[J].军事医学,2009,33(1):24-28.

金黄色葡萄球菌8325-4记载于如下文献中：Liu Y et al.Hfq is a global regulator that controls the pathogenicity of Staphylococcus aureus.PLoS One.2010Sep 29；5(9).

HepG2细胞记载于如下文献中：Liu Y et al.VCP/p97，down-regulated by microRNA-129-5p，could regulate the progression of hepatocellular carcinoma.PLoS One.2012；7(4)：e35800.

实施例1、eLtaS蛋白的表达和纯化

一、重组质粒pET-eLtaS的构建

1、根据生物信息网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上公布的金黄色葡萄球菌NCTC8325的全基因组的核苷酸序列(GI号为87201381)，设计并合成引物F：5’-CCGGAATTCTCTGAAGATGACTTAACAAA-3’(下划线为限制性内切酶EcoRI的酶切识别序列)和引物R：5’-CCGCTCGAGTTATTTTTTAGAGTTTGCTT-3’(下划线为限制性内切酶XhoI的酶切识别序列)。

2、提取金黄色葡萄球菌8325-4的基因组DNA并以其为模板，采用步骤1合成的引物F和引物R进行PCR扩增(反应程序：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环)，然后利用PCR产物回收试剂盒回收约1300bp的PCR扩增产物。

3、取步骤2回收的PCR扩增产物，用限制性内切酶EcoRI和限制性内切酶XhoI酶切，回收约1300bp的DNA片段。

4、用限制性内切酶EcoRI和限制性内切酶XhoI酶切载体pET-28(a)，回收5335bp的载体骨架。

5、将DNA片段和载体骨架连接，得到重组质粒pET-eLtaS。

根据测序结果，对重组质粒pET-eLtaS进行结构描述如下：将载体pET-28(a)的限制性内切酶EcoRI和XhoI识别序列间的小片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子。重组质粒pET-eLtaS表达序列表中序列2所示的蛋白质(以下简称为eLtaS蛋白)。

二、eLtaS蛋白的表达和纯化

1、将重组质粒pET-eLtaS导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌，命名为BL21(DE3)-pET-eLtaS。

2、将BL21(DE3)-pET-eLtaS单菌落接种于含100mg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃、200rpm振荡培养，得到0D₆₀₀为0.6的培养菌液1。向培养菌液1中加入IPTG，得到培养菌液2(培养菌液2中，IPTG的浓度为0.1mM)；然后37℃、200rpm振荡培养6h，得到培养菌液3。

3、取培养菌液3，5000rpm离心10min，收集菌体。

4、取步骤3收集的菌体，用10mL pH7.2、0.01M的PBS缓冲液重悬，得到菌悬液；然后对该菌悬液进行超声处理。

超声参数：超声频率30％；超声10s，停5s，超声总时间为30min。

5、取完成步骤4的体系，12000rpm离心10min，收集上清液。

6、将步骤5收集的上清液和ProteinIso Ni-NTA Resin混合并孵育10min，然后弃上清，用含20mM咪唑的pH7.2、0.01M的PBS缓冲液洗涤3次。

7、完成步骤6后，用含500mM咪唑的pH7.2、0.01M的PBS缓冲液进行洗脱，收集过柱后溶液，即为eLtaS蛋白。

实施例2、eLtaS蛋白和胰岛素的特异性结合和亲和力测定

一、eLtaS蛋白和胰岛素特异性结合

1、取酶标板，用胰岛素作为包被原进行包被(用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释胰岛素，设置包被浓度为10μg/mL，每孔加入100μL)。

2、完成步骤1后，向酶标板每孔加入200μL封闭液，用封口膜封好酶标板，37℃封闭90min，然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤5次，每次加入300μL洗涤液，每次洗涤3min)，拍干。

3、完成步骤2后，每孔加入100μL不同浓度的eLtaS蛋白溶液(由pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释eLtaS蛋白得到的，浓度为0M、5.0×10^-6M、1.0×10^-5M或1.5×10^-5M)，用封口膜封好酶标板，37℃孵育60min；然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤5次，每次加入300μL洗涤液，每次洗涤3min)，拍干。

4、完成步骤3后，每孔加入100μL浓度为1μg/mL的兔抗eLtaS抗体溶液，用封口膜封好酶标板，37℃继续孵育60min；然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤5次，每次加入300μL洗涤液，每次洗涤3min)，拍干。

兔抗eLtaS抗体溶液由pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释兔抗eLtaS抗体得到的。

5、完成步骤4后，每孔加入100μL HRP标记羊抗兔的稀释液，用封口膜封好酶标板，37℃继续孵育30min；然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤5次，每次加入300μL洗涤液，每次洗涤3min)，拍干；最后加入100μL TMB显色液，5min后，测量在450nm处的吸光值。

HRP标记羊抗兔的稀释液为用封闭液稀释HRP标记羊抗兔至40000倍体积得到的。HRP标记羊抗兔为Jackson公司的产品，产品目录号为111-035-046。

实验结果见图1。结果表明，eLtaS蛋白和胰岛素能够特异性结合。

二、eLtaS蛋白和胰岛素的亲和力测定

采用表面等离子共振传感器测定eLtaS蛋白和胰岛素的亲和力。具体步骤如下：

1、由GE Healthcare公司将胰岛素键合到表面等离子共振传感器的CM5传感芯片上，得到键合胰岛素的芯片。

2、用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释eLtaS蛋白，得到浓度为1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM或31.25nM的eLtaS蛋白溶液。

3、完成步骤1和步骤2后，将不同浓度的eLtaS蛋白溶液依次(浓度由小到大)以恒定的流速流过键合胰岛素的芯片的表面。通过表面等离子共振传感器自带的软件，得到eLtaS蛋白和胰岛素的解离常数。

实验结果见表1。结果表明，eLtaS蛋白和胰岛素的亲和力为3.884×10^-8M。

表1

目标蛋白分析蛋白k_on(M^-1S^-1)K_dis(S^-1)K_D(M)胰岛素eLtaS蛋白9.469×10⁴3.649×10^-33.884×10^-8

实施例3、eLtaS蛋白抑制胰岛素与膜受体蛋白结合

一、竞争ELISA方法

1、取酶标板，用胰岛素作为包被原进行包被(用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释胰岛素，设置包被浓度为10μg/mL，每孔加入100μL)。

2、完成步骤1后，向酶标板每孔加入200μL封闭液，用封口膜封好酶标板，37℃封闭90min，然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤5次，每次加入300μL洗涤液，每次洗涤3min)，拍干。

3、完成步骤2后，每孔加入100μL浓度为10μg/mL的膜受体蛋白溶液和100μL不同浓度的eLtaS蛋白溶液(由pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释eLtaS蛋白得到的，浓度为0μg/mL、0.1μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/mL、3.0μg/mL或5.0μg/mL)，用封口膜封好酶标板，37℃孵育60min；然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤5次，每次加入300μL洗涤液，每次洗涤3min)，拍干。

膜受体蛋白溶液由pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释膜受体蛋白得到的。膜受体蛋白为北京义翘神州生物技术有限公司的产品，产品目录号为11081-H08H-50。

4、完成步骤3后，每孔加入100μL浓度为1μg/mL的鼠抗膜受体蛋白抗体溶液，用封口膜封好酶标板，37℃继续孵育60min；然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤5次，每次加入300μL洗涤液，每次洗涤3min)，拍干。

鼠抗膜受体蛋白抗体溶液由封闭液稀释鼠抗膜受体蛋白抗体得到的。鼠抗膜受体蛋白抗体为Cell Signaling Technology公司的产品，产品目录号为3020S。

5、完成步骤4后，每孔加入100μL HRP标记羊抗鼠的稀释液，用封口膜封好酶标板，37℃继续孵育30min；然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤5次，每次加入300μL洗涤液，每次洗涤3min)，拍干；最后加入100μL TMB显色液，5min后，测量在450nm处的吸光值。

HRP标记羊抗鼠的稀释液为用封闭液稀释HRP标记羊抗鼠至40000倍体积得到的。HRP标记羊抗鼠为Jackson公司的产品，产品目录号为115-005-174。

实验结果见图2。结果表明，eLtaS蛋白能够抑制胰岛素与膜受体蛋白结合。

二、流式细胞术

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

1、用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释eLtaS蛋白，分别得到浓度为1000nM的eLtaS蛋白溶液甲、浓度为100nM的eLtaS蛋白溶液乙、浓度为10nM的eLtaS蛋白溶液丙和浓度为1nM的eLtaS蛋白溶液丁。

2、取100μL浓度为1.0×10⁶/mL的HepG2细胞悬浮液或浓度为1.0×10⁶/mL的C2C12细胞悬浮液，加入1μL>

FITC标记的胰岛素是按照FITC标记试剂盒的说明书记载的方法，对胰岛素进行标记获得的。FITC标记试剂盒为Thermo Fisher公司的产品，产品目录号为F10240。

3、完成步骤2后，离心，收集细胞。

4、取所述细胞，用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液充分洗涤，然后用流式细胞仪检测胰岛素的水平。

实验结果见图3(纵坐标为细胞FITC荧光强度，各个曲线表示的是不同浓度的eLtaS蛋白加入后细胞荧光强度的变化)。结果表明，eLtaS蛋白能够抑制胰岛素与HepG2细胞或C2C12细胞结合。

实施例4、eLtaS蛋白抑制胰岛素介导的细胞信号通路的活化

一、eLtaS蛋白降低胰岛素介导的受体磷酸化

1、用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释eLtaS蛋白，得到浓度为400nM的eLtaS蛋白溶液a、浓度为2000nM的eLtaS蛋白溶液b和浓度为10000nM的eLtaS蛋白溶液c。

2、用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释胰岛素，得到浓度为1000nM的胰岛素溶液。

3、取24孔板，先加入400μL浓度为1.0×10⁶/mL的HepG2细胞悬浮液或浓度为1.0×10⁶/mL的C2C12细胞悬浮液，再加入50μL胰岛素溶液和50μL>

4、取完成步骤3的体系，离心，收集细胞。

5、取步骤4收集的细胞，裂解，得到裂解液。

6、取步骤5得到的裂解液，以IRβ抗体，以HRP标记羊抗鼠为二抗，进行western blot。

7、取步骤5得到的裂解液，以pIRβ抗体为一抗，以HRP标记羊抗兔为二抗，进行western blot。

按照上述步骤3-7的方法，将“胰岛素溶液”替换为水，将“eLtaS蛋白溶液”替换为水，其它步骤均不变，作为空白对照。

按照上述步骤3-7的方法，将“eLtaS蛋白溶液”替换为水，其它步骤均不变，作为阴性对照。

IRβ抗体和pIRβ抗体均为Cell Signaling Technology公司的产品，产品目录号分别为3020S和3026S。

实验结果见图4(eLtaS为eLtaS蛋白)。结果表明，eLtaS蛋白降低胰岛素介导的受体磷酸化。

二、eLtaS蛋白抑制胰岛素介导的细胞信号通路的关键分子的活化

1、用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释eLtaS蛋白，得到浓度为10000nM的eLtaS蛋白溶液。

2、用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释胰岛素，得到浓度为1000nM的胰岛素溶液。

3、取24孔板，先加入400μL浓度为1.0×10⁶/mL的HepG2细胞悬浮液或浓度为1.0×10⁶/mL的C2C12细胞悬浮液，再加入50μL胰岛素溶液和50μL>

4、取完成步骤3的体系，离心，收集细胞。

5、取步骤4收集的细胞，裂解，得到裂解液。

6、取步骤5得到的裂解液，以IRS-1抗体、pIRS-1抗体、AkT抗体、pAkT抗体、GSK-3β抗体、pGSK-3β抗体、ErK抗体或pErK抗体为一抗，以HRP标记的羊抗兔为二抗，进行western blot。

按照上述步骤3-6的方法，将“胰岛素溶液”替换为水，将“eLtaS蛋白溶液”替换为水，其它步骤均不变，作为空白对照。

按照上述步骤3-6的方法，将“eLtaS蛋白溶液”替换为水，其它步骤均不变，作为阴性对照。

IRS-1抗体、pIRS-1抗体、AkT抗体、pAkT抗体、GSK-3β抗体、pGSK-3β抗体、ErK抗体和pErK抗体均为Cell Signaling Technology公司的产品，产品目录号依次为2390S、2386S、4685S、4060S、9315S、9322S、9102S和4370S。

实验结果见图5(eLtaS为eLtaS蛋白，为空白对照，为阴性对照)。结果表明，eLtaS蛋白抑制胰岛素介导的细胞信号通路的关键分子(如IRS-1，AkT，GSK3β，ErK)的活化。因此，eLtaS蛋白抑制胰岛素介导的细胞信号通路的关键分子的活化。

实施例5、eLtaS蛋白抑制胰岛素介导的糖转运

1、取激光共聚焦培养皿，加入DMEM培养基和C2C12细胞，得到培养体系甲；培养体系甲中，C2C12细胞的浓度为1.0×10⁵/mL。

2、完成步骤1后，取所述培养体系甲，待C2C12细胞贴壁后，37℃培养4h。

3、向完成步骤2的体系中加入2-NDBG、胰岛素和eLtaS蛋白，得到培养体系乙；培养体系乙中，2-NDBG的浓度为100μM，胰岛素的浓度为100nM，eLtaS蛋白的浓度为40nM或200nM；将培养体系乙在37℃的条件下培养15min。

4、取完成步骤3的体系，先用胰酶消化，然后收集细胞。

5、取步骤4收集的细胞，先用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液洗涤3次，再用4％(4g/100mL)多聚甲醛水溶液固定，最后使用激光共聚焦显微镜检测2-NBDG摄入水平。

按照上述步骤，将步骤3替换为步骤c，其它步骤均不变，作为阴性对照。步骤c为：向完成步骤2的体系中加入2-NDBG和胰岛素，得到培养体系丙；培养体系丙中，2-NDBG的浓度为100μM，胰岛素的浓度为100nM；将培养体系丙在37℃的条件下培养15min。

按照上述步骤，将步骤3替换为步骤d，其它步骤均不变，作为空白对照。步骤d为：向完成步骤2的体系中加入2-NDBG，得到培养体系丁；培养体系丁中，2-NDBG的浓度为100μM；将培养体系丁在37℃的条件下培养15min。

实验结果见图6(eLtaS为eLtaS蛋白，从左至右依次为空白对照、阴性对照、eLtaS蛋白的浓度为40nM和eLtaS蛋白的浓度为200nM)。结果表明，eLtaS蛋白能够有效抑制C2C12细胞中胰岛素介导的糖转运。

实施例6、eLtaS抑制胰岛素介导的糖摄取

1、取6孔板，加入DMEM培养基和HepG2细胞，得到培养体系；该培养体系中，HepG2细胞的浓度为1.0×10⁵/mL。

2、完成步骤1后，取所述培养体系，待HepG2细胞贴壁后，37℃培养4h。

3、向完成步骤2的体系中加入2-NDBG、胰岛素和eLtaS蛋白，得到培养体系；该培养体系中，2-NDBG的浓度为100μM，胰岛素的浓度为100nM，eLtaS蛋白的浓度为40nM或200nM；将培养体系乙在37℃的条件下培养15min。

4、取完成步骤3的体系，先用胰酶消化，然后收集细胞。

5、取步骤4收集的细胞，先用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液洗涤3次，再用胰酶消化并收集细胞，再用4％(4g/100mL)多聚甲醛水溶液固定，最后使用流式细胞仪检测2-NBDG摄入水平。

实验结果见图7(纵坐标为细胞NBDG荧光强度，eLtaS为eLtaS蛋白)。结果表明，eLtaS能够有效抑制HepG2细胞中胰岛素介导的糖摄取。

实施例7、胰岛素耐量实验

1、将20只8周龄体重为18～22g的健康C57BL/6J小鼠随机分成eLtaS组和对照组(每组10只)，禁食6h。

2、完成步骤1后，测量血糖浓度(即第0min的血糖浓度)，进一步得到eLtaS组第0min的血糖浓度和对照组第0min的血糖浓度。

3、完成步骤1后，分别进行如下处理：

eLtaS组：腹腔注射胰岛素(注射剂量为0.5U/kg)和eLtaS蛋白(注射剂量为100μg eLtaS蛋白/只)；

对照组：腹腔注射胰岛素(注射剂量为0.5U/kg)和Hfq蛋白(注射剂量为100μg Hfq蛋白/只)。

4、检测完成步骤3后第10min、第20min、第30min或第60min的血糖浓度，进一步得到eLtaS组注射胰岛素不同时间的血糖浓度和对照组注射胰岛素不同时间的血糖浓度。

实验结果见图8。结果表明，eLtaS蛋白能够明显抑制外源胰岛素的降糖作用。

实施例8、葡萄糖耐量实验

1、将20只8周龄体重为18～22g的健康C57BL/6J小鼠随机分成eLtaS组和对照组(每组10只)，禁食6h后，分别进行如下处理：

eLtaS组：腹腔注射eLtaS蛋白(注射剂量为100μg eLtaS蛋白/只)；

对照组：腹腔注射Hfq蛋白(注射剂量为100μg Hfq蛋白/只)。

2、完成步骤1后第120min，测量血糖浓度(即第0min的血糖浓度)，进一步得到eLtaS组第0min的血糖浓度和对照组第0min的血糖浓度。

3、完成步骤1后第120min，对eLtaS组的健康C57BL/6J小鼠和对照组的健康C57BL/6J小鼠分别腹腔注射葡萄糖(注射剂量为25g/kg)

4、检测完成步骤3后第5min、第10min、第15min、第20min、第30min、第45min或第60min的血糖浓度，进一步得到eLtaS组注射葡萄糖不同时间的血糖浓度和对照组注射葡萄糖不同时间的血糖浓度。

实验结果见图9。结果表明，eLtaS蛋白抑制内源胰岛素的降糖作用。

实施例9、转eLtaS基因小鼠的获得及代谢观察

一、eltaS^转基因小鼠的获得

本发明的发明人委托赛业生物科技有限公司将分泌性细胞因子IL-2的信号肽与eLtaS蛋白的编码基因(即eLtaS基因)融合，获得重组质粒；该重组质粒的启动子为CMV启动子；然后将该重组质粒显微注射入受精卵(父亲和母亲均为C57BL/6J小鼠)，得到eLtaS转基因小鼠。经过鉴定，与C57BL/6J小鼠相比，eLtaS转基因小鼠中eLtaS蛋白的表达量显著增加。

将eLtaS转基因小鼠繁殖到F4代，得到F4代eLtaS转基因小鼠。经过鉴定，与C57BL/6J小鼠相比，F4代eLtaS转基因小鼠中eLtaS蛋白的表达量显著增加。

将F4代eLtaS转基因小鼠命名为eltaS^转基因小鼠，进行下述步骤二的实验。

二、eltaS^转基因小鼠的代谢观察

1、多饮多食

取4只8周龄的健康C57BL/6J小鼠和4只8周龄的健康eltaS^转基因小鼠，置于相同培养条件下继续培养四周。培养过程中，每周测定每只小鼠的饮水量和进食量。

实验结果见图10(左图为小鼠的平均每日饮水量；右图为小鼠的平均每日进食量；其中野生型为C57BL/6J小鼠，eltaS^转基因为eltaS^转基因小鼠)。结果表明，与C57BL/6J小鼠相比，eltaS^转基因小鼠出现多饮多食表型。

2、血清中甘油三酯的浓度升高

取6只8周龄的健康C57BL/6J小鼠和10只8周龄的健康eltaS^转基因小鼠的血清，利用甘油三酯ELISA检测试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司的产品，产品目录号为E1003)测定血清中甘油三酯的浓度。

实验结果见图11(野生型为C57BL/6J小鼠，eltaS^转基因为eltaS^转基因小鼠)。结果表明，与C57BL/6J小鼠相比，eltaS^转基因小鼠血清中甘油三酯的浓度显著升高。

3、餐后血糖水平显著升高

(1)取5只8周龄的健康C57BL/6J小鼠和5只8周龄的健康eltaS^转基因小鼠，禁食6h后，测量血糖浓度(即第0min的血糖浓度)。

(2)完成步骤(1)后，自由进食1h，测量血糖浓度(即第60min的血糖浓度)。

实验结果见图12(左图为C57BL/6J小鼠，右图为eltaS^转基因小鼠)。结果表明，与C57BL/6J小鼠相比，eltaS^转基因小鼠餐后血糖浓度显著升高。

4、糖耐量显著降低

(1)将20只8周龄的健康C57BL/6J小鼠作为野生型组。将20只8周龄的健康eltaS^转基因小鼠作为eltaS^转基因组。野生型组和eltaS^转基因组禁食6h后，测量血糖浓度(即第0min的血糖浓度)，进一步得到野生型组第0min的血糖浓度和eltaS^转基因组第0min的血糖浓度。

(2)完成步骤(1)后，对各个小鼠分别腹腔注射葡萄糖(注射剂量为25g/kg)。

(3)检测完成步骤(2)后第5min、第10min、第15min、第30min、第45min、第60min、第90min或第120min的血糖浓度，进一步得到野生型组注射葡萄糖不同时间的血糖浓度和eltaS^转基因组注射葡萄糖不同时间的血糖浓度。

实验结果见图13(野生型为野生型组，eltaS^转基因为eltaS^转基因组)。结果表明，与C57BL/6J小鼠相比，eltaS^转基因小鼠的糖耐量显著降低。

<110> 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所

<120> eLtaS蛋白作为预防和治疗胰岛素抵抗相关疾病的药物靶点的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1290

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus

<400> 1

tctgaagatg acttaacaaa agtattaaat tatacgaaac aacgtcaaac agagcctaac 60

ccagaatatt atggggtggc aaagaagaaa aatattatta agattcattt agaaagtttc 120

caaaccttct taattaataa aaaggttaat ggtaaagaag taacaccgtt tttaaacaaa 180

ttatcaagtg ggaaagagca attcacatac ttccctaact ttttccatca aacaggtcaa 240

ggtaaaacat ctgactctga atttacaatg gataacagtt tatacggttt accgcaaggt 300

tctgcctttt cattaaaagg agataatacg tatcagtcat taccagcaat tttagatcaa 360

aagcaaggct acaaatctga tgtcatgcac ggtgactata aaacattctg gaacagagac 420

caagtatata aacactttgg tatcgataaa ttctatgatg caacatacta tgacatgtca 480

gataaaaacg ttgtaaactt aggcttgaaa gacaaaattt tctttaaaga ttctgctaat 540

tatcaagcta agatgaaatc accattctat tctcatttaa ttacattgac taaccactat 600

ccattcacat tagatgaaaa ggatgcaact attgagaaat caaacacagg tgatgcaaca 660

gttgatggtt atattcaaac agcacgttat ttagacgaag cattagaaga atatattaat 720

gacttgaaga aaaaaggatt atatgacaat tcagtgatta tgatttatgg tgaccactat 780

ggtatctctg aaaaccataa caatgccatg gaaaaactat taggtgaaaa aatcacaccg 840

gctaaattta cagatttaaa cagaactggt ttctggatta aaatccctgg taaatctggt 900

ggtatcaata atgaatatgc tggtcaagtc gatgtaatgc caacaatttt acatttggct 960

ggtatagata cgaagaacta tttaatgttc ggtactgatt tattctctaa aggtcataat 1020

caagtagttc cattcagaaa tggtgacttt ataacaaaag attataaata tgttaatggt 1080

aagatttatt ctaataaaaa taatgaactc ataactactc aaccagctga tttcgaaaag 1140

aataaaaagc aagttgaaaa ggatctcgaa atgagtgaca acgtgcttaa tggtgatttg 1200

tttagattct acaaaaatcc agacttcaaa aaggtaaatc cttcgaagta taaatatgaa 1260

acaggaccta aagcaaactc taaaaaataa 1290

<210> 2

<211> 429

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus

<400> 2

Ser Glu Asp Asp Leu Thr Lys Val Leu Asn Tyr Thr Lys Gln Arg Gln

1 5 1015

Thr Glu Pro Asn Pro Glu Tyr Tyr Gly Val Ala Lys Lys Lys Asn Ile

202530

Ile Lys Ile His Leu Glu Ser Phe Gln Thr Phe Leu Ile Asn Lys Lys

354045

Val Asn Gly Lys Glu Val Thr Pro Phe Leu Asn Lys Leu Ser Ser Gly

505560

Lys Glu Gln Phe Thr Tyr Phe Pro Asn Phe Phe His Gln Thr Gly Gln

65707580

Gly Lys Thr Ser Asp Ser Glu Phe Thr Met Asp Asn Ser Leu Tyr Gly

859095

Leu Pro Gln Gly Ser Ala Phe Ser Leu Lys Gly Asp Asn Thr Tyr Gln

100 105 110

Ser Leu Pro Ala Ile Leu Asp Gln Lys Gln Gly Tyr Lys Ser Asp Val

115 120 125

Met His Gly Asp Tyr Lys Thr Phe Trp Asn Arg Asp Gln Val Tyr Lys

130 135 140

His Phe Gly Ile Asp Lys Phe Tyr Asp Ala Thr Tyr Tyr Asp Met Ser

145 150 155 160

Asp Lys Asn Val Val Asn Leu Gly Leu Lys Asp Lys Ile Phe Phe Lys

165 170 175

Asp Ser Ala Asn Tyr Gln Ala Lys Met Lys Ser Pro Phe Tyr Ser His

180 185 190

Leu Ile Thr Leu Thr Asn His Tyr Pro Phe Thr Leu Asp Glu Lys Asp

195 200 205

Ala Thr Ile Glu Lys Ser Asn Thr Gly Asp Ala Thr Val Asp Gly Tyr

210 215 220

Ile Gln Thr Ala Arg Tyr Leu Asp Glu Ala Leu Glu Glu Tyr Ile Asn

225 230 235 240

Asp Leu Lys Lys Lys Gly Leu Tyr Asp Asn Ser Val Ile Met Ile Tyr

245 250 255

Gly Asp His Tyr Gly Ile Ser Glu Asn His Asn Asn Ala Met Glu Lys

260 265 270

Leu Leu Gly Glu Lys Ile Thr Pro Ala Lys Phe Thr Asp Leu Asn Arg

275 280 285

Thr Gly Phe Trp Ile Lys Ile Pro Gly Lys Ser Gly Gly Ile Asn Asn

290 295 300

Glu Tyr Ala Gly Gln Val Asp Val Met Pro Thr Ile Leu His Leu Ala

305 310 315 320

Gly Ile Asp Thr Lys Asn Tyr Leu Met Phe Gly Thr Asp Leu Phe Ser

325 330 335

Lys Gly His Asn Gln Val Val Pro Phe Arg Asn Gly Asp Phe Ile Thr

340 345 350

Lys Asp Tyr Lys Tyr Val Asn Gly Lys Ile Tyr Ser Asn Lys Asn Asn

355 360 365

Glu Leu Ile Thr Thr Gln Pro Ala Asp Phe Glu Lys Asn Lys Lys Gln

370 375 380

Val Glu Lys Asp Leu Glu Met Ser Asp Asn Val Leu Asn Gly Asp Leu

385 390 395 400

Phe Arg Phe Tyr Lys Asn Pro Asp Phe Lys Lys Val Asn Pro Ser Lys

405 410 415

Tyr Lys Tyr Glu Thr Gly Pro Lys Ala Asn Ser Lys Lys

420 425