测定水产品中孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物的方法

摘要

本发明涉及一种测定水产品中孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物的方法，包括方法步骤有：步骤一，样品制备；步骤二，提取待检测样品得待上机样品；步骤三，确定色谱条件；步骤四，确定质谱条件；步骤五，标准工作曲线的绘制；步骤六，灵敏度、准确度和精密度的确定。本发明方法首次同时测定被提取浓缩水产品基质中有/无色孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物，解决了传统的分别提取耗时、检测成本高的问题，离子响应值增高，灵敏度增强，检出限低，真正做到定性，定量准确、快速、高效、灵敏，可作为三类药物的可靠检测手段，适合大批量样品提取浓缩。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学中液质-质联仪的应用及生态环境安全技术领域，特别是一种应用液质-质联用仪同时测定水产品中孔雀石绿、喹诺酮类及磺胺类药物的方法。

背景技术

随着水产动物集约化养殖程度的提高以及养殖环境不断的恶化，水产动物病害呈现发病种类多、覆盖范围广、发病时间不固定的特点，养殖业者为了避免病害造成的经济损失，使用大量的药物与消毒制剂，加上目前没有专门水产药物代替，轻“防”重“治”的现状，药物残留问题越来越突出，水产品质量安全问题受到政府及社会的极大关注。因孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物具有抗菌谱广、高效、价格低廉等特点，成为众多养殖户的首选药剂，因此孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物成为目前检出率最高的药残因子之一，从保护消费者身体健康的角度出发，我国颁布了一系列国家标准，明确规定了水产品中有害物质含量的限量值。学者首先开展了液相色谱法测定水产品药残技术研究，分别制定了SC/T 3021-2004液相色谱测定水产品中孔雀石绿残留量，GB/T 20361-2006高效液相色谱荧光检测定水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量，农业部958号公告-12-2007液相色谱测定水产品中磺胺类药物残留量，783号公告-2-2006液相色谱测定水产品中喹诺酮类药物残留量，随着科技的进步，即液相色谱之后，液质-质联用仪被推广应用，因其具有灵敏度高、定性准确等优点被质检机构所认可，学者开展了利用液质-质联用仪测定水产品中药残技术研究，分别制定了GB/T 19857-2005液质-质测定水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量，GB/T 22951-2008河豚鱼、鳗鱼中十八种磺胺类药物残留量的测定-液相色谱-串联质谱法，GB/T 20751-2006鳗鱼及制品中十五种喹诺酮类药物残留量的测定-液相色谱-串联质谱法，农业部1077号公告-1-2008水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定-液相色谱-串联质谱法，另外有的学者还开展了酶联免疫法测定药残技术研究DB34/T 1421-2011水产品中孔雀石绿及其代谢物残留量的快速筛选测定-酶联免疫法，DB51/T 1278-2011生鲜乳中磺胺类药物残留的测定-胶体金免疫层析法，SN/T 4535.1-2016商品化试剂盒检测喹诺酮类方法。综合以上检测技术，液相色谱法的优点是定量准确，缺点是容易受杂质干扰，定性准确度差，液质-质法测定较液相色谱法的优势是定性准确，受杂质干扰小，不足的地方是仪器维护成本较高，酶联免疫法测定且具有特异性和敏感性高和快速的特点，一般用来快速筛分，缺点是定量结果准确性低。当前，随着检测任务量加大，现有标准方法检测指标单一，检测耗时、检测成本高的问题日益凸显，为解决上述问题，将两个或几个单一检测指标整合为一个检测方法成为当前研究的热门课题。

发明内容

本发明的目的是针对检测水产品中孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物现有技术的不足，而提出一种应用液质-质联用仪同时测定水产品中孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物的方法。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种测定水产品中孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物的方法，该方法是应用液质-质联用仪对水产品进行的检测，其特征在于包括方法步骤如下：

步骤一，样品制备

将被检测水产品取可食的肌肉部分样品切成不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的块后，置于绞肉机搅碎，制备好的样品置于-16℃至-20℃条件下保存；

步骤二，提取

(1)称取上述制备好的样品5.00±0.01g置于50mL离心管中，加入20μL混合有/无色孔雀石绿内标工作液，50μL喹诺酮及磺胺类内标工作液，涡旋20s，避光放置20min，加入10g无水硫酸钠，涡旋混匀，加入15mL，V_乙腈：V_浓盐酸＝1000:4的酸化乙腈，匀浆1min，超声提取10min，6000r/min离心5min，取上清液过中性氧化铝柱于50mL梨形瓶中；

(2)在上述操作的残渣中再加入15mL乙酸乙酯重复提取1次，6000r/min离心5min，上清液合并于上述50mL梨形瓶中；

(3)将上述50mL梨形瓶于水浴40℃旋转蒸发至近干，加入1mL定容溶液，再加入2mL正己烷去脂，过0.2μm微滤膜，得待上机样品；

步骤三，确定色谱条件

色谱柱：Shim-pack XR-ODS(75mm×2.1mm)、柱温：35℃、样品室温度：10℃、流动相A：含0.1％甲酸的5mmoL/L的乙酸铵水溶液、流动相B：0.1％甲酸-乙腈溶液、进样体积：5.0μL、流速：0.25mL/min，具体参数见表1，

表1流动相梯度洗脱程序

步骤四，确定质谱条件

(1)离子化模式：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；

(2)离子源温度：600℃；

(3)气帘气：20psi、碰撞气：中、雾化气：60psi、辅助气：40psi、喷雾电压：5000v；

(4)扫描模式：多反应监测(MRM)，反应监测母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量见表2；

表2目标化合物质谱条件

步骤五，标准工作曲线的绘制

(1)量取有/无色孔雀石绿100ng/mL标准工作8液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mL，再量取100ng/mL氘代有/无色孔雀石绿0.2mL，混入工作液容量瓶中，流动相定容至10.0mL，外标浓度为0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL，内标浓度为2ng/mL；量取1.0μg/mL磺胺类、喹诺酮类0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mL，再量取1.0μg/mL内标氘代磺胺、喹诺酮类取0.5mL，混入工作液容量瓶中，流动相定容至10.0mL，外标浓度为10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL，内标为50ng/mL；

(2)内标法定量，试验结果，确定有/无色孔雀石绿质量浓度均在0.1～100ng/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，磺胺类和喹诺酮类质量浓度均在0.005～1μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性相关系数r²均大于0.999；

步骤六，灵敏度、准确度和精密度的确定

(1)灵敏度：在本方法规定的取样体积和定容体积下，按3倍信噪比计算得，有/无孔雀

石绿检出限为0.1μg/kg，喹诺酮和磺胺类检出限为0.5μg/kg；

(2)准确度：以信噪比S/N＞10得其定量下限(LOQ)，有/无色孔雀石绿定量限为0.25μg/kg，

喹诺酮和磺胺类定量限为1.0μg/kg；

(3)精密度：本方法批内相对偏差≤15％，批间相对偏差≤15％。

而且，所述步骤二的(3)步中定容溶液为：乙腈:1mmol/L乙酸铵溶液含0.1％甲酸＝50:50。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明方法首次同时测定被提取浓缩水产品基质中有/无色孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物，解决了传统的分别提取耗时、检测成本高的问题，适合大批量样品提取浓缩。

2、本发明利用AB5500Q Trap液质-质联用仪将有/无色孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物重新优化，获取最佳质谱参数，优化后离子响应值增高，灵敏度增强，检出限低。

3、本发明利用液质-质联用仪同时测定分析有/无色孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物，明显缩短化合物测定时间，真正做到定性，定量准确、快速、高效、灵敏，可作为三类药物的可靠检测手段。

4、本发明充分考虑有/无色孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物的化学性质，对不同提取浓缩试剂进行筛选，最终确定提取效率高的、回收率稳定的组合试剂，解决了只用一种酸化乙腈作为提取试剂，磺胺类提取效果欠佳的问题。

附图说明

图1是本发明中有色孔雀石绿二级质谱图；

图2是本发明中无色孔雀石绿二级质谱图；

图3是本发明中氘代无色孔雀石绿二级质谱图；

图4是本发明中氘代有色孔雀石绿二级质谱图；

图5是本发明中诺氟沙星二级质谱图；

图6是本发明中环丙沙星二级质谱图；

图7是本发明中恩诺沙星二级质谱图；

图8是本发明中氘代诺氟沙星二级质谱图；

图9是本发明中氘代环丙沙星二级质谱图；

图10是本发明中氘代恩诺沙星二级质谱图；

图11是本发明中磺胺嘧啶二级质谱图；

图12是本发明中磺胺噻唑二级质谱图；

图13是本发明中磺胺甲基嘧啶二级质谱图；

图14是本发明中磺胺二甲基嘧啶二级质谱图；

图15是本发明中磺胺异恶唑二级质谱图；

图16是本发明中磺胺甲基异恶唑二级质谱图；

图17是本发明中磺胺多辛二级质谱图；

图18是本发明中磺胺喹噁啉二级质谱图；

图19是本发明中氘代磺胺邻二甲氧嘧啶二级质谱图；

图20是本发明中氘代磺胺间二甲氧嘧啶二级质谱图。

具体实施方式

以下对本发明实施做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

一种测定水产品中孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物的方法，该方法是应用液质-质联用仪对水产品进行的检测，包括方法步骤如下：

步骤一，样品制备

所有被检测水产品只取可食的肌肉部分，样品切成不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的块后，置于绞肉机搅碎，制备好的样品置于-16℃至-20℃条件下保存；

其中，冷冻样品在进行制备前，先在常温下解冻，然后按照上述处理方法进行样品制备。

在本发明的具体实施中，对于各种鱼类：去鳞、去皮，沿脊背取肌肉；对于各种虾、蟹类：去头、去壳、去肠线，取肌肉部分。

步骤二，提取

(1)准确称取上述制备好的样品5.00±0.01g置于50mL离心管中，准确加入20μL混合有/无色孔雀石绿内标工作液，50μL喹诺酮及磺胺类内标工作液，涡旋20s，避光放置20min，加入10g无水硫酸钠，涡旋混匀，加入15mL，V_乙腈：V_浓盐酸＝1000:4的酸化乙腈，匀浆1min，超声提取10min，6000r/min离心5min，取上清液过中性氧化铝柱于50mL梨形瓶中；

(2)上述操作的残渣中再加入15mL乙酸乙酯重复提取1次，6000r/min离心5min，上清液合并于上述50mL梨形瓶中；

(3)将上述50mL梨形瓶于水浴40℃旋转蒸发至近干，加入1mL定容溶液，再加入2mL正己烷去脂，过0.2μm微滤膜，得待上机样品；

其中，所述定容溶液为：乙腈:1mmol/L乙酸铵溶液含0.1％甲酸＝50:50。

步骤三，确定色谱条件

色谱柱：Shim-pack XR-ODS(75mm×2.1mm)；柱温：35℃；样品室温度：10℃；流动相A：含0.1％甲酸的5mmoL/L的乙酸铵水溶液；流动相B：0.1％甲酸-乙腈溶液；进样体积：5.0μL；流速：0.25mL/min，具体参数见表1，

表1流动相梯度洗脱程序

步骤四，确定质谱条件

(1)离子化模式：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；

(2)离子源温度：600℃；

(3)气帘气：20psi、碰撞气：中、雾化气：60psi、辅助气：40psi、喷雾电压：5000v；

(4)扫描模式：多反应监测(MRM)，反应监测母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量见表2；

表2目标化合物质谱条件

步骤五，标准工作曲线的绘制

(1)准确量取有/无色孔雀石绿100ng/mL标准工作液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mL，再准确量取100ng/mL氘代有/无色孔雀石绿0.2mL，混入工作液容量瓶中，流动相定容至10.0mL，外标浓度为0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL，内标浓度为2ng/mL；准确量取1.0μg/mL磺胺类、喹诺酮类0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mL，再准确量1.0μg/mL内标氘代磺胺、喹诺酮类取0.5mL，混入工作液容量瓶中，流动相定容至10.0mL，外标浓度为10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL，内标为50ng/mL；

(2)内标法定量，试验结果表明：有/无色孔雀石绿质量浓度均在0.1～100ng/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，磺胺类和喹诺酮类质量浓度均在0.005～1μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系线性，线性相关系数r²均大于0.999；

步骤六，灵敏度、准确度和精密度的确定

(1)灵敏度：在本方法规定的取样体积和定容体积下，按3倍信噪比计算得，有/无孔雀石绿检出限为0.1μg/kg，喹诺酮和磺胺类检出限为0.5μg/kg；

(2)准确度：以信噪比S/N＞10得其定量下限(LOQ)，有/无色孔雀石绿定量限为0.25μg/kg，喹诺酮和磺胺类定量限为1.0μg/kg；

(3)精密度：本方法批内相对偏差≤15％，批间相对偏差≤15％。

本检测方法的验证

试验采用空白加标的方式，在水产品空白基质中做3个水平组的加标，有/无孔雀石绿0.25μg/kg、1.25μg/kg、10μg/kg，喹诺酮和磺胺类各2.5μg/kg、12.5μg/kg、100μg/kg，每组6个平行，按上述处理后测定，孔雀石绿在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差(n＝6)见表3，喹诺酮与磺胺类在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差(n＝6)表4；

表3孔雀石绿在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差(n＝6)

表4喹诺酮与磺胺类在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差(n＝6)

实验结果表明：有/无孔雀石绿、喹诺酮、磺胺类在水产品中的加标回收率均能达到检测要求，说明本方法具有较高的准确性。同时，相对标准偏差RSD均低于15％，表明结果在置信区间内，本方法具有较高的可靠性。

实施例1,母离子、子离子的选择

本研究以液相色谱-串联质谱法分析水产品中有/无色孔雀石绿、喹诺酮类及磺胺类，选择(ESI+)正离子扫描方式可以获得更多的碎片信息，其以分子离子峰[M+H]+及其二级碎片对其三类化合物进行定性，并以最强二级碎片进行定量。

有/无色孔雀石绿、喹诺酮类及磺胺类中羟基官能团可带正电荷，选用(ESI+)离子化模式可以提供较(ESI+)正离子方式更多的碎片信息，且灵敏度大幅提高，如图1所示。本方法将0.5μg/mL有/无色孔雀石绿、喹诺酮类及磺胺类及其内标液，利用蠕动泵以5.0μL/min速度连续进样方式在正离子模式下进行母离子全扫描，分别确定有/无色孔雀石绿、3种喹诺酮、8种磺胺及其氘代内标物的母离子。

然后分别以各自的母离子作为中心离子，进行二级质谱扫描，分别选择丰度相对较强的两个特征碎片离子，以母离子和子离子组成监测离子对，以多反应监测(MRM)模式对目标物进行定性定量分析，选择丰度最强、无干扰的监测离子作为定量离子，次强丰度离子作为定性离子，因此本发明具有选择专一性好的特点。

实施例2，样品前处理条件

样品前处理

本发明是以GB/T 19857-2005液质质测定水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量及农业部1077号公告-1-2008水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定为基础，进一步对两种方法进行优化整合，由原来两个方法整合为化合物提取及上机测定可同时进行的一个方法。

1.样品的称取

待冷冻样品完全自然解冻后称取，称取应在肉糜的四个对角区域取样，取样应避免携带解冻后的水，保证称取肉糜的均匀性，减少基质未混匀产生的误差。

2.提取

准确称取样品5.00g(±0.01g)置于50mL离心管中，准确加入20μL混合有/无色孔雀石绿内标工作液，50μL喹诺酮与磺胺类内标工作液，涡旋20s，避光放置20min。第一步要保证内标充分扩散至肉糜中，尽量做到内标物与目标化合物同步提取。

加入10g无水硫酸钠，涡旋混匀，加入15mL酸化乙腈(V_乙腈：V_浓盐酸＝1000:4)，匀浆1min，超声提取10min，6000r/min离心5min，取上清液过中性氧化铝柱于50mL梨形瓶中。第二步先用酸化乙腈提取可以确保有/无色孔雀石绿、3种喹诺酮的充分提取。

残渣中再加入15mL乙酸乙酯重复提取1次，6000r/min离心5min，上清液合并于50mL梨形瓶中。第三步采用乙酸乙酯提取可以确保8种磺胺的充分提取，试验结果表明，酸化乙腈对有/无色孔雀石绿、喹诺酮类提取效果最佳，乙酸乙酯对磺胺类提取效果最佳，因此，试验选择先用酸化乙腈提取，再用乙酸乙酯提取相结合的方式，让三类化合物提取效果达到最佳。

水浴40℃旋转蒸发至近干，加入乙腈:1mmol/L乙酸铵溶液含0.1％甲酸＝50:501mL定容溶液，加入2mL正己烷去脂，过0.2μm微滤膜，待上机。

本发明将有/无色孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药残两次提取合并为一次提取，该提取方法步骤简单、操作省时、节约检测成本、回收效果好。

实施例3，AB5500Q液质-质联用仪检测条件的确定

根据CAC和EU第657/2002/EEC号决议中有关规定，选择两对离子进行MRM监测即可满足检测要求，同时子离子的选择主要考虑其中母离子和子离子按照每种化合物的质谱图和结构特性选取，并且在实际样品分析中基质干扰较少，依据上述原则确定各种物质的分子离子后，分别以各种化合物的分子离子为母离子，对其子离子进行全扫描选取丰度较强、干扰较小的两对子离子为定性离子，最强的一对为定量离子，最后以多反应监测(MRM)正离子模式优化各种质谱参数。

检测条件：

色谱条件：色谱柱：Shim-pack XR-ODS(75mm×2.1mm)；柱温：35℃；样品室温度：10℃；流动相A：含0.1％甲酸的5mmoL/L的乙酸铵水溶液；流动相B：0.1％甲酸-乙腈溶液；进样体积：5.0μL；流速：0.25mL/min，具体参数见表1。

表1流动相梯度洗脱程序

Tab.1 Elutionprocess ofthe separation

质谱条件：(1)离子化模式：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；离子源温度：600℃；气帘气:20psi；碰撞气:中；雾化气:60psi；辅助气:40psi；喷雾电压:5000v；扫描模式：多反应监测(MRM，反应监测母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量见表2。

表2目标化合物质谱条件

Tab.2 Mass spectrometric conditions for monitoring oftarget compounds

实施例4，回收率与精密度

添加分组：采用空白加标的方式，在水产品空白基质中进行3个水平的添加，添加有/无孔雀石绿0.25μg/kg、1.25μg/kg、10μg/kg，喹诺酮、磺胺类各2.5μg/kg、12.5μg/kg、100μg/kg，每个梯度6个平行。

提取：准确称取样品5.00g(±0.01g)置于50mL离心管中，准确加入20μL混合有/无色孔雀石绿内标工作液，50μL喹诺酮与磺胺类内标工作液，涡旋20s，避光放置20min，加入10g无水硫酸钠，涡旋混匀，加入15mL酸化乙腈(V_乙腈：V_浓盐酸＝1000:4)，匀浆1min，超声提取10min，6000r/min离心5min，取上清液过中性氧化铝柱于50mL梨形瓶中。残渣中再加入15mL乙酸乙酯重复提取1次，6000r/min离心5min，上清液合并于50mL梨形瓶中，于水浴40℃旋转蒸发至近干，加入乙腈:1mmol/L乙酸铵溶液含0.1％甲酸＝50:501mL定容溶液，加入2mL正己烷去脂，过0.2μm微滤膜，待上机。回收率和相对标准偏差见表3。试验结果表明：有/无孔雀石绿、喹诺酮、磺胺类在水产品中的加标回收率均能达到检测要求，说明本方法具有较高的准确性。同时，相对标准偏差RSD均低于15％，表明结果在置信区间内，本方法具有较高的可靠性。

表3孔雀石绿在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差(n＝6)

Tab.3 Recoverries and relative standard deviations ofMG and LMG inblank samples(n＝6)

表4喹诺酮与磺胺类在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差(n＝6)

Tab.4 Recoverriesandrelative standarddeviations ofquinolone andsulfas inblank samples(n＝6)

实施例5，灵敏度、准确度和精密度

在方法规定的取样体积和定容体积下，灵敏度按3倍信噪比计算得该方法有/无孔雀石绿检出限0.1μg/kg，喹诺酮、磺胺类检出限为0.5μg/kg。准确度以信噪比S/N＞10得其定量下限(LOQ)有/无色孔雀石绿定量限为0.25μg/kg，喹诺酮、磺胺类为1.0μg/kg；精密度：本方法批内相对偏差≤15％，批间相对偏差≤15％。

实施例6，本发明检测方法的实际应用

用本发明方法对农业部城市例行监测90个样品进行实际检测，其中无色孔雀石检出率为6％，按农业部规定孔雀石绿残留大于1.0μg/kg为阳性样品，实际合格率为97％；喹诺酮类检出率为46％，其中恩诺沙星占检出的90％，按农业部规定恩诺沙星残留大于100μg/kg或环丙沙星与诺氟沙星总残留大于100μg/kg为阳性性样品，实际合格率为98％；磺胺类检出率为2％，按农业部规定磺胺类残留总量大于100μg/kg为阳性样品，实际合格率为100％，以上检测结果与采用现行标准检测结果一致，证明本发明方法具有实际应用性。