水产品中苯并咪唑及噻唑类残留药物的快速提取及LC‑MS‑MS检测方法

摘要

本发明公开了一种水产品中苯并咪唑及噻唑类残留药物的快速提取及LC‑MS‑MS检测方法，其步骤是：1)称取水产品肌肉样品，加入内标氘代阿苯达唑和氘代甲苯咪唑、硫酸镁和氯化钠、乙腈进行漩涡提取；2)提取液中加入C18粉和中性氧化铝，漩涡后氮气吹干，复溶后过滤；3)滤液进行LC‑MS‑MS定量测定，采用内标法计算左旋咪唑、氨基‑甲苯咪唑、羟基‑甲苯咪唑、甲苯咪唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑氨基砜和阿苯达唑的残留量。本方法处理样品简便快速，同时优选了净化剂和液相色谱水相的pH值，可同时测定水产品中多种苯并咪唑及噻唑类药物的残留量，灵敏度高、重复性好、准确度高，药物检测的最低定量可以达到1μg/kg。

说明书

技术领域

本发明属于水产品质量安全领域，具体涉及水产品中苯并咪唑及噻唑类残留药物的快速提取方法及LC-MS-MS检测方法。

背景技术

随着水产养殖规模的扩大，大规模的寄生虫病害不断发生，大量的抗虫药应用到水产养殖中。由于标签外用和不遵守休药期，造成了严重的药物残留。大部分抗寄生虫药具有一定的毒性，例如临床试验表明，大多数苯并咪唑类药物具有制致畸和致突变的作用。在使用此类药物的过程中也曾出现过严重的不良反应，例如过敏性休克、严重麻疹和脑炎综合症，已受到各国的广泛关注。2004年，我国药品不良反应监测中心首次通报了“甲苯咪唑等三种咪唑类驱虫药引起脑炎综合征的概述”，引起了社会的广泛关注。噻唑类抗寄生虫药，并没有批准应用在水产动物中，但是此类药物在实际生产中也存在违规使用。其中左旋咪唑违规使用较为严重，应该严格控制此药在水产动物中的使用。这些药物在水产品中的大量残留，对人类生命健康存在巨大的潜在威胁。因此在各个国家都作为食品残留监控对象，制定了严格的残留限量标准

近些年来，苯并咪唑类和噻唑类药物的残留检测技术不断发展，主要方法有酶联免疫法、气相色谱法、液相色谱法和液质谱联用法。由于操作方便简单，检测限和定量限都较低，液质联用法广泛应用到残留检测中。目前这些检测方法中使用的提取方法仍然停留在液液提取和固相萃取方面，需要耗费大量的人力和很长的时间进行样品处理，而且处理方法中用到大量的有机试剂，产生大量的废液和废气，给环境造成污染。本发明中采用简便快速的分散固相萃取方法，提供了一整套样品处理、流动相优化和质谱检测方法。本方法中样品量大约是以前方法的三分之一，加入去水、分层剂和有机试剂大大减少，方法中优化了左旋咪唑、甲苯咪唑及代谢物和阿苯达唑及代谢物的检测方法，选取了最佳的流动相和质谱检测条件，得到了良好的精密度和准确度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水产品中苯并咪唑及噻唑类残留药物的快速提取及LC-MS-MS检测方法，采用简便快速的分散固相萃取方法提取样品，选取了最佳的流动相和质谱检测条件，检测结果精密度和准确度良好。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

水产品中苯并咪唑及噻唑类残留药物的快速提取及LC-MS-MS检测方法，其步骤是：

1)提取：称取水产品肌肉样品，加入内标氘代阿苯达唑和氘代甲苯咪唑，再加入去水剂硫酸镁和氯化钠、提取溶液乙腈进行漩涡，离心后取上清液；

2)净化：在上清液加入分散固相萃取试剂，所述萃取试剂为质量比1:1的C18粉(十八烷基硅烷)和中性氧化铝，漩涡后氮气吹干，再加入体积比为1:1的甲醇和0.01％甲酸水的混合液进行复溶，经0.22μm的有机滤膜过滤，滤液供LC-MS-MS检测；

3)LC-MS-MS测定：液相色谱流动相的水相为pH 3.9的10mmol/L乙酸铵，有机相含5mmol/L乙酸铵、甲醇及乙腈，甲醇及乙腈的体积比为1:9，检测的残留药物左旋咪唑(LEV)、氨基-甲苯咪唑(MBZ-NH₂)、羟基-甲苯咪唑(MBZ-OH)、甲苯咪唑(MBZ)以氘代甲苯咪唑(MBZ-D₃)为内标，阿苯达唑亚砜(ABZ-SO)、阿苯达唑砜(ABZ-SO₂)、阿苯达唑氨基砜(ABZ-NH₂-SO₂)和阿苯达唑(ABZ)以氘代阿苯达唑(ABZ-D₃)为内标；采用待测药物的混合标准工作液上机测定，绘标准工作曲线；将步骤2)中的滤液进行LC-MS-MS定量测定，采用内标法计算水产品中LEV、MBZ-NH₂、MBZ-OH、MBZ、ABZ-SO、ABZ-SO₂、ABZ-NH₂-SO₂和ABZ的残留量。

优选的，步骤1)中肌肉样品为2g，内标ABZ-D₃和MBZ-D₃的终浓度分别为5μg/kg和10μg/kg，去水剂硫酸镁和氯化钠分别为0.84g、0.21g，提取溶液乙腈为10mL。

优选的，步骤3)中采用的色谱柱为C18柱，150mm×2.1mm，粒径3μm。

优选的，步骤3)中流速为0.2mL/min，进样量10μL，流动相梯度如下：

优选的，步骤3)中质谱条件为雾化气温度338℃，鞘气40arb，辅助气5arb，离子传输管350℃。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1、本方法快速简便，提取和净化步骤少，节约了大量的人力和物力：在提取方法中采用样品量更少，仅为2g；采用一步有机试剂提取，即得提取液，优化了去水剂和分层剂的量，选取了最佳的提取溶剂。

2、比较了不同固体分散净化剂的净化效果，选取了最佳的净化剂及加入量(质量比为1:1的C18和AL-N混合粉)，化合物的回收率都在80.0-117.9％之间，日内和日间变异系数都在10％之内。

3、选取了最佳的水相pH值，增加了每个化合物分离度和选择性，尤其使左旋咪唑出峰更完美。

附图说明

图1为不同提取溶液对团头鲂中苯并咪唑及噻唑类药物的提取效果。

图2为C18粉进行净化时左旋咪唑各个离子质谱图。

图3为PSA粉进行净化时左旋咪唑各个离子质谱图。

图4为NH₂粉进行净化时左旋咪唑各个离子质谱图。

图5为C18和AL-N混合粉进行净化时左旋咪唑各个离子质谱图。

图6为不同净化剂对苯并咪唑及噻唑类药物的提取效率的影响。

图7为水相pH值为7.2时左旋咪唑的离子质谱图。

图8为水相pH值为3.9时左旋咪唑的离子质谱图。

图9为团头鲂肌肉中添加10μg/kg左旋咪唑(LEV)、氨基-甲苯咪唑(MBZ-NH₂)、羟基-甲苯咪唑(MBZ-OH)、甲苯咪唑(MBZ)定性离子和定量离子质谱图。

图10为团头鲂肌肉中添加10μg/kg阿苯达唑亚砜(ABZ-SO)、阿苯达唑砜(ABZ-SO₂)、阿苯达唑氨基砜(ABZ-NH₂-SO₂)、阿苯达唑(ABZ)定性离子和定量离子质谱图。

具体实施方式

实施例1：不同提取溶剂的效果比较

(1)提取：称取团头鲂肌肉空白样品2g于50mL离心管中，空白样品中分别添加待测化合物混合标准溶液，使各个待测化合物(LEV、MBZ-NH₂、MBZ-OH、MBZ、ABZ-SO、ABZ-SO₂、ABZ-NH₂-SO₂和ABZ)的终浓度分别达到2、3和4μg/kg，加入内标氘代阿苯达唑(ABZ-D₃)和氘代甲苯咪唑(MBZ-D₃)，使其终浓度分别达到5μg/kg和10μg/kg，加入0.84g硫酸镁(提取样品中分别加入0.44g、0.84g和1.04g硫酸镁，发现加入0.84g硫酸镁时，提取液能够完全吹干，达到最佳效果)和0.21g氯化钠，加入10mL提取溶剂，旋涡1min，5000rpm离心5min，取5.5mL提取液，待用；

在本实施例中提取溶剂分别选用了乙腈(ACN)、乙腈+0.05％氨水(氨水的终浓度，下同)、乙腈+0.1％氨水、乙腈+0.2％氨水、乙腈+0.05％甲酸、乙腈+0.1％甲酸、乙腈+0.2％甲酸。

(2)净化：将上述5.5mL提取液放入10mL离心管中，加入分散固相萃取试剂(50mgC18粉和50mg Al-N粉)，旋涡1min，5000rpm离心5min，40℃水浴下，氮气吹干，1mL甲醇/0.01％甲酸水(v：v＝1:1)复溶，12000rpm离心10min，过0.22μm的有机滤膜，供LC-MS-MS检测。

(3)色谱条件

仪器：高效液相色谱-串联质谱(Suryeyor MS Pump Plus，Suryeyor AutosamplerPlus，Thermo TSQ Quantum Acess MAX)及Thermo LCquan 2.6数据采集处理软件

色谱柱：hypersil gold-C18(150mm×2.1mm，粒径3μm)

流动相洗脱条件：

水相中加入乙酸铵10mmol/L，采用甲酸调节pH值到3.9；

有机相为5mmol/L乙酸铵、甲醇及乙腈，甲醇及乙腈的体积比为1:9

表1流动相梯度

流速：200μL/min

进样量：10μL

离子源：电喷雾离子源

扫描方式：正离子

检测方式：多反应监测

喷雾电压：3500V

雾化器温度：338℃

鞘气：40arb

辅助气：5arb

离子传输管温度：350℃

LEV、MBZ-NH₂、MBZ-OH、MBZ以MBZ-D₃为内标，ABZ-SO、ABZ-SO₂、ABZ-NH₂-SO₂和ABZ以ABZ-D₃为内标；标准工作曲线是采用混合标准品，浓度分别为1、2、5、10、20和50μg/L；测定定量离子的峰面积和内标离子的峰面积，以质量浓度为横坐标，定量离子的峰面积与内标离子的峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线。

(4)计算回收率

R＝(A_i/A_is)/(A_s/A_ss)×100％

R为回收率，A_i为加标样品中目标化合物的峰面积，A_is为加标样品中内标的峰面积，As为目标化合物标准品的峰面积，Ass为标准品中添加的内标的峰面积。

本实施例选用不同的提取溶剂(纯乙腈、乙腈+0.05％氨水、乙腈+0.1％氨水、乙腈+0.2％氨水、乙腈+0.05％甲酸、乙腈+0.1％甲酸、乙腈+0.2％甲酸)，采用内标法对团头鲂肌肉中的LEV、MBZ-NH₂、MBZ-OH、MBZ、ABZ-SO、ABZ-SO₂、ABZ-NH₂-SO₂和ABZ进行测定，结果见图1，综合各种因素最终发现纯乙腈的提取效果是最佳的。

实施例2：不同净化剂的效果比较

按照实施例1所述的方法，以乙腈为提取溶剂，分别选取C18粉(十八烷基硅烷)、PSA粉(乙二胺-N-丙基硅烷)、AL-N粉(中性氧化铝)、NH₂粉((氨丙基)硅胶基质)、C18+AL-N混合粉(各50mg)作为净化剂，比较不同净化剂对LEV、MBZ-NH₂、MBZ-OH、MBZ、ABZ-SO、ABZ-SO₂、ABZ-NH₂-SO₂和ABZ的测定效果。

如图2、3、4所示，选用C18粉、PSA粉、NH₂粉对提取液进行净化时，左旋咪唑定量离子91.3检测时出现较大干扰峰；选用AL-N粉作为净化剂，杂质峰消除；如图5所示，最终经C18和AL-N混合粉(各50mg)净化各个化合都能达到较高的回收率，而且样品中杂质少。

实施例3：水相的pH值对左旋咪唑的出峰效果的比较

按照实施例1所述的方法，以乙腈为提取溶剂，选用C18+AL-N混合粉(各50mg)作为净化剂，流动相水相中加入乙酸铵10mmol/L，水相的pH值分别设置为3.9(采用甲酸调节)、7.2(不加pH调节剂)，测定不同pH值对左旋咪唑的影响。如图8所示，pH值为3.9时，峰的对称性最好。

实施例4：苯并咪唑及噻唑类药物的快速提取及LC-MS-MS检测方法

根据实施例1-3优选的实验条件，采用LC-MS-MS检测方法测定苯并咪唑及噻唑类药物在团头鲂肌肉中的残留量，以其回收率及精密度作为检测效果的衡量指标，其步骤是：

1、样品处理方法

(1)提取

称取团头鲂肌肉空白样品2g于50mL离心管中，空白样品中分别添加不同浓度的待测化合物(LEV、MBZ-NH₂、MBZ-OH、MBZ、ABZ-SO、ABZ-SO₂、ABZ-NH₂-SO₂和ABZ)混合标准溶液，使各个待测化合物的终浓度分别达到2、3和4μg/kg，加入内标ABZ-D₃和MBZ-D₃，使其终浓度分别达到5μg/kg和10μg/kg，加入0.84g硫酸镁和0.21g氯化钠，加入10mL提取溶液乙腈，旋涡1min，5000rpm离心5min，取5.5mL提取液待用；

(2)净化

将上述5.5mL提取液放入10mL离心管中，加入分散固相萃取试剂(50mg C18粉+50mg Al-N粉)，旋涡1min，5000rpm离心5min，40℃水浴下，氮气吹干，1mL甲醇/0.01％甲酸水(v：v＝1:1)复溶，12000rpm离心10min，过0.22μm的有机滤膜，供LC-MS-MS检测。

2、LC/MS/MS

(1)色谱条件

仪器：高效液相色谱-串联质谱(Suryeyor MS Pump Plus，Suryeyor AutosamplerPlus，Thermo TSQ Quantum Acess MAX)及Thermo LCquan 2.6数据采集处理软件

色谱柱：hypersil gold-C18(150mm×2.1mm，粒径3μm)

流动相洗脱条件：

流动相水相中加入乙酸铵10mmol/L，采用甲酸调节pH值到3.9；

有机相含5mmol/L乙酸铵、甲醇及乙腈，甲醇及乙腈的体积比为1:9，流动相梯度如下：

时间min有机相％水相％089018903505059010790101088

流速：200μL/min

进样量：10μL

离子源：电喷雾离子源

扫描方式：正离子

检测方式：多反应监测

喷雾电压：3500V

雾化器温度：338℃

鞘气：40arb

辅助气：5arb

离子传输管温度：350℃

(2)线性和测定低限

本方法对于水产品肌肉中LEV、MBZ-NH₂、MBZ-OH、MBZ、ABZ-SO、ABZ-SO₂、ABZ-NH₂-SO₂和ABZ测定低限均为1μg/kg，采用内标法进行定量，LEV、MBZ-NH₂、MBZ-OH、MBZ以MBZ-D₃为内标；ABZ-SO、ABZ-SO₂、ABZ-NH₂-SO₂和ABZ以ABZ-D3为内标；

标准工作曲线是采用混合标准品，浓度分别为1、2、5、10、20和50μg/L；内标ABZ-D₃和MBZ-D₃的浓度分别为5和10μg/L，测定定量离子的峰面积和内标离子的峰面积(见图9和10)，以质量浓度为横坐标，定量离子的峰面积与内标离子的峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，每种化合物标准曲线良好，相关系数都达到0.996-0.999之间。

(3)回收率和精密度

R＝(A_i/A_is)/(A_s/A_ss)×100％

R为回收率，A_i为加标样品中目标化合物的峰面积，A_is为加标样品中内标的峰面积，As为目标化合物标准品的峰面积，Ass为标准品中添加的内标的峰面积。

精密度：选定三个浓度，每个浓度3个平行，一天内测定3次，计算回收率的变异系数为日内变异系数；选定三个浓度，每个浓度3个平行，连续测定3天，计算回收率的变异系数为日间变异系数。

空白样品中分别添加三个不同浓度的待测化合物的混合标准溶液，添加浓度为2、3和4ug/kg，按照操作方法制备样品，获得了良好的回收率和变异系数，回收率都在80.0-117.9％之间，日内和日间变异系数都在10％以内。

表2团头鲂肌肉中不同化合物的回收率和精密度