LACC1和FHL2基因在制备脊柱侧弯检测产品中的应用

摘要

本发明公开了LACC1和FHL2基因在制备脊柱侧弯检测产品中的应用。本发明还公开了一种检测脊柱侧弯的生物试剂。本发明进一步公开了一种检测脊柱侧弯的ELISA试剂盒。利用LACC1和FHL2基因检测脊柱侧弯不仅能够快速有效的做到早期诊断，而且为预测诊断AIS的发生发展，甚至是为今后在生物学水平治疗AIS提供了治疗靶点和重要依据。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及LACC1和FHL2基因在制备脊柱侧弯检测产品中的应用。

背景技术

脊柱侧弯(Scoliosis)，又称脊柱侧凸，是一类以脊柱侧方弯曲并伴有椎体旋转的复杂三维脊柱畸形。根据发病原因，可将其分为3大类：先天性脊柱侧弯、综合症性脊柱侧弯和特发性脊柱侧弯。先天性脊柱侧弯是由脊柱发育畸形导致的；综合症性脊柱侧弯是由神经肌肉疾病、骨骼疾病、结缔组织疾病和神经纤维瘤病等导致的；特发性脊柱侧弯确切病因尚不清楚，相关研究认为基因遗传因素、生长发育和激素、结缔组织病变、肌肉系统的异常、中枢神经系统异常、褪黑素的作用等都可能与AIS的发病有关。其中，青少年特发性脊柱侧弯(Adolescent Idiopathic Scoliosis，AIS)最为常见，占整个脊柱侧弯的80％。青少年特发性脊柱侧弯在10岁-16岁青少年中的发病率较高，是继视力异常、肥胖、包茎和社会心理障碍后的第五大常见病。虽然AIS除表现畸形外通常不引起严重的病理状态，但是重度胸弯可能引起心、肺功能的减退，导致明显的体型上的畸形，甚至影响寿命。

目前治疗方法主要是针对畸形进行矫治，包括临床观察、支具治疗和对侧弯超过45°者进行手术治疗，治疗复杂，常遗留有脊柱畸形和脊柱活动障碍，效果不理想。同时，AIS患者如果不进行筛查，在初次就诊时主弯平均角度为38°，已经接近进行支具治疗的上限。因此，对AIS的早期筛查和诊断可以为患者争取更多保守治疗的机会，减少手术几率。目前AIS的诊断与筛查主要还是依靠对患者外观对称性的体格检查和影像学检查，这会使很多低风险的青少年接受不必要的放射学检查，而且这种筛查手段特异性较差。随着医学遗传学和医学分子生物学研究的不断深入和进步，AIS的医学分子生物学机制的研究也陆续被报道。在对AIS进行分子生物学研究的过程中发现了一些与其相关的生物标记物，如钙调蛋白、外周血中瘦素、血清骨桥蛋白、可溶性CD44、SH3GL1等，但效果和结论仍需进一步验证。因此，从基因表达水平上去研究AIS病因，继续寻找新的、特异性好的AIS早期筛查与诊断的标记物具有重要意义。

发明内容

为了实现青少年特发性脊柱侧弯的早期发现，早期治疗，本发明的目的之一在于提供LACC1和FHL2基因在制备脊柱侧弯检测产品中的应用。

本发明的目的之二在于提供一种检测脊柱侧弯的生物试剂。

本发明的目的之三在于提供一种检测脊柱侧弯的ELISA试剂盒。

为实现上述目的，本发明首先提供LACC1和FHL2基因在制备脊柱侧弯检测产品中的应用。

优选地，所述脊柱侧弯为青少年特发性脊柱侧弯。

优选地，所述产品能够通过检测生物学样品中LACC1和FHL2基因或其表达产物的表达水平来诊断脊柱侧弯。

优选地，所述LACC1和FHL2基因或其表达产物在脊柱侧弯生物学样品中表达下调。

优选地，所述的检测包括基因水平的检测和蛋白水平的检测，所述基因水平检测包括实时定量PCR法、基因芯片法和高通量测序法；所述蛋白水平的检测包括免疫组化、胶体金法、ELISA法和Western blot法。

优选地，所述产品包括芯片、试剂盒或生物试剂。

优选地，所述试剂盒可以是检测LACC1和FHL2基因转录水平的试剂盒，如QPCR试剂盒，也可以是检测LACC1和FHL2蛋白的表达水平的试剂盒，如ELISA试剂盒；所述芯片可以是基因芯片或是蛋白芯片，其能够检测LACC1和FHL2基因的表达水平；所述生物试剂包括LACC1和FHL2的特异性引物和抗LACC1和FHL2蛋白的特异性抗体。

进一步地，本发明提供了一种检测脊柱侧弯的生物试剂，所述生物试剂包括用于检测脊柱侧弯的两组引物对，其中，一组引物对具有SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；另一组引物对具有SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述二组引物对通过转录介导扩增技术来检测人体体内LACC1和FHL2基因的表达水平，以判断脊柱侧弯发生的风险。

更进一步地，本发明提供了一种检测脊柱侧弯的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括抗LACC1和FHL2蛋白的特异性抗体。

优选地，所述LACC1和FHL2蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

优选地，所述抗体可以从商业途径获取，也可以使用一系列本领域已知的方法来制备。例如，将纯化的人LACC1和FHL2蛋白或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达人LACC1和FHL2蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。单克隆抗体可用杂交瘤技术制备。

优选地，所述LACC1和FHL2蛋白抗体为单克隆抗体，所述LACC1和FHL2蛋白抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，优选为鼠源抗体。本发明使用的抗人LACC1和FHL2蛋白鼠源单克隆抗体均由abcam公司制备。

优选地，所述LACC1和FHL2蛋白抗体为辣根过氧化物酶标记的抗体。

优选地，所述试剂盒还包括抗LACC1兔多克隆抗体包被的酶标板、抗FHL2兔多克隆抗体包被的酶标板、蛋白标准品LACC1和FHL2、TMB底物溶液、稀释液、洗涤缓冲液、终止溶液。

优选地，终止溶液成分为2M H₂SO₄。

本发明的有益效果如下：本发明公开了一种与脊柱侧弯相关的基因LACC1和FHL2，并进一步证实该LACC1和FHL2基因或其表达蛋白在青少年特发性脊柱侧弯患者生物学样品中表达下调。利用LACC1和FHL2基因在青少年中进行脊柱侧弯的普查，解决了现有技术中诊断措施敏感性和特异性差的问题，也减少了X线辐射的损害，能够快速有效的做到AIS的早期诊断，而且为预测诊断AIS的发生发展，甚至是为今后在生物学水平治疗AIS提供了治疗靶点和重要依据。

附图说明

图1本发明中实施例2中脊柱侧弯患者LACC1和FHL2基因表达下调。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。

本发明的技术方案具体包括：对25例青少年特发性脊柱侧弯患者样本及15例对照样本进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选基因LACC1和FHL2，现有研究中并没有LACC1、FHL2和青少年特发性脊柱侧弯相关的报道，进一步，发明人进行了分子生物学方法验证，证实了LACC1和FHL2在脊柱侧弯患者生物学样品中表达下调，其相关制剂可用于诊断青少年特发性脊柱侧弯。

本发明的LACC1和FHL2基因是在本发明之前的已知基因，其基本信息如下：

Genbank登录号：LACC1GeneID:144811，FHL2GeneID:2274来源于人类基因组。

LACC1(laccase domain containing 1，漆酶域1)位于13号染色体上，是一个蛋白编码基因。与LACC1疾病包括类风湿性关节炎和全身性幼年麻风病。

FHL2(four and a halfLIM domains 2)又称DRAL是FHL(four-and-half LIM，FHL)家族中一员。FHL家族共有5个成员，即FHL1、FHL2、FHL3、FHL4和FHL5/ACT，均只含有LIM结构域，介导蛋白-蛋白相互作用，激活或抑制转录因子的活性，进而影响基因表达；FHL2调节细胞的增殖；参与细胞骨架的形成。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

1.利用高通量测序方法对25例脊柱侧弯患者的血液样本LACC1和FHL2基因的水平与15例对照样本中进行差异比较。

2.采用RT-PCR方法检测LACC1和FHL2基因在脊柱侧弯患者和正常人群中的表达，并验证了该基因为脊柱侧弯表达下调基因。

3.脊柱侧弯的ELISA检测试剂盒组装和使用

(1)ELISA实验中常规试剂的配制

(2)多克隆抗体制备

(3)酶标板的包被

(4)酶标抗体的制备

(5)试剂盒的组装

4.ELISA试剂盒的临床应用

利用本发明人制备的ELISA试剂盒检测待确诊的脊柱侧弯患者并与实际临床检测相比较以确定了ELISA试剂盒的有效性。具体包括测定受试者血液样本中LACC1和FHL2蛋白表达量，并与正常血液样本中LACC1和FHL2蛋白表达量进行比较，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。

本发明的LACC1和FHL2基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。

目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明的蛋白(或其片段)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。本发明蛋白的片段除了可用重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Soliod-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

本文使用的“脊柱侧弯”未做说明时，一般特指青少年特发性脊柱侧弯。

本文使用的术语“生物学样品”包括但不限于血、血清、唾液、尿、滑液、软骨等样品。用于本发明的生物学样品得自任何受试者的任何组织样品(如椎间盘、关节突、脊髓、椎旁肌或血样)或细胞样品(如成骨细胞、软骨细胞或血细胞样品)均可以根据本发明方法使用。可以从中获得这些样品并根据本发明方法使用这些样品的受试者实例包括但不限于无症状受试者、表现或更多脊柱侧弯症状的受试者、临床诊断为患有脊柱侧弯的受试者、易患脊柱侧弯的受试者(如有脊柱侧弯家族史的受试者、有脊柱侧弯遗传易感性的受试者以及生活方式使其易感脊柱侧弯或提高患脊柱侧弯可能性的受试者)、怀疑患有脊柱侧弯的受试者、正接受脊柱侧弯治疗的受试者、患有脊柱侧弯和非接受脊柱侧弯治疗的受试者、开业医生(如医师)确定为健康或无脊柱侧弯的受试者(即正常)、已治愈脊柱侧弯的受试者、正在控制其脊柱侧弯的受试者和未诊断为脊柱侧弯的受试者。

实施例1高通量测序筛选差异表达基因

1、取样

选取2012年10月到2015年12月期间在北京协和医院骨科就诊的脊柱侧弯患者，病例组共收集25例，所有患者均有典型的临床表现，经X线检查确诊。对照来源于同时期骨科住院的其他疾病患者，共收集15例。患者均为10岁-18岁的青少年。采集所有研究对象的血液样本，编号后置-80℃低温冰箱保存。本研究的所有临床样本，均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。

2、对血液样本进行总RNA提取

采用LS(Invitrogen:10296-010)对采集的血液样本进行RNA提取，实验操作按产品说明书进行，每组实验的具体操作如下：

取收集到的新鲜血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。

(1)入1mLTrizol，室温保存5分钟；

(2)加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温放置3-5分钟；

(3)12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的界面。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；

(4)12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mL Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下8000rpm离心2分钟。弃去乙醇液体，室温下放置2分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；

(5)用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。

3、RNA样品的质量分析

RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

4、高通量测序

测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1，FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Ontology和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达基因LACC1和FHL2，LACC1和FHL2基因在脊柱侧弯患者血液样本中表达下调。

实施例2 qRT-PCR验证脊柱侧弯患者LACC1和FHL2基因的表达情况

1、材料

选取2012年10月到2015年12月期间在北京协和医院骨科就诊的脊柱侧弯患者10例，所有患者均有典型的临床表现，经X线检查确诊。对照来源于同时期骨科住院的其他疾病患者，共收集8例。患者均为10岁-18岁的青少年。采集所有研究对象的血液样本，编号后置-80℃低温冰箱保存。本研究的所有临床样本，均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。

2、方法

2.1对血液样本进行总RNA提取，同实施例1的提取方法。

2.2逆转录合成cDNA

采用RT reagent kit(TaKaRa，货号DRR037A)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对0.3μg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用10μL反应体系：5xPrimerScript Buffer 2μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL、OligodT Primer 0.5μL、Random 6mers 0.5μL、RNA模板为0.3μg和RNase Free dH₂O补至10μL。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。

2.3 Real-Time PCR

利用在线引物设计软件，LACC1基因序列参照NCBI:NM_001128303.1，FHL2基因序列参照NCBI:NM_001039492.2，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物如表1所示：

表1 引物序列表

用Premix Ex Taq^TMII(TaKaRa，货号DRR081A)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。荧光定量PCR>TMII：10μL，引物(10μM)：正、反向引物各0.8μL，ROX>2O：6μL，模板cDNA：2μL。反应程序在ABI7500上进行，扩增程序为：95℃30sec，(95℃5sec，60℃34sec)×40个循环。

3、统计学分析

实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2^-ΔΔCt×100％，比较LACC1和FHL2基因在脊柱侧弯患者血液中和对照组血液中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中LACC1和FHL2基因在脊柱侧弯患者血液中的表达水平分别为对照组血液中的40％和35％，如图1所示。以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析LACC1和FHL2基因在脊柱侧弯患者中表达下调的结果。

实施例3检测脊柱侧弯的ELISA试剂盒组装和使用

1.ELISA实验中常规试剂：

包被缓冲液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加蒸馏水至1L。

洗涤缓冲液(pH7.4)：8.0g NaCl；0.2g KH₂PO₄；2.9g>2HPO₄·12H₂O；0.2g>2O至1L。

稀释液:牛血清白蛋白(BSA)0.1g加洗涤缓冲液至100mL；

本发明使用的抗人LACC1和FHL2蛋白鼠源单克隆抗体均由abcam公司制备。

蛋白标准品LACC1和FHL2为人源重组蛋白均购自北京傲锐东源生物科技有限公司。

2.多克隆抗体制备：

采用固相合成法制备LACC1和FHL2蛋白；采用碳二亚胺偶联法将合成LACC1和FHL2蛋白与载体蛋白BSA(牛血清白蛋白)偶联制备免疫原LACC1-BSA和FHL2-BSA，联合UV(紫外扫描)和SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)监测偶联物LACC1-BSA和FHL2-BSA；将制备好的偶联物LACC1-BSA和FHL2-BSA作为免疫原，结合弗氏完全佐剂与不完全佐剂免疫新西兰大耳白兔，每次偶联物抗原免疫剂量为1mg，免疫方式为颈背部皮下多点注射；经3次免疫后检测免疫兔静脉血滴度，达到1:10000以上后，对免疫兔进行颈动脉取血收集免疫全血，离心分离后收集兔免疫血清；采用Protein A亲和层析柱对抗LACC1和FHL2蛋白的兔免疫血清进行纯化，制备抗LACC1和FHL2蛋白的多克隆抗体，检测多克隆抗体的滴度、特异性、灵敏性等，得到抗血清LACC1和FHL2蛋白抗体。

3.酶标板的包被：

所述的抗LACC1和FHL2兔多克隆抗体包被的酶标板通过如下方法制备：用pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将纯化后抗LACC1和FHL2兔多克隆抗体稀释成目的浓度0.63μg/mL；将稀释好的抗体溶液混匀后加入微孔中，100μL/孔，4℃过夜；洗板3次，200μL/孔；加入3％BSA封闭液，300μL/孔，4℃过夜；洗板3次，200μL/孔；-20℃保存。

4.酶标抗体的制备：

取抗LACC1和FHL2蛋白鼠源单克隆抗体，分别与HRP进行偶联，得到酶标记抗体。取一定量的酶标记抗体加入到稀释液中，充分混匀，使其终浓度为2μg/mL(可根据具体的条件而定)，2-8℃避光保存。

5.试剂盒的组装：

检测脊柱侧弯的ELISA试剂盒包括表2中的组分：

表2 ELISA检测试剂盒

为方便使用，该试剂盒还可包含阳性对照：正常人AB血清或胎牛血清500μL和阴性对照：1％PBS 1mL。

该试剂盒的使用方法如下：

(1)分别取LACC1和FHL2标准蛋白浓度分别为900pg/mL，600pg/mL，300pg/mL，150pg/mL，75pg/mL溶液50μL加入包被抗体的酶标板绘制标准曲线；

(2)分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔，在酶标板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；

(3)用封板膜封板后置37℃温育30分钟；

(4)小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；

(5)每孔加入酶标试剂50μL；

(6)温育，洗涤，步骤同上；

(7)每孔先加入TMB底物溶液A 50μL，再加入TMB底物溶液B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；

(8)每孔加终止液50μL，终止反应；

(9)以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，计算各血清样本中蛋白含量。

实施例4 ELISA试剂盒的临床检测

1、病例

选取20例待筛查的脊柱侧弯患者，取样来源于2012年10月到2015年12月期间在北京协和医院骨科就诊的的病人。采集所有研究对象的血液样本，编号后置-80℃低温冰箱保存。本研究的所有临床样本，均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。

2、方法

标本处理用血清分离胶真空采血管采集静脉血2mL，先室温3000r/min离心10min，转移上层血清，再于4℃、16000×g离心10min，吸取上层无细胞血清分装每管200μL，置-70℃保存。上述操作于标本采集后2h内完成。以试剂盒中正常人AB血清为阳性对照，使用实施例3中ELISA试剂盒检测血液样本中LACC1和FHL2蛋白表达量相对正常人AB血清变化。

3、结果

结果显示，待筛查的20例前脊柱侧弯患者的血液样本中有7例患者样本中LACC1和FHL2蛋白表达量和正常人AB血清中表达量无显著差异；有13例患者血液样本中LACC1和FHL2蛋白表达量是正常人AB血清中表达量的60％以下，其中有9例患者血液样本中LACC1和FHL2蛋白的表达量是正常人AB血清表达量的40％以下。经临床进一步检测，20例待筛查的患者中确诊9例前脊柱侧弯，这9例前脊柱侧弯患者与本发明制备的试剂盒检测结果一致。据此推断，本前脊柱侧弯的诊断试剂盒可以明确区分出前脊柱侧弯患者，并以此为临床提供诊断线索。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京赛尔达生物技术有限公司

<120> LACC1和FHL2基因在制备脊柱侧弯检测产品中的应用

<130> p16zjcw18

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggctctggtt cctgttcctc 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccaaataaat cacctcgccg c 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgcctggctg agaactgtg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtgccggtcc ttgtaagaca 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggctgttgtc atacttctca tgg 23