石斑鱼神经坏死病毒Coat基因、在大肠杆菌中表达方法及应用

摘要

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种石斑鱼神经坏死病毒Coat基因、在大肠杆菌中表达方法及应用。本发明通过石斑鱼神经坏死病毒Coat基因的获得，填补了石斑鱼神经坏死病毒Coat基因研究的空缺。同时根据石斑鱼神经坏死病毒Coat基因序列可以人工合成或转基因生物合成具有生物活性的重组蛋白，有助于我们了解石斑鱼神经坏死病毒基因制备疫苗，基因工程疫苗使用还可以大幅度降低养殖生产中药物的使用量，从根本上消除水产品的药物残留隐患，为消费者提供健康优质的绿色水产品。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种石斑鱼神经坏死病毒Coat基因、在大肠杆菌中表达方法及应用。

背景技术

鱼类病毒性神经坏死病(viral nervous necrosis，VNN)，是世界范围的一种鱼类流行性传染病，对仔鱼和幼鱼危害极大，严重者在一周内死亡率可达100％。由于其极高的传染性和危害性，被国际兽医组织(OIE)列为重要的鱼类病害(OIE，2001)。目前，该病在除非洲以外的国家和地区迅速蔓延，受感染的鱼类已达40余种，给各国海水养殖业造成了巨大的危害。导致该传染病的致病原为神经坏死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)，它属于诺达病毒科(Nodaviridae)中的β-诺达病毒属，是一种小RNA病毒。

石斑鱼是目前海水养殖鱼类中的高档优质鱼类。随着我国石斑鱼人工育苗技术的成熟和斜带石斑鱼苗种产业化大规模生产，成为重要的海水鱼类养殖品种。但这几年石斑鱼苗种期频繁发生神经坏死病毒病，引发苗种大量死亡，育苗成活率只有3～5％，有时不到1％，甚至全军覆没，造成巨大的经济损失外还常常导致苗种供不应求，影响养成生产。国内外学者从化学药物、生物疫苗、RNA干扰(RNAi)及养殖模式等方面对该病的防治进行了大量的研究，但是到目前为止仍然没有找到有效的防治措施。

对于鱼类的病毒病，最有效、安全且无环境副作用的首选免疫保护方法即疫苗的使用。经过疫苗的保护，养殖鱼类抵抗了各种病毒的侵染，使得集约化和工厂化的高密度水产养殖的持续稳定发展成为可能。目前进口水产疫苗产品多来源于真核表达系统生产亚单位疫苗，价格昂贵，生产能力和销售价格远远不能满足中国市场需求，不适合于我国海水养殖生产中推广，而国内目前还没有可用的石斑鱼神经坏死病毒的疫苗产品。

传统疫苗(减毒疫苗、灭活疫苗)存在安全性和保护效果差的缺点。

发明内容

本发明针对传统疫苗的不足，提供一种通过基因工程手段研发的重组蛋白和重组DNA技术的新一代疫苗克服了传统疫苗的种种缺陷，本发明旨在提出一种石斑鱼神经坏死病毒Coat基因、在大肠杆菌中表达方法及应用。

本发明的技术方案是：

一种石斑鱼神经坏死病毒Coat基因，其序列全长为1433bp，核苷酸序列如SIDNO:1。

本发明的再一个目的在于公开了一种石斑鱼神经坏死病毒Coat蛋白，其氨基酸序列如SID NO:2，全长为338aa，由上述的石斑鱼神经坏死病毒Coat基因通过大肠杆菌表达系统表达得到。

石斑鱼神经坏死病毒Coat基因全长1433bp，包括26bp的5’非翻译区(1-26bp)、1017bp的开放阅读框(27-1043bp)和390bp的3’非翻译区(1044-1433bp)，编码338个氨基酸；，序列中双下划线标示的atg为起始密码子，单下划线标示的taa为终止密码子。

本发明又一个目的在于上述的Coat蛋白在大肠杆菌系统中表达的方法，包括重组载体的构建、重组载体转化感受态细胞、菌种保存、诱导表达与鉴定。

优选的，所述表达载体为pET30a，所述感受态细胞为BL21(DE3)。

优选的，所述诱导表达的具体方法如下：

步骤1：取阳性克隆按1：100比例接种到含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，于摇床中37℃*200rpm生长过夜；

步骤2：第二天将上述菌液按1:100比例接种到含50μg/mL硫酸卡那霉素抗性的2LTB培养基中，放入摇床中37℃*200rpm生长至OD₆₀₀＝0.6-0.8时，将摇床温度降至15-25℃，1-3h后加入终浓度0.10-0.30mM>

步骤3：将诱导后的菌液于4℃*8000rpm离心15min弃上清，收集菌体，用磷酸盐缓冲液PBS重悬并重复离心过程以清洗菌体；放置于-20℃保存。

优选的，所的重组载体转化的具体方法如下：

步骤1：从-80℃冰箱中取出感受态细胞BL21(DE3)，并将其迅速置于冰水中，在冰上融化2-5min；

步骤2：融解后轻弹管壁1-2次以重悬细胞；将约100ng的表达载体质粒DNA直接加入感受态细胞中，轻微摇动混和随后置于冰水浴上30min；

步骤3：取出后放入水浴锅中：42℃，热激90s，热激完迅速放回冰水浴中3min；拿出后取200μL无抗性的LB液体培养基加入到已转化的感受态细胞中；

步骤4：放入摇床中37℃*195rpm生长1h，吸取50μL-80μL悬液均匀涂布含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板上，倒置、37℃培养过夜。

优选的，所述的菌株的保存及诱导表达的具体方法如下：

步骤1：从转化平板中挑取单克隆，加入4mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中；

步骤2：37℃*200rpm培养至OD₆₀₀为0.5-0.8，2-3小时；无菌条件下取出生长过程中样品测定OD₆₀₀值；

步骤3：取管中0.9mL的菌液与0.1mL80％无菌甘油混合，存于－80℃冰箱中；

步骤4：向试管培养液中加入终浓度0.375mM IPTG，放置37℃诱导4h。

优选的，所述鉴定采用SDS-PAGE和电镜观察法。

本发明的再一个目的在于公开一种抗石斑鱼神经坏死病毒的疫苗，含有上述石斑鱼神经坏死病毒Coat蛋白或其任意混合物。

本发明的最好一个目的在于公开一种上述的石斑鱼神经坏死病毒Coat基因在抗石斑鱼神经坏死病毒中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明通过石斑鱼神经坏死病毒Coat基因的获得，填补了石斑鱼神经坏死病毒Coat基因研究的空缺。同时根据石斑鱼神经坏死病毒Coat基因序列可以人工合成或转基因生物合成具有生物活性的重组蛋白，有助于我们了解石斑鱼神经坏死病毒基因制备疫苗，基因工程疫苗使用还可以大幅度降低养殖生产中药物的使用量，从根本上消除水产品的药物残留隐患，为消费者提供健康优质的绿色水产品。

本发明蛋白的诱导表达过程中对温度、转速、IPTG的浓度和时间进行了优化，诱导时温度为15-25℃、IPTG浓度为0.10-0.30mM、诱导时间为16h，可增加重组蛋白的溶解性，有利于蛋白折叠形成正确的构型，从而具有生物学活性。

附图说明

附图1为SDS-PAGE分析Coat蛋白于BL21(DE3)表达情况；

Lane M：SDS-PAGEProtein marker；Lane 0：对照；Lane 1:15℃诱导过夜；Lane 2:37℃诱导4h；

附图2为电镜观察比较VLP与NNV病毒结构，(A)为NNV病毒结构，(B)为VLP蛋白结构；

附图3为SDS-PAGE分析Coat蛋白上清纯化结果；

Lane M：SDS-PAGEProtein marker；Lane 1：全菌破菌离心后上清；Lane 2：上清同Ni-IDA孵育后流出液；Lane 3-4：50mM咪唑的BufferA(不含TritonX-100)洗脱液；Lane 5-6：100mM咪唑的BufferA(不含TritonX-100)洗脱液；Lane 7-10：300mM咪唑的BufferA(不含TritonX-100)洗脱液；Lane 11-12：500mM咪唑的BufferA(不含TritonX-100)洗脱液；

附图4为Coat蛋白浓度测定标准曲线；

附图5为抗体检测效果曲线。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术

人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1：石斑鱼神经坏死病毒Coat基因设计与优化采用德泰生物最新开发的密码子优化软件Max Codon TMO ptimization Program(V13)，目标蛋白Coat最终优化的结果，其序列全长为1433bp，其核苷酸序列如SIDNO:1。

实施例2：石斑鱼神经坏死病毒Coat蛋白表达与纯化

1、Coat蛋白表达与鉴定

1.1表达载体的转化

步骤1：从-80℃冰箱中取出感受态细胞BL21(DE3)，并将其迅速置于冰水中，在冰上融化2-5min。

步骤2：融解后轻弹管壁1-2次以重悬细胞。将约100ng的表达载体质粒DNA直接加入感受态细胞中，轻微摇动混和随后置于冰水浴上30min(此时可以准备42℃水浴锅)。

步骤3：取出后放入水浴锅中(42℃)，热激90s；热激完迅速放回冰水浴中3min；拿出后取200μL无抗性的LB液体培养基加入到已转化的感受态细胞中。

步骤4：放入摇床(37℃*195rpm)中生长1h，吸取50μL-80μL悬液均匀涂布含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板中，倒置、37℃培养过夜。

1.2菌株的保存及诱导表达

步骤1：从转化平板中挑取3个单克隆，加入4mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，编号为标记为“0”“1”“2”。

步骤2：37℃*200rpm培养至OD₆₀₀约为0.5-0.8(通常需要2－3小时)。生长过程中无菌条件下取出样品测定OD₆₀₀值。

步骤3：取“1”“2”号管中各0.9mL的菌液与0.1mL80％无菌甘油混合，存于－80℃冰箱中。

步骤4：向试管培养液中加入终浓度0.375mM IPTG(“0”对照组不加IPTG)，通常“0”“1”放置15℃诱导过夜，“2”放置37℃诱导4h。

1.3SDS-PAGE鉴定诱导表达结果

步骤1.分别取“0”“1”“2”试管中各400-600μL培养液12000rpm*10min*4℃离心，去除上清液，加入500μL ddH₂O重悬菌体，并再次12000rpm*10min*4℃离心，去除上清液。

步骤2.加入50μL的磷酸盐缓冲液(PBS)混合以重悬沉淀。

步骤3.加入50μL的2×SDS上样缓冲液迅速在100℃加热样品15min使蛋白变性，然后12000rpm*5min*4℃离心取上清电泳。电泳前10min100V稳压电泳，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后，200V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶用考马斯亮兰染色液染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰。如图1所述。

1.4电镜观察蛋白形态

取神经坏死病毒NNV与表达出的蛋白VLP制片，并于电镜下观察两者形态如图2，结果发现两者大小和形态极为相似。

1.5Coat蛋白放大培养

步骤1：取“1”和“2”保种的菌种按1:100比例接种到含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，于摇床中(37℃*200rpm)生长过夜

步骤2：第二天将上述菌液按1:100比例接种到含50μg/mL卡那霉素抗性的2L TB培养基中，放入摇床中(37℃*200rpm)生长至OD₆₀₀＝0.6～0.8时，将摇床温度降至15-25℃，约1-3h后加入终浓度0.10-0.30mM>

步骤3：将诱导后的菌液于4℃*8000rpm离心15min弃上清，收集菌体，用磷酸盐缓冲液PBS重悬并重复离心过程以清洗菌体；放置于-20℃保存。(如果收菌当天不纯化的话，放置于-20℃)

2、Coat蛋白纯化

2.1Coat蛋白上清纯化(整个纯化过程在低温下操作)

步骤1：用BufferA：50mMTris，150mM NaC，1mM DTT，1％TritonX-100，1μg/mLPepstatin A，1μg/mL Leupeptin，20mM咪唑，pH8.0重悬菌泥(通常裂解液用量为10-15mL/g菌泥)

步骤2：超声裂解，用500W功率，在冰浴中进行超声，每超声3s，间歇6s，总计15min，结束在显微镜下观察破碎结果。(根据破碎结果可适当调节破碎时间)

步骤3：13000rpm*30min*4℃离心保留上清，并用0.45um滤膜过滤

步骤4：用BufferB:50mM Tris，150mM NaCl，20mM咪唑，pH8.0平衡3mL Ni-IDA柱，平衡约5-10CV直至紫外示数达到基线

步骤5：将3步过滤的上清同平衡后的Ni-IDA柱混合后置于旋转混合仪上于4℃孵育60-80min

步骤6：用一空的层析柱截留含有Coat蛋白的Ni-IDA柱，并用Buffer B冲洗10-20CV，流速控制在1.0mL/min，直至紫外示数达到基线

步骤7：用分别含有50mM、100Mm、300mM咪唑以及500mM咪唑的Buffer B洗脱目标蛋白，流速控制在1.5mL/min，并收集每个咪唑梯度的洗脱液组分

步骤8：取每个组分20μL加入20μL的2×SDS上样缓冲液迅速在100℃加热样品10min使蛋白变性，然后12000rpm*5min*4℃离心取上清电泳。电泳前10min100V稳压电泳，之后溴酚蓝指示剂进入分离胶200V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm,取出凝胶用考马斯亮兰染色液染色,随后转入脱色液中，脱色至背景清晰。(在平衡Coat蛋白得率和纯度的时，可通过适当地减少Ni-IDA柱体积以获得高纯度的目标蛋白)如图3所述。

3Coat蛋白透析分装

3.1将上述收集的目标蛋白用3.5kDa透析袋透析到500mL Buffer C：1×PBS，10％Glycerol，pH 7.4中，用磁力搅拌器4℃旋转，每隔2h换液一次，总计换液4次。

3.2透析结束后用0.22um膜过滤，并分装冻于-80℃。

4.Coat蛋白质检

4.1Coat蛋白稳定性测试(冻融实验)

取一支分装后冻于-80℃的Coat蛋白，放置于冰水混合物中待其缓慢融化，融化后无明显悬浮物并且13000rpm*30min*4℃离心亦无沉淀，说明Coat蛋白冻融实验是正常的。

4.2Coat蛋白浓度测定

测定蛋白浓度采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。其标准曲线如图4所示。测得其OD＝0.275，最终换算浓度为0.380mg/mL。

实施例3：

将实施例2获得石斑鱼神经坏死病毒Coat蛋白制成疫苗VLP直接注射鱼体，选择大小为4-6cm的鱼体。

注射方式为肌肉注射；VLP注射量为0.2-8.5μg/g鱼；

VLP7D代表VLP注射后鱼体7天取血检测抗体水平，VLP14D代表14天后取血检测抗体水平，NNV7D代表鱼体注射神经坏死病毒(NNV)7天后取血检测抗体水平，NNV14D代表鱼体注射神经坏死病毒(NNV)14天后取血检测抗体水平(NNV相当于阳性对照)，对照7d代表注射生理盐水7天取血，对照14d代表注射生理盐水14天取血检测抗体水体。

抗体检测效如图5所示：注射VLP跟NNV病毒液抗体效价都达到几万，对照组抗体效价为90左右，说明本发明制备的VLP疫苗能够和病毒原液产生几乎相同的效价。