斜带石斑鱼神经坏死病毒基因组序列测定与分析及其主衣壳蛋白基因的克隆、表达和免疫保护研究

摘要

鱼类神经坏死病毒(viral nervous necrosis)分类上属于诺达病毒科(Nodaviridae)β诺达病毒属(Betanodaviruses),是多种养殖鱼类的重要病原.该文从患病毒性神经坏死病的斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)脑和眼中制备病毒液,感染SSN-1细胞系,用感染了病毒的细胞提取总RNA做模板.并根据GenBank数据库公布的同源序列设计了7对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增出目的片断,将PCR产物测序和分析.斜带石斑鱼神经坏死病毒(orange-spotted nervous necrosis virus,OGNNV)基因组由两个片断(RNA1和RNA2)组成,RNA1由3103个核苷酸组成,含有一个开放阅读框(ORF),编码982个氨基酸RNA2由1433个核苷酸组成,含有一个ORF,编码338个氨基酸.OGNNV基因组与新加坡GGNNV(greasy grouper NNV)的基因组有高度的相似性.根据OGNNV的RNA2的ORF核苷酸序列,设计了一对特异性引物,采用RT-PCR扩增了OGNNV的主衣壳蛋白(MCP)基因.将分别经柱层析和SDS-PAGE纯化的融合蛋白作抗原,免疫新西兰兔制备了多克隆抗体.将受OGNNV感染濒死鱼的脑和视网膜组织进行H&E染色后观察,发现脑组织和视网膜神经细胞坏死、细胞空泡化.地高辛核酸探针进行原位杂交,发现脑组织各个部分和视网膜神经细胞层可被标记.

目录

文摘

英文文摘

第一章鱼类病毒性神经坏死病毒概述(文献综述)

1鱼类神经坏死病毒的命名和系统分类

2受NNV感染的鱼类及地理分布

3 NNV的理化性质

4鱼类患VNN临床症状

5组织病理学

6 VNN的诊断方法

7人工感染试验

8存在的问题及研究趋势

第二章斜带石斑鱼神经坏死病毒基因组序列测定与分析

1材料

2方法

3结果与分析

3.1 0GNNV基因组序列片断的RT-PCR扩增

3.2 OGNNV基因组特征

3.3 OGNNV在公共数据库(GenBank)中的序列号码

3.4 OGNNV的RNAs二级结构预测

3.5主农壳蛋白基因(MCP)

3.6依赖RNA的RNA聚合酶基因(RdRp)

3.7 5’端和3’端非编码区(NCR)

4讨论

5小结

第三章OGNNV系统进化分析

1材料

2方法

3结果与分析

3.1 RdRp系统树

3.2 MCP系统树

3.3 MCP T4片断系统树

3.4 T2片断系统树

4讨论

4.1系统进化分析

4.2 OGNNV与RGNNV血清型其它种类的关系

5小结

第四章斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白基因重组表达质粒pET32a-MCP的构建

1材料

2方法

3结果与分析

3.1 OGNNV的MCP基因的PCR扩增

3.2重组质粒pET32a-MCP的构建

3.3重组质粒pET32a-MCP的序列测定与序列分析

4讨论

5小结

第五章OGNNV MCP基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化

1材料

2方法

3结果与分析

3.1 OGNNV MCP基因在BL21宿主菌中的融合表达及Western-blot检测

3.2重组菌的初步筛选

3.3表达产物的可溶性分析

3.4包涵体的提取

3.5融合蛋白的纯化

3.6重组菌在不同培养条件下的诱导表达

4讨论

5小结

第六章OGNNV的MCP基因融合表达蛋白多克隆抗体的制备

1材料

2方法

3结果与分析

3.1 ELISA检测抗血清效价

3.2 Western-blot检测抗血清特异性

3.3多克隆抗体的纯化

4讨论

5小结

第七章斜带石斑鱼的免疫保护试验

1材料

2方法

3结果与分析

3.1人工感染试验

3.2主动免疫

3.3中和试验

3.4被动免疫

4讨论

5小结

全文总结

参考文献

缩略词

博士期间发表论文及其它成果

致谢

原创性声明