一种含多肽靶向因子的多糖衍生物及其制备方法

摘要

本发明公开了一种含多肽靶向因子的多糖衍生物及其制备方法，所述多糖衍生物是以多肽靶向因子以及含有3‑二甲胺基丙胺基团的多糖衍生物为原料，在室温下通过巯基‑烯点击化学反应制备得到。本发明所述含多肽靶向因子的多糖衍生物的制备方法反应条件温和，避免使用强酸强碱试剂，能最大程度地保持多肽和多糖的生物活性，且制备工艺简单，操作方便，所需设备及原材料廉价。本发明制备得到的含多肽靶向因子的多糖衍生物将可用作对病灶部位具有靶向运输性能的药物或基因载体，因而在生物医学领域具有一定的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体地，涉及一种含多肽靶向因子的多糖衍生物及其制备方法。

背景技术

多糖是一类由不同糖单元通过糖苷键连接而成的天然高分子，它广泛地存在于自然界中，安全无毒，具有非常好的生物相容性和生物降解性，所以，多糖在生物医用材料领域备受关注，显示出较好的应用前景和研究价值。目前研究较为广泛的多糖包括淀粉葡聚糖、纤维素、壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸等。多糖链上含有羟基、氨基、羧基等活性官能团，通过化学反应可合成出不同结构及功能的多糖衍生物，这样更加能够提升多糖在生物医用材料领域的应用价值。例如在药物和基因传输领域多糖衍生物可用作载体以提高治疗效果，在组织工程领域多糖衍生物可作为支架材料促进组织或器官的形成。（Yifen W., etal, Macromolecular Rapid Communications, 2014, 35, 1819−1832）。

近年来，多糖的阳离子化改性引起了人们广泛的研究兴趣。这是因为生物体中细胞表面带有负电荷，阳离子化后的多糖呈正电荷，可以通过静电相互作用进入细胞。根据这一特性，阳离子多糖可作为载体将药物或基因运入细胞体内，从而起到治疗疾病的作用（如专利：一种阳离子超支化多糖衍生物及其在增强血卟啉类光敏剂对肿瘤细胞光毒性方面的应用，公开号：CN105949344A）。为了增强药物或基因载体对病灶部位的靶向运输性能，通常在多糖衍生物载体上偶联靶向因子基团，通过靶向因子基团与病灶组织细胞中受体存在特异性的识别作用，而增强多糖衍生物对病灶部位的靶向运输性能。例如，在癌细胞中叶酸受体普遍过度表达，所以，含叶酸靶向因子的葡聚糖衍生物可以通过叶酸基团与癌细胞上的叶酸受体的特异性结合而体现出对癌细胞靶向作用（Nakamura J., et al, AnticancerResearch, 2010, 30, 903−910）。此外，由于一些病灶组织细胞中存在过度表达的蛋白受体，因此，可寻找一些多肽作为这些蛋白受体的靶向因子，将其偶联到多糖链上，合成含有多肽靶向因子的阳离子多糖衍生物，以获得更好的病灶部位靶向运输性能。

然而，由于多肽和多糖均为具有生物活性的物质，且多肽和多糖的性质差异，合成含有多肽靶向因子的多糖衍生物后，往往会破坏多肽和多糖的活性，无法实现预期目标，因此，探寻一种特殊合适的方法合成含有多肽靶向因子的多糖衍生物，使得多肽和多糖的活性不被破坏，具有重要的意义。而目前现有技术中未见有相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有含有多肽靶向因子的多糖衍生物合成技术的缺陷和不足，提供一种含有多肽靶向因子的多糖衍生物的制备方法，所制备得到的含多肽靶向因子的多糖衍生物可以作为药物或基因传输载体，以增强多糖衍生物对病灶部位的靶向运输性能。

本发明的目的是提供一种含多肽靶向因子的多糖衍生物。

本发明的另一目的是提供上述含多肽靶向因子的多糖衍生物的制备方法。

本发明的上述目的是用过以下技术方案给予实现的：

一种含多肽靶向因子的多糖衍生物的制备方法，是以多肽靶向因子和含有3-二甲胺基丙胺基团的多糖衍生物为原料，在室温下通过巯基-烯点击化学反应制备得到含多肽靶向因子的多糖衍生物。

优选地，所述多肽靶向因子为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽（RGD）、细胞膜穿透肽（TAT、PTD-4）或生长抑素（SST-14）。

优选地，所述多糖为葡聚糖、普鲁兰、糖原或壳聚糖。

优选地，所述多肽靶向因子基团的取代度为0.1～0.5。

优选地，所述3-二甲胺基丙胺基团的取代度为0.5～1.5。

具体地，上述含多肽靶向因子的多糖衍生物的制备方法，包括如下步骤：

S1.按照3-二甲胺基丙胺基多糖衍生物：除水有机溶剂=0.1～1.0g：5～20mL的比例，向3-二甲胺基丙胺基多糖衍生物中加入除水有机溶剂，在惰性气体保护下室温搅拌溶解，得到3-二甲胺基丙胺基多糖衍生物溶液；

S2.按照3-二甲胺基丙胺基多糖衍生物：弱碱催化剂=0.1～1.0g：0.1～1mL的比例，向步骤S1所得溶液中缓慢滴加弱碱催化剂，在惰性气体保护下，室温活化反应；

S3.向步骤S2的溶液中缓慢滴加含碳碳双键基团试剂，在惰性气体保护下，室温搅拌反应；所述含碳碳双键基团试剂与弱碱催化剂等体积；

S4.步骤S3的反应液经过透析、冷冻干燥，得到含碳碳双键基团的3-二甲胺基丙胺基多糖衍生物；

S5.按照含碳碳双键基团的3-二甲胺基丙胺基多糖衍生物：纯水=0.1～1.0g：5～20mL的比例，向多糖衍生物中加入纯水，室温搅拌溶解，得到含碳碳双键基团的3-二甲胺基丙胺基多糖衍生物溶液；

S6.按照含碳碳双键基团的3-二甲胺基丙胺基多糖衍生物：含巯基的多肽试剂质量比为0.1～1：0.1～1的比例，向步骤S5的溶液中缓慢滴加含巯基的多肽试剂溶液，室温搅拌反应；

S7.步骤S6的反应液经过透析、冷冻干燥，得到含多肽靶向因子基团以及3-二甲胺基丙胺基团的多糖衍生物。

更优选地，上述含多肽靶向因子的多糖衍生物的制备方法，具体包括如下步骤：

S1.按照3-二甲胺基丙胺基多糖衍生物：除水有机溶剂=0.1～1.0g：5～20mL（优选0.1～1.0g：5～15mL）的比例，向3-二甲胺基丙胺基多糖衍生物中加入除水有机溶剂，在惰性气体保护下100～500r/min（优选200～500r/min）室温搅拌2～24小时溶解，得到3-二甲胺基丙胺基多糖衍生物溶液；

S2.按照3-二甲胺基丙胺基多糖衍生物：弱碱催化剂=0.1～1.0g：0.1～1mL的比例，向步骤S1所得溶液中缓慢滴加弱碱催化剂，在惰性气体保护下，100～500r/min（200～500r/min）室温活化反应10～60分钟；

S3.向步骤S2的溶液中缓慢滴加与弱碱催化剂等体积的含碳碳双键基团试剂，在惰性气体保护下，100～500r/min（优选200～500r/min）室温搅拌反应1～24小时；

S4.步骤S3的反应液用水透析1～5天，冷冻干燥，得到含碳碳双键基团的3-二甲胺基丙胺基多糖衍生物。

S5.按照含碳碳双键基团的3-二甲胺基丙胺基多糖衍生物：纯水=0.1～1.0g：5～20mL（优选0.1～0.5g：5～15mL）的比例，向多糖衍生物中加入纯水，100～500r/min（优选200～500r/min）室温搅拌1～24小时溶解，得到含碳碳双键基团的3-二甲胺基丙胺基多糖衍生物溶液；

S6.按照含碳碳双键基团的3-二甲胺基丙胺基多糖衍生物：含巯基的多肽试剂质量比为0.1～0.5：0.1～1的比例，向步骤S5的溶液中缓慢滴加含巯基的多肽试剂溶液，100～500r/min（优选200～500r/min）室温搅拌反应1～24小时；所述含巯基的多肽试剂溶液的组分为含巯基的多肽试剂：纯水=0.1～0.5g：1～10mL；

S7.步骤S6的反应液用水透析1～5天，冷冻干燥，得到含多肽靶向因子基团以及3-二甲胺基丙胺基团的多糖衍生物。

优选地，步骤S1所述3-二甲胺基丙胺基多糖衍生物为含3-二甲胺基丙胺基团的葡聚糖衍生物、含3-二甲胺基丙胺基团的普鲁兰衍生物、含3-二甲胺基丙胺基团的糖原衍生物、含3-二甲胺基丙胺基团的壳聚糖衍生物，其制备方法可参照专利（一种阳离子超支化多糖衍生物及其在增强血卟啉类光敏剂对肿瘤细胞光毒性方面的应用，公开号：CN105949344A）。

优选地，步骤S1所述除水有机试剂为除水二甲基甲酰胺、除水乙酸乙酯、除水二氯甲烷或除水二甲基亚砜。

优选地，步骤S1、S2或S3所述惰性气体为氮气、氩气或氦气。

更优选地，步骤S1、S2或S3同时选择氮气、氩气或氦气。

优选地，步骤S2所述弱碱催化剂为吡啶、哌啶、三乙胺或乙酸钠。

优选地，步骤S3所述含碳碳双键基团试剂为丙烯酸、丙烯酸酐、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酸酐或甲基丙烯酰氯。

优选地，步骤S6所述多肽试剂为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽（RGD）、细胞膜穿透肽（TAT或PTD-4）或生长抑素（SST-14）。

另外，上述方法制备得到的含多肽靶向因子的多糖衍生物也在本发明的保护范围之内。

上述含多肽靶向因子的多糖衍生物在作为药物或基因传输载体上的应用，以及在制备药物或基因传输载体上的应用，也都在本发明的保护范围之内。

优选地，所述药物或基因传输载体可往病灶部位靶向运输。

本发明中的多肽和多糖均是具有生物学活性的物质，需要在比较温和的条件下反应才不会使的活性丧失。因此本发明选用巯基-烯点击化学法合成含多肽靶向因子的多糖衍生物，该合成法不使用金属催化剂，反应条件温和（如室温），能最大程度地保持多肽和多糖的生物活性，所制备得到的含多肽靶向因子的多糖衍生物可用作药物或基因的传输载体，以提高针对病灶部位靶向性治疗疾病的效果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明的工艺简单，操作方便，所需设备及原材料廉价。

（2）本发明涉及的化学反应简单，在室温即可反应，避免使用强酸强碱试剂，温和的反应条件可保证产物中多糖及多肽的生物活性不受影响。

（3）本发明制备得到的含多肽靶向因子的多糖衍生物可用作药物或基因载体，有利于携带药物或基因靶向到达病灶组织，以减少对正常细胞的毒副作用。

附图说明

图1为本发明制备含多肽靶向因子的多糖衍生物的工艺流程图。

图2为本发明含多肽靶向因子的多糖衍生物的合成路线图。

图3为本发明3-二甲胺基丙胺基糖原（DMAPA-Gly）及产物含RGD多肽靶向因子基团的糖原衍生物（RGD-DMAPA-Gly）的红外光谱图（FTIR）。

图4为本发明3-二甲胺基丙胺基糖原（DMAPA-Gly）及产物含RGD多肽靶向因子基团的糖原衍生物（RGD-DMAPA-Gly）的核磁谱图（¹H>

图5为含FITC荧光标记基团、TAT多肽基团以及含FITC-TAT多肽靶向因子基团以及3-二甲胺基丙胺基团的葡聚糖衍生物（FITC-TAT-DMAPA-DEX）靶向进入骨髓间质干细胞的共聚焦照片（标尺20µm）：（a）为FITC-TAT-DMAPA-DEX衍生物在骨髓间质干细胞中的分布，（b）Wie通过Hoechst 33258荧光试剂将细胞核染成蓝色的骨髓间质干细胞，（c）为通过LysoTracker Red DND-99荧光试剂将细胞膜、溶酶体等细胞器染成红色的骨髓间质干细胞，（d）为（a）、（b）和（c）的合并照片。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。

实施例1

1. 制备方法

本发明制备含多肽靶向因子的多糖衍生物的工艺流程图和合成路线图分别如图1和图2所示。

具体制备方法如下：

（1）称取0.1g 3-二甲胺基丙胺基糖原衍生物（DMAPA-Gly）加入至干燥的烧瓶中，加入10mL除水二甲基甲酰胺，在氮气保护下200r/min室温搅拌12小时溶解。

（2）用注射器缓慢滴加0.5 mL吡啶至步骤（1）所得溶液中，200r/min室温搅拌10分钟，随后用注射器缓慢滴加0.5 mL丙烯酸，在氮气保护下，200r/min室温搅拌反应24小时。

（3）去离子水透析反应液1天，冷冻干燥，得到含丙烯酸基团的3-二甲胺基丙胺基糖原衍生物（MAA-DMAPA-Gly）。

（4）称取0.5g含丙烯酸基团的3-二甲胺基丙胺基糖原衍生物加入至干燥的烧瓶中，加入5mL纯水，200r/min室温搅拌24小时溶解。

（5）称取0.5g 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）多肽加入至干燥烧瓶中，加入1 mL纯水溶解，向步骤（4）的溶液中缓慢滴加RGD溶液1 mL，200r/min室温搅拌反应8小时；

（6）去离子水透析反应液1天，冷冻干燥，得到含RGD多肽靶向因子基团以及3-二甲胺基丙胺基团的糖原衍生物（RGD-DMAPA-Gly）。

2. 结果

（1）图3为3-二甲胺基丙胺基糖原原料（DMAPA-Gly）以及衍生物的FTIR谱图，从图3b可看出偶联了丙烯酸的3-二甲胺基丙胺基糖原衍生物（MAA-DMAPA-Gly）在1630cm^-1出现了新吸收峰，归属为碳碳双键的伸缩振动峰，表明丙烯酸与3-二甲胺基丙胺基糖原发生偶联，同时1709>-1处氨基甲酸酯的羰基（C=O）特征峰还存在，表明衍生物的3-二甲胺基丙胺基团的性质并未受影响。

（2）图4为3-二甲胺基丙胺基糖原原料（DMAPA-Gly）以及衍生物的¹H>1H>1H>

（3）通过¹H>可计算出DMAPA-Gly衍生物中3-二甲胺基丙胺基团的取代度DS₁（即每个糖单元中偶联的配体基团数目）。通过元素分析法，得出RGD-DMAPA-Gly中N/S的重量比，根据公式可计算出RGD-DMAPA-Gly衍生物中RGD多肽基团的取代度DS₂。

式中，N(DMAPA)是DMAPA-Glyp衍生物中3-二甲胺基丙胺基团的数目，N(Glc)是DMAPA-Glyp衍生物中葡萄糖单元的数目，I(>CH2)是3-二甲胺基丙胺基团中亚甲基质子[(a)峰]的积分面积，I(H1)是DMAPA-Glyp衍生物中异头H1共振峰的积分面积。

式中N/S为RGD-DMAPA-Gly中氮元素与硫元素的重量比，M_N和M_S分别为氮和硫两种元素的原子质量，DS₁和DS₂分别为3-二甲胺基丙胺基团和多肽靶向因子取代度。

本实施例所得RGD-DMAPA-Gly衍生物中3-二甲胺基丙胺基团的取代度为1.7，RGD多肽的取代度为0.1。

实施例2

1. 制备方法

（1）称取0.4g 3-二甲胺基丙胺基壳聚糖衍生物加入至干燥的烧瓶中，加入5mL除水二氯甲烷，在氮气保护下300r/min室温搅拌24小时溶解。

（2）用注射器缓慢滴加0.1 mL三乙胺至步骤（1）所得溶液中，300r/min室温搅拌20分钟，随后用注射器缓慢滴加0.1 mL丙烯酸酐，在氮气保护下，300r/min室温搅拌反应1小时。

（3）去离子水透析反应液2天，冷冻干燥，得到含丙烯酸基团的3-二甲胺基丙胺基壳聚糖衍生物。

（4）称取0.1g含丙烯酸基团的3-二甲胺基丙胺基壳聚糖衍生物加入至干燥的烧瓶中，加入10mL纯水，300r/min室温搅拌1小时溶解。

（5）称取0.2g细胞膜穿透肽（TAT）加入至干燥烧瓶中，加入2 mL纯水溶解，向步骤（4）的溶液中缓慢滴加TAT溶液2 mL，300r/min室温搅拌反应12小时；

（6）去离子水透析反应液2天，冷冻干燥，得到含TAT多肽靶向因子基团以及3-二甲胺基丙胺基团的壳聚糖衍生物。

2. 结果

实验证明，本实施例成功合成了含TAT多肽靶向因子基团以及3-二甲胺基丙胺基团的壳聚糖衍生物，本实施例所得TAT-DMAPA-CHI衍生物中3-二甲胺基丙胺基团的取代度为1.0，TAT多肽的取代度为0.2。

实施例3

1. 制备方法

（1）称取1g 3-二甲胺基丙胺基普鲁兰衍生物加入至干燥的烧瓶中，加入10mL除水二甲基甲酰胺，在氩气保护下500r/min室温搅拌2小时溶解。

（2）用注射器缓慢滴加1.0 mL吡啶至步骤（1）所得溶液中，500r/min室温搅拌30分钟，随后用注射器缓慢滴加1.0 mL甲基丙烯酸，在氩气保护下，500r/min室温搅拌反应12小时。

（3）去离子水透析反应液3天，冷冻干燥，得到含甲基丙烯酸基团的3-二甲胺基丙胺基普鲁兰衍生物。

（4）称取0.2g含甲基丙烯酸基团的3-二甲胺基丙胺基普鲁兰衍生物加入至干燥的烧瓶中，加入15mL纯水，500r/min室温搅拌12小时溶解。

（5）称取1.0g 细胞膜穿透肽（PTD-4）加入至干燥烧瓶中，加入2 mL纯水溶解，向步骤（4）的溶液中缓慢滴加PTD-4溶液2 mL，500r/min室温搅拌反应1小时；

（6）去离子水透析反应液3天，冷冻干燥，得到含PTD-4多肽靶向因子基团以及3-二甲胺基丙胺基团的普鲁兰衍生物。

2. 结果

实验证明，本实施例成功合成了含PTD-4多肽靶向因子基团以及3-二甲胺基丙胺基团的普鲁兰衍生物，本实施例所得PTD-4-DMAPA-Pul衍生物中3-二甲胺基丙胺基团的取代度为1.5，PTD-4多肽的取代度为0.1。

实施例4

1. 制备方法

（1）称取1g 3-二甲胺基丙胺基葡聚糖衍生物加入至干燥的烧瓶中，加入15mL除水二氯甲烷，在氦气保护下200r/min室温搅拌10小时溶解。

（2）用注射器缓慢滴加0.5mL乙酸钠至步骤（1）所得溶液中，200r/min室温搅拌50分钟，随后用注射器缓慢滴加0.5 mL甲基丙烯酰氯，在氦气保护下，200r/min室温搅拌反应12小时。

（3）去离子水透析反应液5天，冷冻干燥，得到含甲基丙烯酸基团的3-二甲胺基丙胺基葡聚糖衍生物。

（4）称取0.5g含甲基丙烯酰胺基团的3-二甲胺基丙胺基葡聚糖衍生物加入至干燥的烧瓶中，加入5mL纯水，200r/min室温搅拌10小时溶解。

（5）称取0.1g生长抑素（SST-14）加入至干燥烧瓶中，加入10 mL纯水溶解，向步骤（4）的溶液中缓慢滴加SST-14溶液10 mL，200r/min室温搅拌反应24小时；

（6）去离子水透析反应液5天，冷冻干燥，得到含SST-14多肽靶向因子基团以及3-二甲胺基丙胺基团的葡聚糖衍生物。

2. 结果

实验证明，本实施例成功合成了含SST-14多肽靶向因子基团以及3-二甲胺基丙胺基团的葡聚糖衍生物，本实施例所得SST-14-DMAPA-DEX衍生物中3-二甲胺基丙胺基团的取代度为1.2，SST-14多肽的取代度为0.1。

实施例5

1. 制备方法

（1）称取0.2g 3-二甲胺基丙胺基普鲁兰衍生物加入至干燥的烧瓶中，加入5mL除水乙酸乙酯，在氦气保护下400r/min室温搅拌12小时溶解。

（2）用注射器缓慢滴加1.0 mL三乙胺至步骤（1）所得溶液中，400r/min室温搅拌60分钟，随后用注射器缓慢滴加1.0 mL丙烯酸，在氦气保护下，400r/min室温搅拌反应24小时。

（3）去离子水透析反应液5天，冷冻干燥，得到含丙烯酸基团的3-二甲胺基丙胺基普鲁兰衍生物。

（4）称取0.2g含丙烯酸基团的3-二甲胺基丙胺基普鲁兰衍生物加入至干燥的烧瓶中，加入10mL纯水，400r/min室温搅拌8小时溶解。

（5）称取0.8 g PTD-4加入至干燥烧瓶中，加入5 mL纯水溶解，向步骤（4）的溶液中缓慢滴加PTD-4溶液5 mL，400r/min室温搅拌反应12小时；

（6）去离子水透析反应液5天，冷冻干燥，得到含PTD-4多肽靶向因子基团以及3-二甲胺基丙胺基团的普鲁兰衍生物。

2. 结果

实验证明，本实施例成功合成了含PTD-4多肽靶向因子基团以及3-二甲胺基丙胺基团的普鲁兰衍生物，本实施例所得PTD-4-DMAPA-Pul衍生物中3-二甲胺基丙胺基团的取代度为1.0，PTD-4多肽的取代度为0.5。

实施例6

1. 制备方法

（1）称取0.2g 3-二甲胺基丙胺基葡聚糖衍生物加入至干燥的烧瓶中，加入5mL除水乙酸乙酯，在氦气保护下400r/min室温搅拌12小时溶解。

（2）用注射器缓慢滴加1.0 mL三乙胺至步骤（1）所得溶液中，400r/min室温搅拌60分钟，随后用注射器缓慢滴加1.0 mL丙烯酸，在氦气保护下，400r/min室温搅拌反应24小时。

（3）去离子水透析反应液5天，冷冻干燥，得到含丙烯酸基团的3-二甲胺基丙胺基葡聚糖衍生物。

（4）称取0.2g含丙烯酸基团的3-二甲胺基丙胺基葡聚糖衍生物加入至干燥的烧瓶中，加入10mL纯水，400r/min室温搅拌8小时溶解。

（5）称取1.0 g FITC-TAT加入至干燥烧瓶中，加入5 mL纯水溶解，向步骤（4）的溶液中缓慢滴加FITC-TAT溶液5 mL，400r/min室温搅拌反应12小时；

（6）去离子水透析反应液5天，冷冻干燥，得到含FITC-TAT多肽靶向因子基团以及3-二甲胺基丙胺基团的葡聚糖衍生物。

2. 结果

实验证明，本实施例成功合成了含FITC-TAT多肽靶向因子基团以及3-二甲胺基丙胺基团的葡聚糖衍生物，本实施例所得TAT-DMAPA-DEX衍生物中3-二甲胺基丙胺基团的取代度为2.0，TAT多肽的取代度为0.1。

实施例7 含多肽靶向因子多糖衍生物的应用

经过试验验证，本发明的方法所制备的含多肽靶向因子多糖衍生物均能最大程度地保持多肽和多糖的生物活性，可用作对病灶部位具有靶向运输性能的药物或基因载体。

以下以实施例6制备的含FITC-TAT多肽靶向因子基团以及3-二甲胺基丙胺基团的葡聚糖衍生物（FITC-TAT-DMAPA-DEX）为例，呈现实验数据如下：

图5为含FITC-TAT多肽靶向因子基团以及3-二甲胺基丙胺基团的葡聚糖衍生物（FITC-TAT-DMAPA-DEX）进入骨髓间质干细胞的共聚焦照片。可观察到该衍生物已进入骨髓间质干细胞，主要分布在细胞膜、细胞质和细胞核膜中，表明该衍生物对骨髓间质干细胞具有较好靶向性，这与TAT肽能穿透骨髓间质干细胞膜的性能有关。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。