表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系及其构建方法与应用

摘要

本发明提供一种能够稳定表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系，其为导入携带有山羊SLAM基因的真核表达载体的Vero‑E6细胞系。本发明成功构建了表达小反刍兽疫病毒的山羊SLAM受体的Vero‑E6细胞系，接种小反刍兽疫病料后，可在48h出现明显细胞病变。该细胞系不但可用于小反刍兽疫病毒的分离和鉴定，还能够有效缩短分离病毒的时间，并可提高病毒的产量，有望应用于大规模生产疫苗。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及能够稳定表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系及其构建方法与应用。

背景技术

小反刍兽疫(peste des petits ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(pestedes petits ruminants virus，PPRV)引起的一种严重的烈性、接触性传染病，特征为发热、口腔及舌黏膜糜烂、流泪、流鼻涕、腹泻和肺炎。该病是世界动物卫生组织(OIE)法定报告的动物疫病，我国将其列入一类动物疫病。2013年12月新疆暴发小反刍兽疫以来，我国各地相继出现小反刍兽疫疫情，因此PPR防控显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供能够稳定表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系及其构建方法。

本发明的另一目的是提供所述能够稳定表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系在小反刍兽疫病毒的分离及其疫苗生产中的应用。

为了便于研究淋巴细胞活化分子(SLAM)在Vero-E6细胞膜上的表达及其在分离病毒中的作用机制，本发明利用pDisplay载体使SLAM基因与其含有鼠Igk引导序列的基因形成融合基因，pDisplay载体大小为5.3kb，能在哺乳动物细胞表面表达蛋白，能稳定准确地在细胞表面表达所需的目的蛋白，因此表达的重组蛋白组成几乎与原蛋白一致。此外，利用pDisplay载体的G418抗性，筛选培养出转染重组pDisplay载体的细胞株。G418是一种氨基糖苷类抗生素，在分子遗传试验中常被用作选择性标记基因抗性筛选。它对原核细胞和真核细胞均具有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞等。当neo基因被整合进真核细胞DNA后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物的高效表达，使细胞获得抗性而能在含G418的选择性培养基中生长，与阳性细胞克隆的筛选有着直接的关系。G418这一选择特性，已在基因转移、抗性筛选等方面得以广泛应用。并且，由于该载体N-端带有禽流感病毒HA标签蛋白，可用于阳性细胞系的筛选。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种重组质粒pDisplay-gSLAM，所述重组质粒是携带有山羊SLAM基因的真核表达载体pDisplay。其中，所述山羊SLAM基因插入到载体pDisplay的Sma I和Sac II酶切位点之间。

本发明还提供能够稳定表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系gSLAM/Vero-E6，其为导入携带有山羊SLAM基因的真核表达载体的Vero-E6细胞系(或BHK-21细胞系)。

所述携带有山羊SLAM基因的表达载体为上述重组质粒pDisplay-gSLAM。

本发明中涉及的山羊SLAM基因，其GenBank登录号为NM_204596。

本发明还提供所述细胞系gSLAM/Vero-E6的构建方法，包括Vero-E6细胞的转染、细胞阳性克隆的筛选及鉴定等步骤。用含G418的DMEM培养基筛选细胞阳性克隆，并通过间接免疫荧光法和/或Western blot法进行阳性克隆的鉴定。

在本发明的一个具体实施方式中，所述细胞系的构建方法，包括以下步骤：

⑴山羊外周血淋巴细胞的分离

无菌颈静脉采集山羊抗凝血，使用红细胞裂解液，按说明书操作分离得到外周血淋巴细胞；

⑵山羊SLAM基因PCR扩增

经ConA(伴刀豆蛋白)刺激后，按照RNA提取试剂盒说明书操作提取山羊外周血淋巴细胞的总RNA，用Random Primer(6mer)pd(N)6反转录引物合成cDNA第一链后，用引物对SLAM-F/R(SEQ ID NO:1-2)扩增全长SLAM基因；

上游引物SLAM-F:5′-CACCCCTTATCCTCACTGG-3′

下游引物SLAM-R:5′-CAGAGAGCTGACATCACAGACTT-3′

⑶重组表达载体pDisplay-gSLAM的构建及在Vero-E6细胞上的表达；

再用引物对SLAM-UP/DOWN(SEQ ID NO:3-4)扩增不含信号肽的山羊SLAM基因；

上游引物SLAM-UP:5′-TCCCCCGGGTTGACCAGTTCCACAA AGA-3′(Sma I)

下游引物SLAM-DOWN:5′-ACGCGTCGACTAGTCCCCATTGT CTTGATTCT-3′(Sac II)

PCR产物及pDisplay真核表达载体经Sma I和Sac II双酶切，进行连接，构建表达山羊SLAM基因的重组质粒pDisplay-gSLAM；

⑷Goat-SLAM/Vero-E6细胞阳性克隆的筛选和培养

将pDisplay-SLAM重组质粒转染细胞后，用含800μg/mL G418的DMEM培养基(含2％FBS)连续培养周后，换为含600μg/mL G418的DMEM培养基(含10％FBS)进行单细胞的克隆和扩大培养。将扩大培养的细胞按常规进行消化、传代，连续培养4周后对细胞进行冻存、复苏。反复冻存、复苏3次后，采用间接免疫荧光法和Western blot法检测山羊SLAM基因的表达情况。细胞系在山羊淋巴细胞活化分子稳定表达的初期要使用含600μg/mL G418的DMEM培养基(含10％FBS)，来稳定受体的表达。在稳定表达的后期，降低G418在DMEM培养基中的浓度，直至不添加G418。将不同时期稳定表达SLAM受体的细胞系冻存于液氮中。

本发明进一步提供所述细胞系gSLAM/Vero-E6在小反刍兽疫病毒的分离及其疫苗生产中的应用。

用gSLAM/Vero-E6细胞系对小反刍兽疫病毒进行分离情况如下：

将铺满单层的gSLAM/Vero-E6细胞系传代后，经37℃5％CO₂过夜培养，细胞汇合度达80～90％时，吸附TCID50为4.5的野生型和疫苗株(Nigeria>

本发明成功构建了表达小反刍兽疫病毒的山羊SLAM受体的Vero-E6细胞系Goat-SLAM/Vero-E6，接种小反刍兽疫病料后，可在48h出现明显细胞病变，并采用qRT-PCR方法检测基因SLAM的表达情况。Goat-SLAM/Vero-E6细胞系不但可用于小反刍兽疫病毒的分离和鉴定，还能够有效缩短分离病毒的时间，并可提高病毒的产量，有望应用于大规模生产疫苗。

附图说明

图1为本发明实施例1中山羊全长SLAM基因的克隆结果。

图2为本发明实施例1中克隆载体pEASY-T5-gSLAM的酶切鉴定结果。

图3为本发明实施例1中表达载体pDisplay-gSLAM的酶切鉴定结果。

图4为本发明实施例1中gSLAM/Vero-E6细胞系的基因组RT-PCR检测SLAM基因表达情况。

图5为本发明实施例1中gSLAM/Vero-E6细胞系的间接免疫荧光鉴定结果。其中，A:gSLAM/Vero-E6细胞系的间接免疫荧光鉴定SLAM的表达图；B:正常Vero-E6细胞的间接免疫荧光鉴定图。

图6为本发明实施例1中gSLAM/Vero-E6细胞系SLAM表达的Western blot鉴定结果。其中，1:正常Vero-E6细胞膜蛋白；2:gSLAM/Vero-E6细胞膜蛋白。

图7为本发明实施例2中比较PPRV在gSLAM/Vero-E6细胞和正常Vero-E6细胞上产生病变的情况。其中，A、B分别是野生型和疫苗株PPRV在Goat-SLAM/Vero-E6细胞上病变情况；D、E分别是野生型和疫苗株在Vero-E6细胞上病变情况；C、F分别是gSLAM/Vero-E6细胞和正常Vero-E6细胞的对照。

图8为本发明实施例2中比较PPRV在gSLAM/Vero-E6细胞和正常Vero-E6细胞的增殖情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 gSLAM/Vero-E6细胞系的建立

1.山羊淋巴细胞的分离

颈静脉采取山羊血液于抗凝管中，预冷的红细胞裂解液与新鲜抗凝血，按1:3的比例向细胞沉淀中加入红细胞裂解液混匀。1000rpm离心5min，离心弃去上层红色液体。收集沉淀部分，加无血清培养液离心洗3次后，用含10％FBS的DMEM培养基(完全培养基)置于平皿中加入ConA刺激过夜。

2.山羊SLAM基因的RT-PCR扩增

收集ConA刺激后的淋巴细胞，经计数后直接加入离心管，3000rpm室温离心，去上清。按照总RNA提取试剂盒说明书操作提取山羊外周淋巴细胞的总RNA，应用Random Primer(6mer)pd(N)6反转录引物合成cDNA第一链后，用引物对SLAM-F/R扩增全长SLAM基因。

上游引物SLAM-F:5′-CACCCCTTATCCTCACTGG-3′

下游引物SLAM-R:5′-CAGAGAGCTGACATCACAGACTT-3′

扩增的山羊SLAM基因的琼脂糖凝胶电泳结果见图1。将产物回收后，将其克隆至pBlunt zero T5载体(北京全式金生物技术有限公司，货号CT501-01)；挑取阳性重组质粒pEASY-T5-gSLAM用BamH I和Spe I酶切后，产物经1％琼脂糖电泳，可见在约300、4000bp处各出现1条带，与预期目的条带一致(图2)。然后将阳性重组质粒送至北京金唯智生物科技有限公司测序。测序结果表明，成功克隆了SLAM基因。

3.重组表达载体pDisplay-gSLAM的构建

以pEASY-T5-gSLAM质粒为模板，再用引物对SLAM-UP/DOWN扩增不含信号肽的山羊SLAM基因。

上游引物SLAM-UP:5′-TCCCCCGGGTTGACCAGTTCCACAA AGA-3′(Sma I)

下游引物SLAM-DOWN:5′-ACGCGTCGACTAGTCCCCATTGT CTTGATTCT-3′(Sac II)

PCR产物及pDisplay真核表达载体经Sma I和Sac II双酶切，进行连接，构建表达山羊SLAM基因的重组质粒pDisplay-gSLAM。重组质粒pDisplay-gSLAM经Sma I和Sac II双酶切得到约900bp和5300bp大小的片段，大小与理论值完全相符(图3)。经测序分析，结果与预期完全一致。

4.稳定表达山羊SLAM细胞系的筛选和培养

将测序正确的pDisplay-gSLAM重组质粒用Promega无内毒素质粒中提试剂盒，按照说明书提质粒。测定质粒浓度，将pDisplay-gSLAM质粒加入到无血清的Opti-MEM溶液中，再加入Roche转染试剂X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent(Cat.No.06 366 236001)，约200μl混合物于室温孵育15min后逐滴加入汇合度90％的单层Vero-E6细胞的6孔板中。设置正常细胞培养孔为对照。将6孔板置于37℃、5％CO₂培养箱培养48h后，提取细胞基因组，用RT-PCR方法(图4)检测基因SLAM的表达情况，同时采用间接免疫荧光法鉴定蛋白的表达情况。采用上述相同的方法转染细胞后，用含800μg/mL>

实施例2 gSLAM/Vero-E6细胞系的应用

利用构建的gSLAM/Vero-E6细胞系单层吸附野生型(图7A)和疫苗株(图7B)，Vero-E6细胞作为对照(图7D和图7E)，未吸附病毒的细胞作为对照(图7C和图7F)。实验结果显示，野生型和疫苗株PPRV都能在gSLAM/Vero-E6细胞系上繁殖，野生型和疫苗株PPRV可产生明显细胞病变，而且病变产生较快。在相同时间内，野生型和疫苗株PPRV在Vero-E6细胞上产生病变不明显。

采用qRT-PCR方法证明，gSLAM/Vero-E6细胞系培养的病毒其病毒核酸含量比普通细胞高约10倍左右(图8)。可见，用gSLAM/Vero-E6细胞系分离小反刍兽疫野毒株具有时间短产毒量高等优点。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系及其构建方法与应用

<130> KHP161114855.4QC

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caccccttat cctcactgg 19

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cagagagctg acatcacaga ctt 23

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcccccgggt tgaccagttc cacaaaga 28

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgcgtcgac tagtccccat tgtcttgatt ct 32