一种皮肤干细胞经异位发育分化为精子的技术方法

摘要

本发明涉及一种诱导皮肤干细胞分化为精子的方法，首先将小鼠皮肤干细胞与经过丝裂霉素C处理的成纤维细胞共培养，诱导其向PGC分化，然后将PGC细胞混合液通过受体鼠输出小管逆向注射到睾丸曲细精管内；在受体鼠睾丸内发育一个月，取出受体鼠睾丸，HE染色分析发现曲细精管内恢复精子发生，并且有典型精子形态的细胞出现，且恢复精子发生的曲细精管中生精细胞表达GFP和MVH等。本发明所述方法对机体伤害小、无伦理问题限制，能够有效诱导皮肤干细胞分化为精子细胞，分化效率高，分化所得精子细胞具有典型精子形态，同时表达精子细胞特异基因。

说明书

技术领域

本发明涉及一种皮肤干细胞经过体内发育分化为精子的方法，属于生物医学的干细胞与组织工程学技术领域。

背景技术

近年来，男性不育患者约占我国育龄人口的10%，而40%以上的男性不育是由于精子发生异常造成的。虽然辅助生殖技术给许多患者带来了曙光，但是单靠辅助生殖和药物治疗还远远不够。利用干细胞向生殖细胞的定向分化可以在体外建立生殖细胞发生的模型并最终获得功能性配子，这对研究生殖细胞发生的调控机制以及治疗男性不育症等方面具有重要意义。

干细胞(stem cells，SC)是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。成体干细胞是指存在于已分化组织中的未分化细胞，这些细胞多数处于休眠状态且维持其多能性，一定条件下，它们能够自我更新并且能够分化形成特异组织的细胞类型，表现出其多向分化潜能。相对于其它成体干细胞，皮肤干细胞广泛分布于人体最大的器官且取材更为方便，在临床应用上没有免疫排斥和伦理性问题，因此，皮肤来源的干细胞向生殖细胞分化备受关注。

然而，皮肤干细胞体外向精子诱导分化的报导很少，至今仍没有相关报道。其他成体干细胞体外向精子分化的研究也大多数来至精原干细胞。1994年，Hofmann等在体外建立了精原干细胞系，而且这些细胞系在特定的条件下能够进入减数分裂，但最终无法获得单倍体细胞，表明这个细胞系在体外培养的条件下不能突破减数分裂期。2002年，Feng等在体外建立一种细胞系，而这些细胞在干细胞因子的诱导下能够突破减数分裂并产生顶体样结构。但是由于后续没有被其他实验室重复，所以至今仍未被广泛利用。

发明内容

为解决现有技术中存在的上述缺陷并发扬优点，本发明旨在提供一种首次采用皮肤干细胞作为原始细胞，对机体伤害小、无伦理问题限制的小鼠皮肤干细胞经过体内发育分化为精子的方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种皮肤干细胞经过体内发育分化为精子的方法，包括将皮肤干细胞诱导分化为原始生殖细胞、将原始生殖细胞植入受体鼠睾丸获得精子细胞两个步骤，其中：

1）将皮肤干细胞诱导分化为原始生殖细胞具体为：

①皮肤干细胞准备：分别提取培养了1-2代绿色荧光转移基因小鼠的皮肤干细胞与野生型小鼠成纤维细胞，并将野生型小鼠成纤维细胞采用丝裂霉素C处理，然后将皮肤干细胞与处理后的成纤维细胞按照质量比1:1的比例混合后待用；

②选用DMEM高糖培养基作为原始生殖细胞诱导培养基，并在该培养基内加入以DMEM高糖总质量计8%~12%质量分数的胎牛血清、以DMEM高糖总体积计40 mIU/ml~60 mIU/ml促卵泡素、80 IU/ml~120 IU/ml白血病抑制因子、15ng/ml~25 ng/ml骨形态发生因子、0.20mmol/L~0.25 mmol/L丙酮酸钠、0.08 mmol/L~0.12 mmol/L非必需氨基酸，1.5 mmol/L~2.5mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L~0.12 mmol/L β-巯基乙醇, 8ng/ml~12 ng/ml表皮生长因子, 15ng/ml~25 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子, 30ng/ml~50ng/ml干细胞生长因子；培养温度35℃-38℃，湿度不低于80%，环境中CO₂浓度4%-6%；

③将步骤①获得的待用混合细胞植入步骤②准备的原始生殖细胞诱导培养基，然后将培养基放置在培养箱中，按常规方式进行培养8-10天，即获得诱导分化出的原始生殖细胞；

2）将原始生殖细胞植入受体鼠睾丸获得精子细胞具体为：

①准备受体鼠；

②将1）中步骤③获得的原始生殖细胞稀释至0.8×10⁶个/L>6个/L，然后利用常规睾丸注射技术将其注射进行受体睾丸曲细精管内，培育至通过常规方法检测出现典型精子形态的细胞，则所述具有典型精子形态的细胞为所需精子细胞。

上述皮肤干细胞经过体内发育分化为精子的方法，其中：在步骤1）将皮肤干细胞诱导分化为原始生殖细胞和将原始生殖细胞植入受体鼠睾丸获得精子细胞之间还增加有原始生殖细胞专向培养步骤，具体为：将1）中步骤③获得的原始生殖细胞放入专向培养基内进行培养，所述专向培养基具体为：以DMEM高糖培养基作为基础，其内添加以DMEM高糖总质量计8%~12%质量分数的胎牛血清、以DMEM高糖总体积计15ng/ml~25 ng/ml骨形态发生因子、0.20 mmol/L~0.25 mmol/L丙酮酸钠、0.08 mmol/L~0.12 mmol/L非必需氨基酸，1.5mmol/L~2.5mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L~0.12 mmol/L β-巯基乙醇, 15ng/ml~25ng/ml表皮生长因子, 30ng/ml~50 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子, 30ng/ml~50ng/ml干细胞生长因子；培养时间3-5天，温度35℃-38℃，湿度不低于80%；环境中CO₂浓度4%-6%。

上述皮肤干细胞经过体内发育分化为精子的方法，其中：原始生殖细胞在受体鼠睾丸内的培育周期为25天-40天。

与现有技术相比较，本发明具有以下优点：采用小鼠皮肤干细胞及成纤维细胞作为原细胞进行定向诱导分化，一方面对机体伤害小，另一方面，也无伦理问题限制，具有更广阔的应用前景和重大的社会及经济意义；采用的培养基成份配置更为合理、营养更齐全且更专向，用于适用的皮肤干细胞定向培养精子细胞的效率高、再现率高、纯度高、质量好；清楚地划分了初步诱导分化和最终体内培养，一方面使本发明的专向性更强，另一方面也为实际应用的步骤优化提供了更大的空间和应用价值，也大大降低了培养难度，提高了再现性；本发明方法建立了小鼠皮肤干细胞经过体内发育分化为精子的方法，以小鼠皮肤干细胞为材料，先在体外诱导分化为原始生殖细胞，并通过睾丸注射技术利用体内环境将原始生殖细胞分化有典型精子形态的精子，为皮肤干细胞向配子分化及研究应用提供了技术基础。

附图说明

图1 为小鼠皮肤干细胞培养及传代图片。

图2 为小鼠皮肤干细胞分化的原始生殖细胞图片。

图3为正常小鼠和白消安处理小鼠的睾丸图片。

图4为小鼠皮肤干细胞分化的原始生殖细胞注射到受体鼠睾丸图片。

图5为受体鼠睾丸组织切片HE染色图片。

图6为受体鼠睾丸切片免疫荧光组织化学染色图片。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图对本发明方法做进一步阐述。

实施例1

一种皮肤干细胞经过体内发育分化为精子的方法，包括将皮肤干细胞诱导分化为原始生殖细胞、将原始生殖细胞植入受体鼠睾丸获得精子细胞两个步骤，其中：

1）将皮肤干细胞诱导分化为原始生殖细胞具体为：

①皮肤干细胞准备：分别提取培养了1代绿色荧光转移基因小鼠的皮肤干细胞与野生型小鼠成纤维细胞，并将野生型小鼠成纤维细胞采用丝裂霉素C处理，然后将皮肤干细胞与处理后的成纤维细胞按照质量比1:1的比例混合后待用；

②选用DMEM高糖培养基作为原始生殖细胞诱导培养基，并在该培养基内加入以培养基内DMEM高糖总质量计8%质量分数的胎牛血清、以培养基内DMEM高糖总体积计40 mIU/ml促卵泡素、80 IU/ml白血病抑制因子、15ng/ml骨形态发生因子、0.20 mmol/L丙酮酸钠、0.08mmol/L非必需氨基酸，1.5 mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L β-巯基乙醇, 8ng/ml表皮生长因子, 15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子, 30ng/ml干细胞生长因子；培养温度35℃，湿度80%；环境中CO2浓度4%；

③将步骤①获得的待用混合细胞植入步骤②准备的原始生殖细胞诱导培养基，然后将培养基放置在培养箱中，按常规方式进行培养8-10天，即获得诱导分化出的原始生殖细胞；

2）将原始生殖细胞植入受体鼠睾丸获得精子细胞具体为：

①准备受体鼠；

②将1）中步骤③获得的原始生殖细胞稀释至0.8×10⁶个/L，然后利用常规睾丸注射技术将其注射进行受体睾丸曲细精管内，40天后，通过常规方法检测出现典型精子形态的细胞，则所述具有典型精子形态的细胞为所需精子细胞。

实施例2

一种皮肤干细胞经过体内发育分化为精子的方法，包括将皮肤干细胞诱导分化为原始生殖细胞、原始生殖细胞专向培养、将原始生殖细胞植入受体鼠睾丸获得精子细胞三个步骤，其中：

1）将皮肤干细胞诱导分化为原始生殖细胞具体为：

①皮肤干细胞准备：分别提取培养了2代绿色荧光转移基因小鼠的皮肤干细胞与野生型小鼠成纤维细胞，并将野生型小鼠成纤维细胞采用丝裂霉素C处理，然后将皮肤干细胞与处理后的成纤维细胞按照质量比1:1的比例混合后待用；

②选用DMEM高糖培养基作为原始生殖细胞诱导培养基，并在该培养基内加入以培养基内DMEM高糖总质量计12%质量分数的胎牛血清、以培养基内DMEM高糖总体积计60 mIU/ml促卵泡素、120IU/ml白血病抑制因子、25ng/ml骨形态发生因子、0.25 mmol/L丙酮酸钠、0.12mmol/L非必需氨基酸，2.5 mmol/L L-谷氨酰胺，0.12 mmol/L β-巯基乙醇, 12ng/ml表皮生长因子, 25ng/ml碱性成纤维细胞生长因子, 50ng/ml干细胞生长因子；培养，温度38℃，湿度85%；环境中CO2浓度6%；

③将步骤①获得的待用混合细胞植入步骤②准备的原始生殖细胞诱导培养基，然后将培养基放置在培养箱中，按常规方式进行培养8-10天，即获得诱导分化出的原始生殖细胞；

2）原始生殖细胞专向培养，具体为：

将1）中步骤③获得的原始生殖细胞放入专向培养基内进行培养，所述专向培养基具体为：以DMEM高糖培养基作为基础，其内添加以培养基内DMEM高糖总质量计8%质量分数的胎牛血清、以培养基内DMEM高糖总体积计15ng/ml骨形态发生因子、0.20 mmol/L丙酮酸钠、0.08 mmol/L非必需氨基酸，1.5 mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L β-巯基乙醇, 15ng/ml表皮生长因子, 30ng/ml碱性成纤维细胞生长因子, 30ng/ml干细胞生长因子；培养时间3天，温度35℃，湿度80%；环境中CO₂浓度4%；经过一定时间专向培养后可获得更加纯化、数量更多、形态更佳的原始生殖细胞。

3）将原始生殖细胞植入受体鼠睾丸获得精子细胞具体为：

①准备受体鼠；

②将2）中获得的原始生殖细胞稀释至1.2×10⁶个/L，然后利用常规睾丸注射技术将其注射进行受体睾丸曲细精管内，25天后，通过常规方法检测出现典型精子形态的细胞，则所述具有典型精子形态的细胞为所需精子细胞。

实施例3

大体与实施例2相同，其差别在于：

2）原始生殖细胞专向培养，具体为：

将1）中步骤③获得的原始生殖细胞放入专向培养基内进行培养，所述专向培养基具体为：以DMEM高糖培养基作为基础，其内添加以培养基内DMEM高糖总质量计12%质量分数的胎牛血清、以培养基内DMEM高糖总体积计25 ng/ml骨形态发生因子、0.25 mmol/L丙酮酸钠、0.12 mmol/L非必需氨基酸，2.5mmol/L L-谷氨酰胺，0.12 mmol/L β-巯基乙醇, 25ng/ml表皮生长因子, 50 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子, 50ng/ml干细胞生长因子；培养时间5天，温度38℃，湿度85%；环境中CO₂浓度6%；经过一定时间专向培养后可获得更加纯化、数量更多、形态更佳的原始生殖细胞。

实施例4

本实施例为了更详细地阐述本发明的皮肤干细胞经过体内发育分化为精子的方法，结合图片、具体操作流程、用到的器具、具体药品的来源等，将方法的步骤更加详细地描述如下：

1、小鼠皮肤干细胞的分离

取当天新生的绿色荧光转基因CD1雄性小鼠，断颈处死后用75%的酒精擦拭干净，再用生理盐水清洗一遍。用剪刀顺着小鼠背部外侧剪开皮肤，用镊子将背部皮肤撕下放入DMEM/F12中，用弯镊子去掉皮肤上的脂肪和血液。将皮肤置于2-3 mL含有1%青链霉素（PS）的磷酸盐缓冲液（PBS）中清洗3次，然后每5-7只小鼠皮肤为一组转移到6 cm培养皿中。用剪刀将小鼠皮肤剪成< 1 mm2的碎片，之后转移到15 mL离心管中，加入PBS到10 mL，1200 rpm离心3min，重复洗涤3次。弃上清，加1 mL的0.25%胰酶后，置于37℃、饱和湿度、5% CO₂培箱中消化20-30>

2、小鼠原始生殖细胞（PGC）的诱导

收集1-2代的皮肤干细胞克隆球，用0.25% Trypsin消化，室温消化过程中用枪吹打至单细胞，用10%胎牛血清终止消化，收集细胞，1500rpm离心5min；弃上清，加入少量原始生殖细胞诱导培养基悬浮细胞，将细胞稀释到细胞浓度为5×10⁴个/ml>

取1-3代成纤维细胞，倒掉培养基，加入4ml含有10μg丝裂霉素C的成纤维细胞培养基，置于培养箱中1.5-2小时，取出用磷酸盐缓冲液洗5遍，用0.25% Trypsin将贴壁的成纤维细胞消化下来，洗涤后加入原始生殖细胞诱导培养基稀释至5×10⁴个/ml，将两种细胞混合液1:1混合，加入到6cm原始生殖细胞诱导培养基中并置于37℃、饱和湿度、5%CO₂中培养，原始生殖细胞诱导培养基包括：DMEM高糖,>

3、受体鼠睾丸注射

将原始生殖细胞收集并洗涤后加入0.1% 台盼蓝染色后，置于冰上。选取状态好的受体鼠，受体鼠经过白消安处理，与正常小鼠（图3中（1））对比，其生精上皮已被摧毁（图3中（2）），腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉。剂量：240 mg/kg。待小鼠昏迷后，将其仰卧并用胶带固定四肢于硬纸板上。用酒精湿润小鼠腹侧皮肤，剪去小鼠腹侧毛。在受体鼠腹部由下至上纵向依次剪开皮肤、腹膜及腹肌，切口距离生殖器大约0.5cm左右，长度大约1 cm左右。用镊子将睾丸拉出腹腔：于膀胱旁边寻找与睾丸相连的脂肪垫，轻轻拖出腹腔，小鼠的睾丸和附睾顺势被拖出腹腔。在体视镜下找到受体鼠输出小管，并调整输出小管角度角度，使小鼠输出小管的方向大约与注射针方向平行。双手操作，夹起输出小管，将其中一段套入玻璃针头部，并顺势平行将输出管向玻璃针的方向移动。进针到位后，缓缓推动活塞，将原始生殖细胞液注入受体鼠曲细精管。将睾丸、附睾及其脂肪缓慢送入腹腔并归置原处，依次缝合腹肌和皮肤。缝合后依次用75%酒精和碘酊消毒，并将小鼠置于温暖处，待其苏醒后放回层流架进行无菌培养。睾丸注射一个月后，受体鼠睾丸即可取出进行下一步分析。图4是小鼠皮肤干细胞分化的原始生殖细胞注射到受体鼠睾丸曲细精管中。

4、受体鼠睾丸HE切片染色观察组织结构

将受体鼠睾丸取出，4%多聚甲醛固定过夜，经洗涤--脱水—透明—石蜡包埋—组织切片，将切片经两次二甲苯每步10min将切片上的石蜡脱净，经无水酒精及各级酒精下行至水。苏木精溶液染色约5分钟。将片子放入自来水染缸中，换染缸至自来水不变色为止。放入0.5%盐酸的70%酒精溶液（简称1.5%盐酸酒精）分色。分色时，边分色边镜检，至细胞核染色清楚，一般情况下，在盐酸酒精中蘸三次即可，每次不超过1s。分色后用自来水洗碱化，直至细胞核变成蓝色。这一步骤也可称为“蓝化”。放入蒸馏水洗去碱性成分。若切片中残留过多的碱性物质则对以后的伊红染色不利。依次放入50%、70%及80%的酒精。放入1%伊红酒精染液2分钟。以95%酒精对伊红分色，至胞浆、结缔组织等呈桃红色。一般1min即可。再放到95%酒精，无水酒精脱水。每步时间为20s。放入二甲苯透明（15min左右）。取出切片，将组织周围多余的二甲苯擦去，滴树胶后加盖玻片封固。通过HE染色发现，受体鼠睾丸中仍有大部分曲细精管是精子发生缺失的，但有部分曲细精管已经恢复了精子发生（图5）。

5、受体鼠睾丸免疫荧光组织化学检测特定基因表达

将受体鼠睾丸取出，4%多聚甲醛固定过夜，经洗涤--脱水—透明—石蜡包埋—组织切片，然后将切好的石蜡切片即白片放入60 ℃烘箱烘2 h。经两次二甲苯每次15 min将切片上的石蜡脱净。脱蜡后经无水酒精及各级酒精下行至水，将复水的切片放入柠檬酸抗原修复液中，96 ℃，修复15 min。修复液冷却至室温后，将片子取出后，放在水平湿盒内，用铅笔在组织切片的区域做好标记，之后将片子放入TBS 中洗5 min，再转入TBST 中洗5 min。加上BDT (3% BSA和10%山羊血清溶于TBS) 封闭，大约的量为每张片子100 μL。之后加封口膜在切片区域。室温放置30 min。将封口膜揭掉，将片子上多余的封闭液倒在吸水纸上。加适量一抗于切片位置，一般为20 μL。用封口膜封一抗，注意不能有气泡，尤其在组织切片位置。将载玻片放入湿盒内，用封口袋封住，37 ℃孵育1 h。一抗孵育结束后，取出片子，将片子泡入TBST中。一共洗三次，每次10 min。将片子上的TBST倒在吸水纸上，加上荧光标记的二抗，一般加20 μL的量。用封口膜封住二抗后，放入湿盒内，用封口袋封住，37 ℃孵育15min。孵育结束后，将片子取出，揭掉封口膜，TBST洗三次，分别为10 min，20 min，20 min。将片子上多余的TBST倒在吸水纸上，滴加适量的Hoechst 33342，一般为10 μL，在切片位置添加封口膜，常温孵育3 min，染色时间要控制好，切片染色要明显快于细胞染色。将封口膜揭掉，PBS洗3次，每次5 min。将多余的PBS倒在吸水纸上。加Vectashield封片，加的量视片子上组织的面积而定，一般情况下加5~10 μL即可。注意不要直接滴加在组织上，应滴在组织切片边上，再用盖玻片盖住片子。做好的切片置于干盒中，套上封口袋防止切片凝水，4 ℃保存，镜检观察。注意不能置于湿盒中。染色结果发现，受体睾丸中恢复精子发生的曲细精管内，生精上皮细胞同时表达GFP（图6中（1-2））和MVH（图6中（1-3）），说明恢复精子发生的细胞来自小鼠皮肤干细胞分化的原始生殖细胞。

对所公开的实施例的上述说明，仅为了使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。