一种人类视网膜色素上皮细胞增殖能力的检测方法

摘要

本发明涉及一种人类视网膜色素上皮细胞增殖能力的检测方法，首先将冻存的人类视网膜色素上皮细胞复苏并采用乙醇处理使细胞固定、破膜，然后向经固定、破膜的细胞悬液中加入Ki67抗体，混合，孵育，洗涤，最后利用流式细胞仪检测最终检测样本细胞悬液，并参照非特异性同型得到特异性蛋白阳性表达细胞的比例。本发明中的检测方法适用于冻存后染色体色素上皮细胞增殖能力的检测，应用范围广，步骤简单易于操作，检测过程耗时短，准确度高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种人类视网膜色素上皮细胞增殖能力的检测方法，属于细胞检测技术领域。

背景技术

视网膜色素上皮细胞是眼球中重要的一种细胞，具有顺反视黄醛转化、支持视细胞、视网膜物质交换等功能，在某些情况下，视网膜色素上皮细胞的状态直接关系到患者视力功能的健全与否。

针对人类视网膜色素色素上皮细胞活性的检测，目前尚未有明确方法，但仍可以借鉴其他细胞检测方法，例如：MTT比色法，流式细胞术法等，其中流式细胞术法优于具有快速、稳定性高的优点，因此得到越来越广泛的关注。

相关技术中，流式细胞术检测细胞活性的常用手段包括：BrDU检测法：将一定浓度的BrDU孵育细胞；经固定变性（酸解、热解、酶解）后与抗体结合染色，镜检或流式细胞术鉴定。或者是EDU检测法：采用一定浓度的EdU孵育细胞；固定后染色，镜检鉴定。

目前常规的增殖能力检测方法的不足分别为：BrDU检测法的孵育时间长，DNA需经变性才能与抗体结合，操作复杂，不能直接用于冻存细胞的鉴定。EdU检测法不能直接用于冻存细胞的鉴定。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前细胞增殖能力检测时操作复杂、孵育时间长且不能检测冻存细胞的问题，提供了一种人类视网膜色素上皮细胞增殖能力的检测方法。

本发明采用如下技术方案：一种人类视网膜色素上皮细胞增值能力的检测方法，包括如下步骤：

（1）将冻存的人类视网膜色素上皮细胞置于37-38℃水浴锅中复苏1-1.5min，加入9-10倍体积的1×PBS洗涤，离心去上清；

（2）将复苏后的人类视网膜色素上皮细胞加入5-6ml乙醇进行重悬细胞处理，然后将人类视网膜色素上皮细胞在-20--25℃温度下固定破膜处理2-24h，然后采用细胞滤筛过滤成单个细胞，离心去上清，得到经固定、破膜的细胞悬液；

（3）加入staining buffer 进行重悬细胞，离心弃上清，并重复一次；

（4）向经固定、破膜的细胞悬液中按5ul/1×106个细胞加入Ki67抗体，混合，常温避光孵育，洗涤，得到最终检测样本细胞悬液；

（5）利用流式细胞仪检测最终检测样本细胞悬液中ki67阳性细胞比例，并以与6ul/1×106个细胞非特异性抗体共孵育处理的人类视网膜色素上皮细胞作为非特异性同型，对照得到特异性蛋白阳性表达细胞的比例；

（6）检测得到的ki67阳性细胞比例即为处于增殖周期内人类视网膜色素上皮细胞比例。

进一步的，所述步骤（4）中流式细胞仪的检测时间为2~4h。

进一步的，所述步骤（2）中采用浓度为75-80%的乙醇溶液。

进一步的，所述步骤（1）、步骤（2）和步骤（3）中离心去上清时离心机的离心力为400-420g，离心时间为5-8min。

进一步的，所述步骤（5）中的非特异性抗体为Isotype control抗体。

本发明具有如下优点：（1）本发明中的检测方法适用于冻存后染色体色素上皮细胞增殖能力的检测，应用范围广；（2）本发明中的人类视网膜色素上皮细胞通过直接参与抗体-抗原免疫反应，从而省去了每次实验前需要进行细胞在培养、DNA变性的冗繁过程，步骤简洁易于操作；（3）本发明中的检测过程耗时短，准确度高。

附图说明

图1为实施例一中人类视网膜色素上皮细胞ki67流式结果。

图2为实施例一在10×10倍显微镜下同批次冻存细胞复苏接种后2天、3天照片。

图3为实施例二人类视网膜色素上皮细胞ki67流式结果。

图4为实施例二在10×10倍显微镜下同批次冻存细胞复苏接种后2天、3天照片。

图5为实施例三在人类视网膜色素上皮细胞ki67流式结果。

图6为实施例三在10×10倍显微镜下同批次冻存细胞复苏接种后2天、3天照片。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。

本发明中的PBS购自Gibco公司；staining buffer、Isotype control抗体购自R&D公司；ki67抗体购自Biolegend公司。

本发明中实例一、实例二、实例三所用的冻存细胞为三个不同供体提供的人类视网膜色素上皮细胞，采用本发明的同样方法进行细胞增值能力的检测。

实施例一：

按照以下步骤鉴定一批冻存复苏后的人类视网膜色素上皮细胞增值能力：

1）细胞复苏：将冻存于液氮蒸汽中的人类视网膜色素上皮细胞取出，迅速放入37℃恒温水浴锅中复温1.5min。

2）洗涤：将融化后的细胞悬液转入含有1×PBS 9ml的离心管中，400g离心力离心5分钟，弃上清；

3）加入预冷的1×PBS 2ml重悬细胞后，计数；

4）按照技术结果各取2×10⁶个细胞至一个新的15ml离心管中，400g离心力离心5分钟，弃上清；

5）加入预冷的80%乙醇6ml重悬细胞，并将离心管放入-20℃的冰箱中冷冻孵育2-24h，取出后40um细胞滤筛过滤成单个细胞，平均分到两个新15ml离心管中，400g离心力离心5分钟，弃上清；

6）分别加入staining buffer 1ml重悬细胞，400g离心力离心5分钟，弃上清，并重复一次；

7）分别加入staining buffer 100ul重悬细胞，一管细胞加入ki67抗体5ul，一管细胞加入Isotype control抗体6ul，室温避光孵育0.5小时；

8）分别加入staining buffer 1ml，400g离心力离心5分钟，弃上清；

分别加入staining buffer 500ul重悬细胞后，转入两个流式管，上机检测得到处于细胞增殖期内的细胞比例，结果如图1所示。

由图1可知，图1中纵坐标是细胞数量或比例，横坐标是荧光强度，A峰代表对照组（即阴性范围），B峰代表检测组（即ki67实测表达量），所得的数值68.1%代表改组细胞中表达ki67的细胞占总数的百分比，即该批次细胞中，处于增殖期的细胞占总数的百分比为68.1%。

图2为实施例一中的在10×10倍显微镜下同批次冻存细胞复苏接种后2天、3天生长情况照片。其中，在接种第2天，细胞贴壁性良好，已呈现生长态势；在接种第3天，细胞生长旺盛，细胞数量较第二天明显增加。由图2可知，处于增殖期的细胞比例大，因此接种三天细胞数量呈明显增加。

实施例二：

按照以下步骤鉴定一批冻存复苏后的人类视网膜色素上皮细胞增值能力：

1）细胞复苏：将冻存于液氮蒸汽中的人类视网膜色素上皮细胞取出，迅速放入37℃恒温水浴锅中复温1.5min。

2）洗涤：将融化后的细胞悬液转入含有1×PBS 9ml的离心管中，400g离心力离心5分钟，弃上清；

3）加入预冷的1×PBS 2ml重悬细胞后，计数；

4）按照技术结果各取2×10⁶个细胞至一个新的15ml离心管中，400g离心力离心5分钟，弃上清；

5）加入预冷的80%乙醇6ml重悬细胞，并将离心管放入-20℃的冰箱中冷冻孵育2-24h，取出后40um细胞滤筛过滤成单个细胞，平均分到两个新15ml离心管中,400g离心力离心5分钟，弃上清；

6）分别加入staining buffer 1ml重悬细胞，400g离心力离心5分钟，弃上清，并重复一次；

7）分别加入staining buffer 100ul重悬细胞，一管细胞加入ki67抗体5ul，一管细胞加入Isotype control抗体6ul，室温避光孵育0.5小时；

8）分别加入staining buffer 1ml，400g离心力离心5分钟，弃上清；

分别加入staining buffer 500ul重悬细胞后，转入两个流式管，上机检测得到处于细胞增殖期内的细胞比例，结果如图3所示。

图3中的纵坐标是细胞数量或比例，横坐标是荧光强度，A峰代表对照组（即阴性范围），B峰代表检测组（即ki67实测表达量），所得的数值代表改组细胞中表达ki67的细胞占总数的百分比，即该批次细胞中，处于增殖期的细胞占总数的百分比为53.0%。

图4为实施例二在10×10倍显微镜下同批次冻存细胞复苏接种后2天、3天生长情况照片。其中，在接种第2天，细胞贴壁性良好，已呈现生长态势；在接种第3天，细胞生长旺盛，细胞数量较第二天明显增加。但由于细胞中处于增殖期的数量没有实施例一中多，因此，处于第3天的细胞生长数量没有实施例一种明显。

实施例三：

按照以下步骤鉴定一批冻存复苏后的人类视网膜色素上皮细胞增值能力：

1）细胞复苏：将冻存于液氮蒸汽中的人类视网膜色素上皮细胞取出，迅速放入37℃恒温水浴锅中复温1.5min。

2）洗涤：将融化后的细胞悬液转入含有1×PBS 9ml的离心管中，400g离心力离心5分钟，弃上清；

3）加入预冷的1×PBS 2ml重悬细胞后，计数；

4）按照技术结果各取2×10⁶个细胞至一个新的15ml离心管中，400g离心力离心5分钟，弃上清；

5）加入预冷的80%乙醇6ml重悬细胞，并将离心管放入-20℃的冰箱中冷冻孵育2-24h，取出后40um细胞滤筛过滤成单个细胞，平均分到两个新15ml离心管中,400g离心力离心5分钟，弃上清；

6）分别加入staining buffer 1ml重悬细胞，400g离心力离心5分钟，弃上清，并重复一次；

7）分别加入staining buffer 100ul重悬细胞，一管细胞加入ki67抗体5ul，一管细胞加入Isotype control抗体6ul，室温避光孵育0.5小时；

8）分别加入staining buffer 1ml，400g离心力离心5分钟，弃上清；

分别加入staining buffer 500ul重悬细胞后，转入两个流式管，上机检测得到处于细胞增殖期内的细胞比例，结果如图5所示。

图5中纵坐标是细胞数量或比例，横坐标是荧光强度，A峰代表对照组（即阴性范围），B峰代表检测组（即ki67实测表达量），所得的数值代表改组细胞中表达ki67的细胞占总数的百分比，即该批次细胞中，处于增殖期的细胞占总数的百分比为12.0%。

图6为实施例三在10×10倍显微镜下同批次冻存细胞复苏接种后2天、3天照片。其中，在接种第2天，细胞贴壁性较差；在接种第3天，细胞生长缓慢，细胞数量较第二天增加不明显。

比较实例一、二、三之后，可得出结论，ki67表达率越高，处于增殖期的细胞越多，其细胞的增殖能力越强。

实施例四：

（1）将冻存的人类视网膜色素上皮细胞迅速置38℃水浴锅中复苏1min，融化后加入10倍体积的1×PBS洗涤，离心去上清，离心机的离心力为420g，离心时间为8min；

（2）将复苏后的人类视网膜色素上皮细胞加入5ml的75%乙醇进行重悬细胞处理，然后将人类视网膜色素上皮细胞在-25℃温度下固定破膜处理24h，然后采用细胞滤筛过滤成单个细胞，离心去上清，离心机的离心力为420g，离心时间为8min，得到经固定、破膜的细胞悬液；

（3）加入staining buffer 进行重悬细胞，离心弃上清，离心机的离心力为420g，离心时间为8min并重复一次；

（4）向经固定、破膜的细胞悬液中按5ul/1×10⁶个细胞加入Ki67抗体，混合，常温避光孵育，洗涤，得到最终检测样本细胞悬液；

（5）利用流式细胞仪检测最终检测样本细胞悬液中ki67阳性细胞比例，并以与6ul/1×10⁶个细胞非特异性抗体共孵育处理的人类视网膜色素上皮细胞作为非特异性同型，对照得到特异性蛋白阳性表达细胞的比例；

（6）检测得到的ki67阳性细胞比例即为处于增殖周期内人类视网膜色素上皮细胞比例。