脂质运载蛋白-2对人类卵巢癌细胞增殖能力的影响以及相关分子机制的研究

摘要

目的：卵巢癌患者早期症状隐匿，确诊时已处于晚期，导致卵巢癌患者的死亡率居妇科肿瘤之首，对妇女生命造成严重威胁。脂质运载蛋白-2（LCN2）是一种25kDa的外分泌型糖蛋白，有研究表明LCN2的表达量与卵巢癌的恶性程度密切相关。然而，有关LCN2在卵巢癌细胞中的作用及机制还不明确。本研究将检测LCN2的表达与卵巢癌临床病理特征的相关性，以及LCN2对卵巢癌细胞增殖活力的影响，并初步探讨相关信号通路的分子机制。
　　方法：通过免疫组化方法检测LCN2在正常卵巢组织与卵巢肿瘤组织中的表达程度，统计评估LCN2与卵巢癌临床病理特征的相关性；应用MTT细胞增殖实验和平板细胞克隆形成实验检测过表达LCN2对卵巢癌细胞系（ES2和SKOV3）增殖活力的影响；通过稳定转染LCN2质粒DNA加药物筛选的方法构建稳定过表达LCN2的卵巢癌细胞系；通过磷酸蛋白芯片筛选过表达LCN2后产生的相关差异表达的蛋白；应用Western Blot和细胞免疫荧光法验证部分差异蛋白的亚细胞定位及表达强度的变化。
　　结果：
　　1.免疫组织化学结果：LCN2在正常卵巢组织中呈阴性表达，在卵巢癌组织中有不同程度的阳性表达。表达程度量化评分后，经统计学分析发现，LCN2在卵巢癌组织中表达量高于正常卵巢组织并与卵巢癌组织分化程度具有显著性差异（P<0.0001）。
　　2.MTT细胞增殖实验结果：选择相对低表达LCN2的两个卵巢癌细胞系（ES2和SKOV3），瞬时转染LCN2质粒和空白对照质粒48h之后，过表达LCN2组的细胞增殖活力高于对照组。
　　3.平板细胞克隆形成实验结果：分别在ES2和SKOV3细胞中，稳定转染等量的LCN2质粒和空白对照质粒，经G418筛选至克隆形成，结果显示过表达LCN2组克隆形成率明显多于对照组。
　　4.磷酸蛋白芯片实验结果：在卵巢癌细胞系中，利用已经成功构建的稳定高表达LCN2细胞系，磷酸蛋白芯片筛选结果显示过表达LCN2组相对于对照组，ERK和GSK3β的磷酸化水平均明显上调。
　　5.Western Blot检测结果：首先在四种卵巢癌细胞系（ES2、SKOV3、CAOV3、OVCAR3）中分别检测了LCN2、磷酸化ERK（p-ERK）、ERK、磷酸化GSK3β（p-GSK3β）和GSK3β及β-catenin的蛋白表达水平，发现LCN2高表达的细胞系（CAOV3和OVCAR3）对比LCN2低表达的细胞系（ES2和SKOV3），磷酸化ERK和磷酸化GSK3β的表达水平上调。随后，在稳定过表达LCN2的ES2和SKOV3细胞系中再次验证LCN2、磷酸化ERK、ERK、磷酸化GSK3β和GSK3β的蛋白表达水平，结果显示过表达LCN2上调了磷酸化ERK、磷酸化GSK3β和β-catenin的表达。
　　6.细胞免疫荧光结果：在SKOV3细胞系中瞬时转染pEGFPN3和pEGFPN3-LCN2质粒DNA，发现成功转染LCN2组中，LCN2、磷酸化ERK、磷酸化GSK3β及β-catenin的表达强度相对于对照组有明显增加。
　　结论：
　　1.LCN2在卵巢癌组织中高表达，并且与组织的分化程度负相关。
　　2.过表达LCN2可以促进卵巢癌细胞的增殖活力。
　　3.过表达LCN2上调磷酸化ERK、磷酸化GSK3β及β-catenin表达水平，提示LCN2促进卵巢癌细胞的增殖可能经ERK/GSK3β信号通路。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料

2 主要试剂配制

3 实验方法

结果

1 LCN2在人类卵巢组织芯片中的表达的结果

2 LCN2对卵巢癌细胞增殖活力的影响的结果

3 磷酸蛋白芯片检测LCN2过表达引起的相关蛋白改变的结果

4 Western方法验证相关差异蛋白表达的结果

5 细胞免疫荧光的结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:脂质运载蛋白-2在恶性肿瘤中的研究进展

致谢

个人简历