一种控制产L‑乳酸菌米根霉菌球形态的方法

摘要

本发明公开了一种控制产L‑乳酸菌米根霉菌球形态的方法，包括米根霉菌体的培养及发酵培养步骤，其特征在于在菌体培养基中加入Ca(OH)

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过添加外源微粒控制产L-乳酸菌米根霉菌球形态的方法。

背景技术

传统添加外源微粒，会增加培养基粘度以及增加后续的分离问题，其主要原因是添加的外源微粒不溶，一直滞留在培养基中，虽然这种方法，能控制菌球形态，但产生的后续问题也较多。

现有技术讨论了钙离子对米根霉菌体形态及L-乳酸合成的影响，重点探讨了可溶性的CaCl₂和难溶性的CaCO₃对菌体形态及产酸的影响，从实验结果上来看，虽然两种钙源的添加对产乳酸的提高都有较大提高，但是从糖酸转化率来看，最大的糖酸转化率只有0.73g/g，远低于目前文献报道的0.9g/g左右，分析认为，两种钙离子对菌体形成的机制不一样，同时，菌球内部结构，包括菌体密度，菌球结构聚集的方式等，对后期的产酸都有较大影响(可参见Appl>2是可溶性钙源，它的添加可改变菌丝生长方式以及菌体聚集方式，CaCO₃是难溶性菌体，它的添加更多的是作为外源微粒，起到影响菌丝聚集的作用，但对菌体的生长方式并未有较大影响。为此，寻找外源微粒是当务之急。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过添加外源微粒有效控制产L-乳酸菌米根霉菌球形态的方法。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种控制产L-乳酸菌米根霉菌球形态的方法，包括米根霉菌体的培养及发酵培养步骤，在菌体培养基中加入Ca(OH)₂，浓度为0.5-2g/l。

所述的菌体的培养采用的菌体培养基为葡萄糖20-30g/l，蛋白胨3-5g/l，KH₂PO₄0.2-0.3g/l，MgSO₄·7H₂O>2单独灭菌，最后添加至菌体培养基内。

所述的发酵培养采用的发酵培养基为葡萄糖80-100g/l，(NH₄)₂SO₄>4·7H₂O>4·7H₂O>350.0-70.0g/l。

所述的菌体培养采用的条件为120-150转/min，30℃培养18-24h。

发酵培养采用的条件为：接种量为10％，120-150r/min，30℃培养至糖耗光。

米根霉菌种可以为米根霉NRRL-395，来源R.oryzae LA-UN-1；也可以选择通用米根霉菌种。

与现有技术比较本发明的有益效果：

发明人通过研究发现，氢氧化钙能适当增加溶液中钙离子的浓度，同时氢氧化钙微溶于水，所以，氢氧化钙又可作为微粒起到改变环境电荷和聚集菌体的作用，最重要的是，氢氧化钙的选择，不会影响溶氧的传氧传质，在发酵过程中，生成的酸能中和氢氧化钙，聚集在菌体内的氢氧化钙在发酵过程中析出，留出位点，留出的位点进一步会促进发酵过程的传氧传质，另外，氢氧化钙和酸中和，会溶解，不会影响后期的分离。

附图说明

图1为不同Ca(OH)₂添加量下，菌体形态的宏观及微观状态图。

图2为Ca²⁺不同浓度时菌丝形态的状态图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行进一步解释说明：

实施例1

米根霉菌体放在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，在30℃的温度下培养七天。然后用无菌水把PDA表面的真菌孢子洗下来，浓度大约为10⁸个孢子/ml，并放置在在4℃的环境中保存。

取50ml种子培养基装入250ml摇瓶，120转/min，30℃培养24h。250ml摇 瓶每瓶装50ml种子液，取1ml浓度10⁸个/ml的孢子液接入到菌体培养基中，120r/min，30℃培养24h，获得不同直径大小的菌球，后用该菌球进行乳酸发酵。菌体培养基：葡萄糖20g/l，蛋白胨3g/l，KH₂PO₄>4·7H₂O>

发酵培养：250ml摇瓶每瓶装50ml发酵培养液，接种量为10％，150r/min，30℃培养至糖耗光，测乳酸产量；发酵培养液：葡萄糖80g/l，(NH₄)₂SO₄>4·7H₂O>4·7H₂O>3>

实施例2

米根霉菌体放在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，在30℃的温度下培养七天。然后用无菌水把PDA表面的真菌孢子洗下来，浓度大约为1*10⁶个孢子/ml，并放置在在4℃的环境中保存。

取50ml种子培养基装入250ml摇瓶，120转/min，30℃培养24h。250ml摇瓶每瓶装50ml种子液，取1ml浓度10⁶个/ml的孢子液接入到菌体培养基中，150r/min，30℃培养18h，获得不同直径大小的菌球，后用该菌球进行乳酸发酵。菌体培养基：葡萄糖20g/l，蛋白胨3g/l，KH₂PO₄>4·7H₂O>

发酵培养：250ml摇瓶每瓶装50ml发酵培养液，接种量为10％，150r/min，30℃培养至糖耗光，测乳酸产量；发酵培养液：葡萄糖80g/l，(NH₄)₂SO₄>4·7H₂O>4·7H₂O>3>

观察Ca(OH)₂作为碳源进行不同添加时菌体宏观形态和微观形态。

同时观察菌丝形态由于Ca²⁺的存在而产生影响(见图2A-2D)。当Ca²⁺离子浓度过低时，菌丝在极端延生的过程中，会出现菌丝肿胀，粗短现象(图2A)，使得菌丝相互之间聚集难度加大，从而易形成絮状菌体，随着钙离子浓度的增加，菌丝向前衍生，膨胀现象减少(图2B)，一开始形成球絮状形态；钙离子达到一定浓度时，菌丝分支频率增加，菌丝之间聚集程度增加(图2C)，从而球状菌体形态由于聚集而越来越明显；然而，钙离子浓度继续增加，此时分支过多，同时，菌丝粗短(图2D)，易形成团块状。(图中，Ca²⁺浓度分别为A<0.2g/l，0.2g/l<B<1.5g/l,C＝1.5g/l-2.0g/l，D>2.0g/l)

对比试验例：

Ca(OH)₂是碱性物质，在常规米根霉菌体培养过程中，难以用作钙源添加到培养基中，然而本发明Ca(OH)₂氢氧化钙添加对产酸的影响产生了意想不到的结果，乳酸产量显著提高，以下，Ca(OH)₂与CaCl₂和CaCO₃分别添加至菌体培养基(葡萄糖20g/l，蛋白胨3g/l，KH₂PO₄>4·7H₂O>

表1 Ca(OH)₂添加对乳酸发酵的影响结果表

表2 CaCl₂和CaCO₃对乳酸发酵的影响结果表