双启动子自诱导型重组枯草芽孢杆菌的构建方法与应用

摘要

本发明涉及一种双启动子自诱导型重组枯草芽孢杆菌的构建方法与应用。一种重组载体，在穿梭质粒PHT01的KpnI和BamHI两个酶切位点之间插入通过重叠PCR技术连接优化了的启动子Psrf基因与优化了的启动子Pcry3Aa基因获得的双启动子Psrf‑Pcry3Aa基因，在BamHI和AatII两个酶切位点之间插入由柔性连接肽连接得到的RDPE蛋白和海藻糖合成酶TreS的融合蛋白基因。本发明还涉及利用该重组载体构建双启动子自诱导型重组枯草芽孢杆菌的方法及应用。本发明采用双启动子Psrf‑Pcry3Aa自诱导型表达系统自发诱导合成海藻糖合成酶的效果显著优于其它单自诱导型启动子和诱导型启动子表达的效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种双启动子自诱导型重组枯草芽孢杆菌的构建方法与应用，特别涉及一种双启动子Psrf-Pcry3Aa自诱导型重组枯草芽孢杆菌的构建方法及其在制备海藻糖中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

海藻糖是一种非还原性二糖，分子式是C₁₂H₂₂O₁₁·2H₂O，广泛分布于自然界许多生物细胞中。海藻糖是一种生物应激代谢产物，一些在极端环境生长的古生物、真菌，以及一些生长在不良环境中的动植物细胞中海藻糖含量较高。在生物细胞中其功能是保护细胞质膜，蛋白质、核酸等大分子空间结构和功能活性，维持渗透压和防止细胞内营养成分流失。由于海藻糖具有以上功能，它可用于医学生物制品中起到保护剂的作用；增强农作物抗逆性，通过转基因手段来培育耐盐碱型农作物，培育抗冻果蔬等；同时，海藻糖不具有还原性，不会发生美拉德反应，可以作为稳定的添加剂应用于食品行业。因此，对海藻糖进行研究具有重要的意义。

中国专利文献CN105861536A(申请号201610246849.6)公开了一种重组载体，在穿梭质粒pMA5HpaII的两个酶切位点EcoRI和KpnI之间插入ComQ ComX基因，在两个酶切位点BamHI和MluI之间插入通过重叠PCR将Psrf启动子基因、Tat型信号肽PhoD基因和海藻糖合成酶基因TreS连接起来的连接片段。

上述技术的应用建立在枯草芽孢杆菌菌株的基础上，枯草芽孢杆菌在自然界中分布极其广泛，与人类关系非常密切，已成为革兰氏阳性细菌研究的安全模式菌株之一。枯草芽孢杆菌有多种转录表达系统，其中该技术应用的Psrf启动子为枯草芽孢杆菌产表面活性剂的细胞密度诱导型的转录表达系统，无需添加任何诱导剂的诱导，即为枯草芽孢杆菌典型的自诱导型启动子之一。其机理主要在于细菌群体密度增加时，通过相应增加ComX和CSF信息素的表达来激活调节ComP-ComA双组份调节系统，从而磷酸化的ComA激活表面活性素的启动子Psrf，促使其启动子后面的基因转录表达表面活性素。

Pcry3Aa启动子来源于苏云芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)，启动表达的cry3Aa蛋白是苏云芽孢杆菌产生的一种对昆虫具有特异毒性的杀虫晶体蛋白，在营养生长阶段表达较弱，然而在进入稳定期的开始阶段被高度激活表达，在稳定期阶段也持续被表达。Pcry3Aa启动子在枯草芽孢杆菌中被营养生长期的sigma因子σ^A所特异性识别转录，不依赖于枯草芽孢杆菌的稳定期阶段的产芽孢sigma因子以及其它蛋白因子的调控。同时该启动子的激活不要求特别的培养条件、特别的诱导剂和其它压力因素等。因此，Pcry3Aa启动子可作为在枯草芽孢杆菌营养生长期和稳定期表达外源蛋白优选的自诱导启动子之一。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(RDPE)为新型的非经典分泌蛋白，来源于瘤胃球菌(Ruminococcus sp)，该分泌蛋白没有信号肽序列，不需要经过Sec型和Tat型的复杂的分泌途径，目的蛋白与该非经典分泌蛋白的融合分泌效率高达50％以上，同时将近83％的目的蛋白与该分泌蛋白融合达到了分泌效果。本发明技术利用该分泌蛋白跟海藻糖合成酶的融合，通过双自诱导型启动子的表达转录系统，可达到目的蛋白的高效分泌的效果，具有重要的研究意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种双启动子Psrf-Pcry3Aa自诱导型重组枯草芽孢杆菌的构建方法及其在制备海藻糖中的应用。

本发明技术方案如下：

一种重组载体，其特征在于，在穿梭质粒PHT01的KpnI和BamHI两个酶切位点之间插入通过重叠PCR技术连接优化了的启动子Psrf基因与优化了的启动子Pcry3Aa基因获得的双启动子Psrf-Pcry3Aa基因，在BamHI和AatII两个酶切位点之间插入由柔性连接肽连接得到的RDPE蛋白和海藻糖合成酶TreS的融合蛋白基因；

所述的优化了的启动子Psrf基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的优化了的启动子Pcry3Aa基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的RDPE蛋白基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的海藻糖合成酶基因TreS基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

上述重组质粒载体的制备方法，步骤如下：

(i)以枯草芽孢杆菌subtilis168菌体的DNA为模板，进行PCR扩增，扩增得到启动子基因片段Psrf-1和Psrf-2，通过重叠PCR技术将两个片段连接起来得到优化的Psrf片段；

所述的PCR引物序列如下：

Psrf-1-F(上游引物)：

5'-GGTACC>

Psrf-1-R(下游引物)：

5'-ACGAAAAATGGGTGAAAAGTTTCATGCGGGATGCCGAAA-3'；

Psrf-2-F(上游引物)：

5'-AAACTTTTCACCCATTTTTCGAAAACATTTTTTTCATTGAACGGTAGA-3'；

Psrf-2-R(下游引物)：

5'-AAAAAAAGCACATTGTCATACCTCCCCTAATCT-3'；

其中单下划线为酶切位点KpnI，双下划线为启动子Psrf的-35和-10关键区域，-35区由原来的“GTGATA”突变为“TTGACT”，-10区由原来的“TAAACT”突变为“TATAAT”；该关键区域的突变为了提高启动子Psrf的启动转录表达；

(ii)提取苏云芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)LM79菌体的基因组，以基因组为模板，进行PCR扩增，得到优化了的Pcry3Aa启动子片段；

所述的PCR引物序列如下：

Pcry3Aa-F(上游引物)：5'-TTAGGGGAGGTATGACAATGTGCTTTTTTT

GTGAAGAATTATTAATGTTA-3'；

Pcry3Aa-R(下游引物)：5'-CGCGGATCCTTTTCTTCCTCCCTTTCTT-3'；

其单下划线为酶切位点BamHI；双下划线为启动子Pcry3Aa的-35和-10关键区域，-35区由原来的“TTGCAA”突变为“TTGACT”，-10区由原来的“TAAGCT”突变为“TATAAT”；该关键区域的突变为了提高启动子Pcry3Aa的启动转录表达；

(iii)将步骤(i)制得的优化的Psrf基因片段和步骤(ii)制得的优化的Pcry3Aa基因片段通过重叠PCR技术连接，制得Psrf-Pcry3Aa基因片段；

(iv)将步骤(iii)制得的Psrf-Pcry3Aa片段连接到pTOPO-Blunt vector上，制得pTOPO-Blunt-Psrf-Pcry3Aa质粒载体；然后用限制性内切酶KpnI和BamHI对pTOPO-Blunt-Psrf-Pcry3Aa质粒载体和PHT01质粒进行双酶切，然后采用T4连接酶连接，制得重组质粒Psrf-Pcry3Aa-PHT01；

(v)以瘤胃球菌Ruminococcus sp.5_1_39BFAA的基因组为模板，进行PCR扩增，扩增得到RDPE蛋白基因片段；

所述的PCR引物序列如下：

RDPE-F:5'-CGCGGATCCATGAAATATGGTATTTATTACGCTTATT--3'

RDPE-R:5'-TGACTTCAAATACATGTTTTA CAAA-3'

其中单下划线为酶切位点BamHI，双下划线为柔性连接肽基因序列，作为融合蛋白的连接桥梁，RDPE基因的终止密码子TAA去除。

(vi)以恶臭假单胞杆菌Pseudomonas putida KT2440的基因组为模板，经PCR扩增得到海藻糖合成酶基因片段TreS；

所述的PCR引物序列如下：

上游引物(TreS-F)：5’-TTGAAGTCACCCAGCCCGACC-3’

下游引物(TreS-R)：5’-CCCAAAGACGTCTCAAACATGCCCGCTGC-3’

其中单下划线为酶切位点为AatII,双下划线为柔性连接肽,TreS基因的起始密码子ATG去除；

(vii)将步骤(v)制得的RDPE基因片段和步骤(vi)制得的TreS基因片段通过重叠PCR技术连接，制得RDPE-TreS基因片段；

(viii)将步骤(vi)制得的RDPE-TreS片段连接到pTOPO-Blunt vector上，制得pTOPO-Blunt-RDPE-TreS质粒载体；然后用限制性内切酶BamHI和AatII对pTOPO-Blunt-RDPE-TreS质粒载体和Psrf-Pcry3Aa-PHT01质粒进行双酶切，然后采用T4连接酶连接，制得重组质粒Psrf-Pcry3Aa-PHT01-RDPE-TreS。

根据本发明优选的，所述步骤(i)中，PCR扩增体系如下，总体系50μl：

2×Phanta Max Master Mix 25μl，浓度10μmol/L的上游引物2.5μl，浓度10μmol/L的下游引物2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，57℃退火15sec，72℃延伸15sec，30个循环；72℃延伸5min，-20℃保存；

根据本发明优选的，所述步骤(i)中，重叠PCR扩增体系如下，总体系50μl：

初次扩增体系为25μl：

Psrf-1片段4μl；Psrf-2片段4μl；2×Phanta Max Master Mix 12.5μl；ddH₂O>

初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；94℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸15sec，5个循环，72℃延伸2min；

补充扩增体系为25μl：

上游引物Psrf-1-F 2μl；下游引物Psrf-2-R 2μl；2×Phanta Max Master Mix12.5μl；ddH₂O8.5μl；

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，56℃退火15sec，72℃延伸15sec，30个循环；72℃延伸5min，-20℃保存；

根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，PCR扩增体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μl，浓度10μmol/L的上游引物2.5μl，浓度10μmol/L的下游引物2.5μl，模板2.5μl，ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，51℃退火15sec，72℃延伸15sec，30个循环；72℃延伸5min，-20℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(iii)中，重叠PCR扩增体系如下，总体系50μl：

初次扩增体系为25μl：Psrf启动子片段4μl；Pcry3Aa启动子片段4μl；2×PhantaMaxMaster Mix 12.5μl；ddH₂O>

初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec，5个循环，72℃延伸2min；

补充扩增体系为25μl：浓度10μmol/L的上游引物Psrf-1-F 2μl；浓度10μmol/L的下游引物Pcry3Aa-R 2μl；2×Phanta Max Master Mix 12.5μl；ddH₂O>

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸30sec，30个循环，72℃延伸5min，-20℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(v)中，所述的PCR扩增体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μl，浓度10μmol/L的上游引物2.5μl，浓度10μmol/L的下游引物2.5μl，模板2.5μl，ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，51℃退火15sec，72℃延伸15sec，30个循环；72℃延伸5min，-20℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(v)中，PCR扩增体系如下，总体系50μl：

2×Phanta Max Master Mix 25μl，浓度10μmol/L的上游引物2.5μl，浓度10μmol/L的下游引物2.5μl，模板2.5μl，ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，54℃退火25sec，72℃延伸15sec，30个循环；72℃延伸5min，-20℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(vii)中，重叠PCR扩增体系如下，总体系50μl：

初次扩增体系为25μl：RDPE基因片段4μl；TreS基因片段4μl；2×Phanta MaxMasterMix 12.5μl；ddH₂O>

初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，65℃退火15sec，72℃延伸30sec，5个循环，72℃延伸2min；

补充扩增体系为25μl：浓度10μmol/L的上游引物RDPE-F 2μl；浓度10μmol/L的下游引物TreS-R 2μl；2×Phanta Max Master Mix 12.5μl；ddH₂O>

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，63℃退火15sec，72℃延伸30sec，30个循环，72℃延伸5min，-20℃保存。

一种双启动子自诱导型重组枯草芽孢杆菌的构建方法，步骤如下：

将上述重组质粒Psrf-Pcry3Aa-PHT01-RDPE-TreS电转化至枯草芽孢杆菌WB800n中，经筛选，制得双启动子自诱导型重组枯草芽孢杆菌。

根据本发明进一步优选的，所述电转化的条件为：在1500V、5ms的电击条件下电击转化。

根据本发明进一步优选的，所述筛选，为采用氯霉素筛选。所述氯霉素筛选为本领域常规技术，具体如下：

在含有抗生素平板上进行白斑筛选，挑取白色单一斑点，接种到含有氯霉素的液体LB培养基，培养至对数末期，对能在含有抗生素的LB培养基上生长的菌液进行PCR验证，将能够扩增出目的条带的转化子进行提取质粒，对提取的质粒进行酶切验证，得到目的条带。

所述的LB培养基配方如下：

10g/L蛋白胨、5g/L的酵母浸粉、10g/L的NaCl、pH7.0。

上述构建方法制得的双启动子自诱导型重组枯草芽孢杆菌。

上述双启动子自诱导型重组枯草芽孢杆菌在制备海藻糖合成酶中的应用。

原理说明

本发明采用双启动子表达系统，利用来源于枯草芽孢杆菌细胞密度诱导型的启动子Psrf和来源于苏云金芽孢杆菌的产Cry3Aa杀虫晶体蛋白的高效表达启动子Pcry3Aa进行融合得到双启动子Psrf-Pcry3Aa的转录表达系统。两种表达系统均属于自诱导型表达系统，经发明人研究发现，Psrf启动子在营养生长期由细胞密度的增加而高效启动转录，Pcry3Aa启动子被营养生长末期以及稳定期的大量存在的E-σ^A因子识别并结合启动转录，因此两者的结合共同构成了自诱导型的高效表达的转录系统。此外，本发明对两个启动子的E-σ^A的识别结合位点-35区和-10区进行了引物定点突变优化，定点突变提高了两个启动子在枯草芽孢杆菌中启动转录效率，从而得到双启动子表达载体Psrf-Pcry3Aa-PHT01。

本发明利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶(RDPE)的非经典分泌蛋白，该分泌蛋白没有信号肽序列，不需要经过Sec型和Tat型的复杂的分泌途径，目的蛋白与该非经典分泌蛋白的融合分泌效率高达50％以上，同时将近83％的目的蛋白与该分泌蛋白融合达到了分泌效果。本发明将该非经典分泌蛋白基因与海藻糖合成酶基因通过柔性连接肽融合，构建到双启动子表达载体Psrf-Pcry3Aa-PHT01上，得到海藻糖合成酶在营养生长期和稳定期都高效分泌的表达载体Psrf-Pcry3Aa-PHT01-RDPE-TreS，然后通过电转化方法转化到B.subtilisWB800n中，得到自诱导型重组枯草芽孢杆菌高产海藻糖合成酶的表达菌株B.subtilisWB800n(Psrf-Pcry3Aa-PHT01-RDPE-TreS)。

有益效果

1、本发明采用双启动子Psrf-Pcry3Aa自诱导型表达系统自发诱导合成海藻糖合成酶的效果显著优于其它单自诱导型启动子和诱导型启动子表达的效果；

2、本发明采用的双启动子表达系统都是自诱导型转录表达系统，不需要添加任何的诱导剂诱发，使其制备的海藻糖合成酶具有符合食品安全级别酶制剂的要求，以及制得的海藻糖能够在食品医疗行业得到广泛应用；

3、本发明利用新型的非经典分泌蛋白RDPE，与海藻糖合成酶基因融合得到融合蛋白，海藻糖合成酶在枯草芽孢杆菌中分泌效率要优于其它分泌途径。

4、本发明对双启动子的E-σ^A因子识别并结合区域-35和-10区都分别进行了定点突变优化，使其更偏好于枯草芽孢杆菌的E-σ^A因子识别序列，使双启动子Psrf-Pcry3Aa启动转录表达海藻糖合酶，其效果更加显著。

附图说明

图1、Psrf-Pcry3Aa-PHT01-RDPE-TreS质粒的构建过程示意图；

图2、对比例1所述不同重组工程菌的海藻糖合成酶的胞内外酶活曲线图；

图3、对比例2所述不同突变启动子菌株发酵40h后转化得到的海藻糖含量三维峰值图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源：

枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis)购自杭州宝赛生物有限公司；

枯草芽孢杆菌WB800n购自杭州宝赛生物有限公司；

恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)KT2440购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)LM79购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；

瘤胃球菌Ruminococcus sp.5_1_39BFAA购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；

穿梭质粒PHT01购自杭州宝赛生物有限公司；

pTOPO-Blunt vector购自艾德莱生物科技有限公司；

限制性内切酶BamHI和NotI购自北京全式金生物技术有限公司

实施例1

先将来源于枯草芽孢杆菌168的细胞密度诱导型启动子基因Psrf启动子和来源于苏云芽孢杆菌的Pcry3Aa启动子进行关键区域-35和-10区的引物定点突变的优化，然后通过重叠PCR技术将两个启动子基因重叠，得到双启动子Psrf-Pcry3Aa片段，将其构建到穿梭质粒PHT01得到重组质粒Psrf-Pcry3Aa-PHT01。

(i)以枯草芽孢杆菌subtilis168菌体的DNA为模板，进行PCR扩增，扩增得到启动子基因片段Psrf-1和Psrf-2，通过重叠PCR技术将两个片段连接起来得到优化的Psrf片段；

所述的PCR引物序列如下：

Psrf-1-F(上游引物)：

5'-GGTACC>

Psrf-1-R(下游引物)：

5'-ACGAAAAATGGGTGAAAAGTTTCATGCGGGATGCCGAAA-3'；

Psrf-2-F(上游引物)：

5'-AAACTTTTCACCCATTTTTCGAAAACATTTTTTTCATTGAACGGTAGA-3'；

Psrf-2-R(下游引物)：

5'-AAAAAAAGCACATTGTCATACCTCCCCTAATCT-3'；

其中单下划线为酶切位点KpnI，双下划线为启动子Psrf的-35和-10关键区域，-35区由原来的“GTGATA”突变为“TTGACT”，-10区由原来的“TAAACT”突变为“TATAAT”；

所述的PCR扩增体系如下，总体系50μl：

2×Phanta Max Master Mix 25μl，浓度10μmol/L的上游引物 2.5μl，浓度10μmol/L的下游引物 2.5μl，模板 2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，57℃退火15sec，72℃延伸15sec，30个循环；72℃延伸5min，-20℃保存；

所述重叠PCR扩增体系如下，总体系50μl：

初次扩增体系为25μl：Psrf-1片段4μl；Psrf-2片段4μl；2×Phanta Max MasterMix 12.5μl；ddH₂O>

初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；94℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸15sec，5个循环，72℃延伸2min；

补充扩增体系为25μl：上游引物Psrf-1-F 2μl；下游引物Psrf-2-R 2μl；2×Phanta Max MasterMix 12.5μl；ddH₂O>

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，56℃退火15sec，72℃延伸15sec，30个循环；72℃延伸5min，-20℃保存；

经检测，制得优化后的Psrf启动子的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示；

(ii)提取苏云芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)LM79菌体的基因组，以基因组为模板，进行PCR扩增，得到优化了的Pcry3Aa启动子片段；

所述的PCR引物序列如下：

Pcry3Aa-F(上游引物)：5'-TTAGGGGAGGTATGACAATGTGCTTTTTTT

GTTGAAGAATTATTAATGTTA-3'；

Pcry3Aa-R(下游引物)：5'-CGCGGATCCTTTTCTTCCTCCCTTTCTT-3'；

其单下划线为酶切位点BamHI；双下划线为启动子Pcry3Aa的-35和-10关键区域，-35区由原来的“TTGCAA”突变为“TTGACT”，-10区由原来的“TAAGCT”突变为“TATAAT”；

所述的PCR扩增体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μl，浓度10μmol/L的上游引物 2.5μl，浓度10μmol/L的下游引物 2.5μl，模板 2.5μl，ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，51℃退火15sec，72℃延伸15sec，30个循环；72℃延伸5min，-20℃保存；

经检测，制得优化后的Pcry3Aa启动子的核苷酸序列SEQ ID NO.2所示；

(iii)将步骤(i)制得的优化的Psrf基因片段和步骤(ii)制得的优化的Pcry3Aa基因片段通过重叠PCR技术连接，制得Psrf-Pcry3Aa基因片段。

所述重叠PCR扩增体系如下，总体系50μl：

初次扩增体系为25μl：Psrf启动子片段 4μl；Pcry3Aa启动子片段 4μl；2×PhantaMaxMaster Mix 12.5μl；ddH₂O>

初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec，5个循环，72℃延伸2min；

补充扩增体系为25μl：浓度10μmol/L的上游引物Psrf-1-F 2μl；浓度10μmol/L的下游引物Pcry3Aa-R 2μl；2×Phanta Max Master Mix 12.5μl；ddH₂O>

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸30sec，30个循环，72℃延伸5min，-20℃保存；

(iv)将步骤(iii)制得的Psrf-Pcry3Aa片段连接到pTOPO-Blunt vector上，制得pTOPO-Blunt-Psrf-Pcry3Aa质粒载体；然后用限制性内切酶KpnI和BamHI对pTOPO-Blunt-Psrf-Pcry3Aa质粒载体和PHT01质粒进行双酶切，然后采用T4连接酶连接，制得重组质粒Psrf-Pcry3Aa-PHT01；

所述Psrf-Pcry3Aa片段连接到pTOPO-Blunt vector的连接体系如下，总体系10μl：

Psrf-Pcry3Aa片段 4μl；pTOPO-Blunt vector 1μl；10×Enhancer 1μl；ddH₂O>

反应条件：室温连接5min；

所述pTOPO-Blunt-Psrf-Pcry3Aa质粒载体双酶切体系如下，总体系25μl：

BamHI内切酶 1μl；NotI内切酶 1μl；10×loading buffer 4μl；pTOPO-Blunt-Psrf-Pcry3Aa16μl；ddH₂O>

反应条件：37℃恒温30min酶切；

PHT01质粒双酶切体系如下，总体系25μl：

BamHI内切酶 1μl；NotI内切酶 1μl；10×loading buffer 4μl；PHT01质粒 16μl；ddH₂O4μl；

反应条件：37℃恒温30min酶切；

所述T4连接酶连接体系如下，总体系10μl：

T₄连接酶>

反应条件：16℃连接过夜。

实施例2

将来源于瘤胃球菌Ruminococcus sp.5_1_39BFAA的非经典分泌蛋白RDPE基因与来源于恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)KT2440的海藻糖合成酶基因TreS通过柔性连接肽序列融合得到融合片段RDPE-TreS，将其构建到双启动子表达载体Psrf-Pcry3Aa-PHT01上，得到重组质粒Psrf-Pcry3Aa-PHT01-RDPE-TreS。

(v)以瘤胃球菌Ruminococcus sp.5_1_39BFAA的基因组为模板，进行PCR扩增，扩增得到RDPE蛋白基因片段；

所述的PCR引物序列如下：

RDPE-F:5'-CGCGGATCCATGAAATATGGTATTTATTACGCTTATT--3'

RDPE-R:5'-TGACTTCAAATACATGTTTTA CAAA-3'

其中单下划线为酶切位点BamHI，双下划线为柔性连接肽基因序列，作为融合蛋白的连接桥梁，RDPE基因的终止密码子TAA去除。

所述的PCR扩增体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μl，浓度10μmol/L的上游引物 2.5μl，浓度10μmol/L的下游引物 2.5μl，模板 2.5μl，ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，51℃退火15sec，72℃延伸15sec，30个循环；72℃延伸5min，-20℃保存；

经检测，非经典分泌蛋白RDPE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(vi)以恶臭假单胞杆菌Pseudomonas putida KT2440的基因组为模板，经PCR扩增得到海藻糖合成酶基因片段TreS；

所述的PCR引物序列如下：

上游引物(TreS-F)：5’-TTGAAGTCACCCAGCCCGACC-3’

下游引物(TreS-R)：5’-CCCAAAGACGTCTCAAACATGCCCGCTGC-3’

其中单下划线为酶切位点为AatII，双下划线为柔性连接肽，TreS基因的起始密码子ATG去除；

所述的PCR扩增体系如下，总体系50μl：

2×Phanta Max Master Mix 25μl，浓度10μmol/L的上游引物 2.5μl，浓度10μmol/L的下游引物 2.5μl，模板 2.5μl，ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，54℃退火25sec，72℃延伸15sec，30个循环；72℃延伸5min，-20℃保存；

经检测，海藻糖合成酶基因TreS的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(vii)将步骤(v)制得的RDPE基因片段和步骤(vi)制得的TreS基因片段通过重叠PCR技术连接，制得RDPE-TreS基因片段；

所述重叠PCR扩增体系如下，总体系50μl：

初次扩增体系为25μl：RDPE基因片段 4μl；TreS基因片段 4μl；2×Phanta MaxMasterMix 12.5μl；ddH₂O>

初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，65℃退火15sec，72℃延伸30sec，5个循环，72℃延伸2min；

补充扩增体系为25μl：浓度10μmol/L的上游引物RDPE-F 2μl；浓度10μmol/L的下游引物TreS-R 2μl；2×Phanta Max Master Mix 12.5μl；ddH₂O>

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，63℃退火15sec，72℃延伸30sec，30个循环，72℃延伸5min，-20℃保存；

(viii)将步骤(vii)制得的RDPE-TreS片段连接到pTOPO-Blunt vector上，制得pTOPO-Blunt-RDPE-TreS质粒载体；然后用限制性内切酶BamHI和AatII对pTOPO-Blunt-RDPE-TreS质粒载体和Psrf-Pcry3Aa-PHT01质粒进行双酶切，然后采用T4连接酶连接，制得重组质粒Psrf-Pcry3Aa-PHT01-RDPE-TreS；

所述RDPE-TreS片段连接到pTOPO-Blunt vector的连接体系如下，总体系10μl：

RDPE-TreS片段 4μl；pTOPO-Blunt vector 1μl；10×Enhancer 1μl；ddH₂O>

反应条件：室温连接5min；

所述pTOPO-Blunt-RDPE-TreS质粒载体双酶切体系如下，总体系25μl：

BamHI内切酶 1μl；AatII内切酶 1μl；10×loading buffer 4μl；pTOPO-Blunt-RDPE-TreS16μl；ddH₂O>

反应条件：37℃恒温30min酶切；

Psrf-Pcry3Aa-PHT01质粒双酶切体系如下，总体系25μl：

BamHI内切酶 1μl；AatII内切酶 1μl；10×loading buffer 4μl；Psrf-Pcry3Aa-PHT01质粒 16μl；ddH₂O>

反应条件：37℃恒温30min酶切；

所述T4连接酶连接体系如下，总体系10μl：

T₄连接酶>

反应条件：16℃连接过夜。

实施例3

将实施例2制得的重组质粒Psrf-Pcry3Aa-PHT01-RDPE-TreS转化到B.subtilisWB800n菌株，筛选有氯霉素抗性的克隆转化子，制得双启动子自诱导型重组枯草芽孢杆菌。该重组菌能够高表达海藻糖合成酶，命名为B.subtilis WB800n(Psrf-Pcry3Aa-PHT01-RDPE-TreS)。

所述重组质粒Psrf-Pcry3Aa-PHT01-RDPE-TreS转化到重组枯草芽孢杆菌B.subtilisWB800n的步骤如下：

将重组质粒在1500V、5ms的电击条件下电击转化到重组枯草芽孢杆菌B.subtilisWB800n感受态细胞中，氯霉素筛选，即得。

所述筛选有氯霉素抗性的克隆转化子的步骤，具体如下：

在含有抗生素平板上进行白斑筛选，挑取白色单一斑点，接种到含有氯霉素的液体LB培养基，培养至对数末期，对能在含有抗生素的LB培养基上生长的菌液进行PCR验证，将能够扩增出目的条带的转化子进行提取质粒，对提取的质粒进行酶切验证，得到目的条带。

含有抗生素平板(100ml)组分如下：

蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl 1g，琼脂粉2g，250μg氯霉素。

实施例4

利用实施例3制得的双启动子自诱导型重组枯草芽孢杆菌在生产海藻糖合成酶中的应用，步骤如下：

1)一级种的制备：从含氯霉素20μg/mL的LB平板上转接实施例3制得的双启动子自诱导型重组枯草芽孢杆菌菌株单菌落在3mL LB液体培养基37℃、200rpm培养过夜，所得的菌种为一级种；

2)二级种的制备：一级种接种于含氯霉素20μg/mL的800mL LB液体培养基中，于37℃、200rpm培养至OD₆₀₀为0.9(4.5小时)；

3)三级种的制备：将二级种接种到80L LB液体发酵罐中，37℃，以柠檬酸、NaOH控制pH7.0，通风搅拌，溶氧控制在20～30％，培养至OD₆₀₀为0.9(4.5小时)；

4)生产罐发酵：将三级种接种到3吨发酵罐中，LB液体培养基，36～37℃，通风搅拌，溶氧控制在20～30％，以柠檬酸、NaOH控制pH6～8，培养40小时，10000g离心除菌，用截留分子量5000～10000超滤膜浓缩上清液后，制得海藻糖合成酶浓缩原液；

5)海藻糖合成酶酶活的测定按如下方法进行：

取1mL制得的海藻糖合成酶浓缩原液与1mL质量浓度为60％的麦芽糖溶液(用50mMpH6.5磷酸缓冲液配制)混合，混匀后在37℃反应30min，反应液10000rpm离心3min取上清。

用按还原糖测定方法(3,5-二硝基水杨酸比色法)测定还原糖含量。

对照样取1ml质量浓度为60％的麦芽糖溶液与1ml 50mM pH6.5磷酸缓冲液混合，37℃反应30min，10000rpm离心3min取上清，同上方法测定还原糖含量。

活力单位(U)定义为1ml酶液在pH8.0、37℃条件下，每分钟转化1μg麦芽糖为非还原糖为一个海藻糖合成酶活力单位。

计算方法如下：

U(μg/ml·min)＝(V₁×M×(OD₁-OD₂)/OD₁)/(T×V₂)＝(1ml×100mg/ml×(OD₁-OD₂)/OD₁×1000)/(30min×1ml)

V₁：底物体积(ml)，V₂：参加反应的酶液体积(ml)，M：底物溶度(mg/ml)，OD₁：对照样测还原糖时的吸光值，OD₂：样品测还原糖的吸光值，1000：mg转化成μg的系数，T：酶反应时间(min)。

经测定，发酵原液离心后，枯草芽孢杆菌基因工程菌株发酵表达的最高酶活见表1：

表1

对比例1

采用中国专利文献CN105861536A(申请号201610246849.6)中记载的枯草芽孢杆菌基因工程菌株WB800n[Psrf-PhoD-TreS-pMA5-ComQ-ComX,ΔabrB]按照实施例4中所记载的过程进行发酵。

经检测，工程菌株WB800n[Psrf-PhoD-TreS-pMA5-ComQ-ComX,ΔabrB]与工程菌WB800n[Psrf-Pcry3Aa-PHT01-RDPE-TreS]在对数生长期酶活增加速度相当，然而培养到稳定期以及后期时，双自诱导型启动子表达系统表达海藻糖合成酶的胞内外酶活均高于单自诱导型启动子表达系统，并且双自诱导型启动子表达系统在稳定期酶活一直不断增加，充分发挥双启动子中的Pcry3Aa启动子在稳定期高效转录表达的功能，因此，双自诱导型启动子表达菌株WB800n[Psrf-Pcry3Aa-PHT01-RDPE-TreS]表达酶活性更强，如图2所示。

对比例2

通过液相色谱仪(流动相为乙腈：水＝3:1)测定均未突变双启动子和双启动子中的单个启动子突变以及双启动子均突变的菌株发酵40h后转化得到的海藻糖含量，如图3所示，结果分析可知，双启动子均未突变的菌株表达海藻糖合酶的酶活较低，单个启动子突变的菌株海藻糖合成酶的表达量相对于均未突变的菌株提高了1.5倍，而双启动子均突变的菌株海藻糖合成酶的表达量接近单个启动子突变菌株表达量的2倍，表达效果明显。

结果分析

实现海藻糖合成酶的高效分泌表达，在于该技术将两种高效转录的自诱导型的启动子Psrf和启动子Pcry3Aa融合启动转录，使其转录水平较单个启动子来说提高了40％以上，同时两种启动子分别包含了营养生长期和稳定期的高效表达水平，为提高海藻糖合成酶的分泌表达提供了前提条件。海藻糖合成酶的高效分泌在于该技术利用了新型的非经典分泌蛋白RDPE，在分泌过程中不需要sec型和Tat型的复杂分泌途径，自身也无信号肽序列，可与海藻糖合成酶直接分泌到胞外，提高了目的蛋白的分泌效率，使其分泌效率达到了50％以上。因此，本发明技术的利用是实现海藻糖合成酶高效分泌表达的重要体现。