肝癌特异性启动子调控的双靶位慢病毒载体的构建、鉴定及其在肝癌基因治疗中的应用

摘要

目的 探讨survivin-CMV特异性启动子调控的双靶点慢病毒对肝癌细胞生长的影响.方法 RT-PCR扩增anti-AFP-scFv,测序鉴定,双酶切连接,获得pMD2G-anti-AFP-scFv质粒.针对已经筛选确定的IGFIR基因干扰有效序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与质粒pPRIME连接得到pPRIME-miR30-shRNA-IGFlR质粒.RT-PCR扩增survivin-CMV肝癌特异性启动子,测序鉴定,与双酶切的质粒pPRIME-miR30-shRNA-IGFlR连接,得到质粒sur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGFIR.用.ur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGFIR,psPAX2,pMD2G-anti-AFP-scFv共转染293T细胞,经过病毒空斑纯化,包装成慢病毒,测定病毒滴度.RT-PCR、Westemblot检测IGFIR表达,竟争抑制实验检测抗人AFP单链抗体活性.CCK-8法检测细胞生长.结果 成功构建survivin-CMV肝癌特异性启动子调控的慢病毒AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGFIR;滴度为4.58×10～9PFU/mL;AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGFIR抑制了肝癌细胞IGFlR表达,竞争实验显示抗人AFP单链抗体的基因高效表达,该慢病毒抑制肝癌细胞的生长.结论 本次实验构建的慢病毒载体具有良好的靶向性,为肝癌生物治疗奠定了理论基础,提供了新的思路.