人碱性磷酸酶糖蛋白的癌细胞高效表达系统及其应用

摘要

本发明公开了一种人骨肉瘤细胞系MG‑63在外源表达人碱性磷酸酶糖蛋白中的应用，以及rhALP的外源表达方法，包括如下步骤：(1)构建含有rhALP的重组质粒；(2)将重组质粒整合至人骨肉瘤MG‑63细胞内，获得能够表达rhALP的人骨肉瘤MG‑63细胞；(3)培养上述能够表达rhALP的人骨肉瘤MG‑63细胞，提取目的蛋白。本发明利用癌细胞MG‑63快速增殖及糖基化修饰系统的特性，通过基因工程技术利用人源癌细胞表达重组人碱性磷酸酶rhALP。本发明构建rhALP的重组表达载体，筛选能高效表达rhALP的MG‑63细胞；纯化并检测重组rhALP的糖基化状态及其生物学活性。重组rhALP的表达量和活性得到了极大的提高。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人碱性磷酸酶糖蛋白的癌细胞高效表达系统及其应用。

背景技术

碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)是一种磷酸单酯酶，通过磷脂酰肌醇聚糖定位于细胞膜上可以水解细胞外基质中的磷酸代谢底物，分离出无机磷，促进形成矿化结晶。ALP基因突变导致血清及骨组织中ALP活性下降而造成的骨骼及牙齿发育缺陷及矿化异常。有报道利用ALP重组蛋白治疗模式小鼠的低碱性磷酸酯酶症取得了成功，并且在临床试验中对重症低碱性磷酸酯酶症患者治疗也获得了满意的效果。

人组织非特异性碱性磷酸酶(hALP)在基因组中跨度约50kb，共有12个外显子，编码524个氨基酸。hALP是一种二聚体糖蛋白，在其二聚体形式时具有生物学活性，单体或无糖基化的碱性磷酸酶没有生物活性或生物活性很低。

目前蛋白表达系统主要有原核表达系统、酵母表达系统、植物表达系统、昆虫表达系统及哺乳动物表达系统。用原核系统大肠杆菌表达的人碱性磷酸酶生物活性很低，而且不稳定，这可能是由于原核表达系统缺乏翻译后修饰功能。毕赤酵母虽然具有翻译后修饰功能，但糖基化形式与人类存在差异且只能表达单体形式的人碱性磷酸酶。昆虫及植物表达系统虽具有负责的蛋白翻译后加工修饰系统，但是考虑到其糖基化差异的问题，也不适合表达应用于临床治疗的人碱性磷酸酶。研究表明哺乳动物CHO细胞表达的人碱性磷酸酶是二硫键连接的成熟的二聚体，具有生物学活性，有效地降低过剩焦磷酸无机(PPi)和恢复正常的矿化作用，但是表达量的水平较低。

综上，现有的rhALP的外源表达技术尚不成熟，仍存在产量低、活性低、成本高等问题，不能满足市场需求。因此，开发新的rhALP外源表达方法具有十分重要的意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种人碱性磷酸酶糖蛋白的癌细胞高效表达系统及其应用。

本发明中所称的人碱性磷酸酶糖蛋白即为重组人组织非特异性碱性磷酸酶(rhALP)。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明的第一方面，提供人骨肉瘤细胞系MG-63在外源表达人碱性磷酸酶糖蛋白中的应用。

上述应用中，人骨肉瘤细胞系MG-63作为人碱性磷酸酶糖蛋白的表达系统。

人骨肉瘤细胞系MG-63源自患者的骨肉瘤，与一般的癌细胞不同，在MG-63中未检测到SV40，RSV或腺病毒等病毒，在免疫抑制小鼠中不致瘤，具有较高的安全性；而且，MG-63还具有快速增殖及糖基化修饰系统的特性，因此，本发明选择人骨肉瘤细胞系MG-63作为人碱性磷酸酶糖蛋白的表达系统，用于外源表达人碱性磷酸酶糖蛋白。

本发明的第二方面，提供一种rhALP的外源表达方法，包括如下步骤：

(1)构建含有rhALP的重组质粒；

(2)将重组质粒整合至人骨肉瘤MG-63细胞内，获得能够表达rhALP的人骨肉瘤MG-63细胞；

(3)培养上述能够表达rhALP的人骨肉瘤MG-63细胞，提取目的蛋白。

步骤(1)中，所述重组质粒的构建方法为：设计合成rhALP基因片段，克隆至真核表达载体pcDNA3.1中，即构建得到含有rhALP的重组质粒。

优选的，上述设计合成的rhALP基因片段的5’端添加Hind III酶切位点，3’端添加Xho I酶切位点。

进一步优选的，所述rhALP基因片段的序列如SEQ ID NO.1所示。

步骤(2)中，所述整合采用的方法为质粒转染，具体如下：

利用Lipofectamine 2000转染MG-63，转染后利用400μg/mL的G418筛选稳定转染rhALP的MG-63细胞。

步骤(3)中，提取目的蛋白的方法为：裂解能够表达rhALP的人骨肉瘤MG-63细胞，离心，弃去细胞碎片，收集离心上清。

上述方法表达的rhALP也是本发明的保护范围，所述rhALP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的有益效果：

(1)与一般在癌细胞中表达蛋白，研究其癌细胞迁移和侵袭转移的影响不同，本发明在蛋白表达体系选择过程中，充分考虑了表达体系对重组蛋白的表达量、活性、以及安全性和稳定性的影响。研究结果表明：本发明采用的MG-63表达系统具有快速增殖及高效的翻译后修饰系统的特性，能够高效表达高活性的rhALP；而且在MG-63表达系统中未检测到SV40，RSV或腺病毒等病毒，具有较高的安全性，提供了一种新的rhALP外源表达系统，为大规模制备碱性磷酸酶奠定了基础。

另外，MG-63虽然属于人骨肉瘤细胞系，但人骨肉瘤细胞系的种类众多，功能各异，并非所有的人骨肉瘤细胞系都可以用于作为蛋白表达系统；而且目前对于MG-63的研究主要集中于如何抑制MG-63的增殖与转移，本发明系首次提出利用MG-63作为蛋白表达系统外源表达高活性的rhALP。

(2)针对二聚体糖蛋白rhALP在外源表达过程中所存在的产量低、活性低等问题，本发明利用癌细胞MG-63快速增殖及糖基化修饰系统的特性，通过基因工程技术利用人源癌细胞表达重组人碱性磷酸酶rhALP。本发明构建rhALP的重组表达载体，筛选能高效表达rhALP的MG-63细胞；纯化并检测重组rhALP的糖基化状态及其生物学活性，重组rhALP的表达量和活性得到了极大的提高。

附图说明

图1：重组质粒rhALP-pcDNA3.1构建流程图；

图2：人骨肉瘤MG-63细胞表达的rhALP蛋白的western blot验证图；

图3：ALP糖基化检测结果。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

本发明实施例中所用到的试剂、酶、表达载体等均为现有技术中的常规产品。

实施例1：rhALP的外源表达方法

具体方法如下：

1.重组质粒的构建：

(1)目的基因片段的设计与合成：

在ALP成熟肽基因序列5’端添加Hind III酶切位点，ALP成熟肽基因序列3’端添加Xho I酶切位点。设计后的人ALP基因(rhALP)序列合成，设计后的rhALP基因序列如下：

AAGCTTATGTTAGTGCCAGAGAAAGAGAAAGACCCCAAGTACTGGCGAGACCAAGCGCAAGAGACACTGAAATATGCCCTGGAGCTTCAGAAGCTCAACACCAACGTGGCTAAGAATGTCATCATGTTCCTGGGAGATGGGATGGGTGTCTCCACAGTGACGGCTGCCCGCATCCTCAAGGGTCAGCTCCACCACAACCCTGGGGAGGAGACCAGGCTGGAGATGGACAAGTTCCCCTTCGTGGCCCTCTCCAAGACGTACAACACCAATGCCCAGGTCCCTGACAGTGCCGGCACCGCCACCGCCTACCTGTGTGGGGTGAAGGCCAATGAGGGCACCGTGGGGGTAAGCGCAGCCACTGAGCGTTCCCGGTGCAACACCACCCAGGGGAACGAGGTCACCTCCATCCTGCGCTGGGCCAAGGACGCTGGGAAATCTGTGGGCATTGTGACCACCACGAGAGTGAACCATGCCACCCCCAGCGCCGCCTACGCCCACTCGGCTGACCGGGACTGGTACTCAGACAACGAGATGCCCCCTGAGGCCTTGAGCCAGGGCTGTAAGGACATCGCCTACCAGCTCATGCATAACATCAGGGACATTGACGTGATCATGGGGGGTGGCCGGAAATACATGTACCCCAAGAATAAAACTGATGTGGAGTATGAGAGTGACGAGAAAGCCAGGGGCACGAGGCTGGACGGCCTGGACCTCGTTGACACCTGGAAGAGCTTCAAACCGAGATACAAGCACTCCCACTTCATCTGGAACCGCACGGAACTCCTGACCCTTGACCCCCACAATGTGGACTACCTATTGGGTCTCTTCGAGCCAGGGGACATGCAGTACGAGCTGAACAGGAACAACGTGACGGACCCGTCACTCTCCGAGATGGTGGTGGTGGCCATCCAGATCCTGCGGAAGAACCCCAAAGGCTTCTTCTTGCTGGTGGAAGGAGGCAGAATTGACCACGGGCACCATGAAGGAAAAGCCAAGCAGGCCCTGCATGAGGCGGTGGAGATGGACCGGGCCATCGGGCAGGCAGGCAGCTTGACCTCCTCGGAAGACACTCTGACCGTGGTCACTGCGGACCATTCCCACGTCTTCACATTTGGTGGATACACCCCCCGTGGCAACTCTATCTTTGGTCTGGCCCCCATGCTGAGTGACACAGACAAGAAGCCCTTCACTGCCATCCTGTATGGCAATGGGCCTGGCTACAAGGTGGTGGGCGGTGAACGAGAGAATGTCTCCATGGTGGACTATGCTCACAACAACTACCAGGCGCAGTCTGCTGTGCCCCTGCGCCACGAGACCCACGGCGGGGAGGACGTGGCCGTCTTCTCCAAGGGCCCCATGGCGCACCTGCTGCACGGCGTCCACGAGCAGAACTACGTCCCCCACGTGATGGCGTATGCAGCCTGCATCGGGGCCAACCTCGGCCACTGTGCTCCTGCCAGCTCGTGACTCGAG。(SEQ ID NO.1)

(2)重组质粒的构建与验证

将rhALP基因片段及质粒pcDNA3.1分别用Hind III和Xho I酶切，纯化酶切后的rhALP基因及质粒pcDNA3.1并用T4DNA Ligase连接，连接液转化大肠杆菌DH5α。挑取转化子并提取质粒进行验证。重组质粒pcDNA3.1-rhALP经酶切及测序验证。重组质粒pcDNA3.1-rhALP经Hind III和Xho I酶切后产生两个线性片段(图1)。将含有验证正确的重组质粒pcDNA3.1-rhALP的大肠杆菌扩大培养，用无内毒素质粒提取试剂盒(天根)提取质粒。所提质粒用于后续的细胞转染实验。

2.融合蛋白的表达

(1)真核细胞转染实验

将人骨肉瘤MG-63细胞以4×10⁴个/孔的密度铺于24孔板内，分为阴性对照组；pcDNA3.1组；pcDNA3.1-rhALP组。置于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养。至细胞生长面积为孔板底面积的85％-90％时，阴性对照组(MG-63细胞不加入质粒其它步骤相同)，pcDNA3.1组将1000ng>

(2)表达产物的收获

转染后48h，换为含有400μg/mL遗传霉素(G418)的培养基(液体培养基)筛选，直到阴性对照组细胞全部死亡。将1mL人骨肉瘤MG-63细胞培养上清转移至2.0mL离心管内，3000×g离心5min，弃去细胞碎片，将离心上清分装于2mL离心管中，于-20℃保存。

用PBS缓冲液洗涤细胞层(此处的“细胞层”是指将MG-63细胞培养上清分离后剩余的细胞)，胰酶(碧云天)消化并收获细胞沉淀。向细胞沉淀中加入20L RIPA(碧云天)裂解细胞，4℃10000×g离心30min，将离心上清转移至2mL离心管中，于-20℃保存。

由于rhALP没有信号肽，在MG-63细胞中表达的rhALP都位于MG-63细胞内，不会分泌到MG-63细胞外。裂解细胞后，经过低温高速离心，收集离心后的上清，rhALP即在离心后的上清中。

3.表达产物中蛋白的检测

(1)SDS-PAGE电泳

向20L收获的细胞裂解产物或细胞上清中加入4μL 6×loading buffer(0.35M Tris-HCl pH6.8，30％甘油，10％SDS，0.012％溴酚蓝，6％-巯基乙醇)，充分混匀，100℃煮沸5min后，4℃8000×g，离心10min，根据BCA试剂盒(碧云天)测得的蛋白浓度，取使蛋白上样量每孔为20g的上清加载至12％SDS-PAGE凝胶中，60V电泳5min，100V 10min，150V跑完。细胞裂解产物以GAPDH为内参照调整样品上样量。

(2)Western blotting

电泳结束后，将蛋白质转印至PVDF膜上，用5％脱脂奶粉于37℃封闭2h。封闭后的PVDF膜与兔抗ALP多克隆抗体(1:1000，购自Ray Biotech)于4℃过夜孵育，再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG于37℃孵育1h。加入过氧化物酶底物，显示蛋白条带。

Western blotting的实验结果如图2所示，图2是细胞裂解液中rhALP蛋白的western blot鉴定，以GAPDH为内参照。其中control为阴性对照组(转染空质粒pcDNA3.1的MG-63细胞)，rhALP为pcDNA3.1-rhALP稳定转染MG-63的细胞。图2的结果表明人骨肉瘤MG-63细胞能高效表达rhALP蛋白。

进一步采用ELISA实验定量测定rhALP外源表达的产量，结果为27.3μg/ml(培养液)。

(3)rhALP的糖基化检测

对收获的细胞裂解产物用糖苷内切酶Endo H(NEB)处理，步骤按试剂说明书操作。再按照Western blotting步骤进行检测。

糖基化检测的结果如图3所示，结果表明MG-63细胞能表达糖基化的rhALP。糖苷内切酶(Endo H)处理rhALP的western blot鉴定图，control为没有经过Endo H处理的rhALP，Endo H为经Endo H酶切后的rhALP。图3结果表明MG-63对表达的rhALP进行了糖基化修饰。

(4)rhALP的活性检测

纯化MG-63细胞表达的rhALP，其氨基酸序列如下：

LVPEKEKDPKYWRDQAQETLKYALELQKLNTNVAKNVIMFLGDGMGVSTVTAARILKGQLHHNPGEETRLEMDKFPFVALSKTYNTNAQVPDSAGTATAYLCGVKANEGTVGVSAATERSRCNTTQGNEVTSILRWAKDAGKSVGIVTTTRVNHATPSAAYAHSADRDWYSDNEMPPEALSQGCKDIAYQLMHNIRDIDVIMGGGRKYMYPKNKTDVEYESDEKARGTRLDGLDLVDTWKSFKPRYKHSHFIWNRTELLTLDPHNVDYLLGLFEPGDMQYELNRNNVTDPSLSEMVVVAIQILRKNPKGFFLLVEGGRIDHGHHEGKAKQALHEAVEMDRAIGQAGSLTSSEDTLTVVTADHSHVFTFGGYTPRGNSIFGLAPMLSDTDKKPFTAILYGNGPGYKVVGGERENVSMVDYAHNNYQAQSAVPLRHETHGGEDVAVFSKGPMAHLLHGVHEQNYVPHVMAYAACIGANLGHCAPASS。(SEQ ID NO.2)

rhALP活性的测定按碱性磷酸酶试剂盒步骤操作(南京建成)。结果表明纯化的rhALP活性达到3625U/mg，比CHO细胞表达的ALP提高32％(Tatsuo Nishioka，2006)。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省医药生物技术研究中心

<120> 人碱性磷酸酶糖蛋白的癌细胞高效表达系统及其应用

<130> 2017

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1473

<212> DNA

<213> rhALP基因

<400> 1

aagcttatgt tagtgccaga gaaagagaaa gaccccaagt actggcgaga ccaagcgcaa 60

gagacactga aatatgccct ggagcttcag aagctcaaca ccaacgtggc taagaatgtc 120

atcatgttcc tgggagatgg gatgggtgtc tccacagtga cggctgcccg catcctcaag 180

ggtcagctcc accacaaccc tggggaggag accaggctgg agatggacaa gttccccttc 240

gtggccctct ccaagacgta caacaccaat gcccaggtcc ctgacagtgc cggcaccgcc 300

accgcctacc tgtgtggggt gaaggccaat gagggcaccg tgggggtaag cgcagccact 360

gagcgttccc ggtgcaacac cacccagggg aacgaggtca cctccatcct gcgctgggcc 420

aaggacgctg ggaaatctgt gggcattgtg accaccacga gagtgaacca tgccaccccc 480

agcgccgcct acgcccactc ggctgaccgg gactggtact cagacaacga gatgccccct 540

gaggccttga gccagggctg taaggacatc gcctaccagc tcatgcataa catcagggac 600

attgacgtga tcatgggggg tggccggaaa tacatgtacc ccaagaataa aactgatgtg 660

gagtatgaga gtgacgagaa agccaggggc acgaggctgg acggcctgga cctcgttgac 720

acctggaaga gcttcaaacc gagatacaag cactcccact tcatctggaa ccgcacggaa 780

ctcctgaccc ttgaccccca caatgtggac tacctattgg gtctcttcga gccaggggac 840

atgcagtacg agctgaacag gaacaacgtg acggacccgt cactctccga gatggtggtg 900

gtggccatcc agatcctgcg gaagaacccc aaaggcttct tcttgctggt ggaaggaggc 960

agaattgacc acgggcacca tgaaggaaaa gccaagcagg ccctgcatga ggcggtggag 1020

atggaccggg ccatcgggca ggcaggcagc ttgacctcct cggaagacac tctgaccgtg 1080

gtcactgcgg accattccca cgtcttcaca tttggtggat acaccccccg tggcaactct 1140

atctttggtc tggcccccat gctgagtgac acagacaaga agcccttcac tgccatcctg 1200

tatggcaatg ggcctggcta caaggtggtg ggcggtgaac gagagaatgt ctccatggtg 1260

gactatgctc acaacaacta ccaggcgcag tctgctgtgc ccctgcgcca cgagacccac 1320

ggcggggagg acgtggccgt cttctccaag ggccccatgg cgcacctgct gcacggcgtc 1380

cacgagcaga actacgtccc ccacgtgatg gcgtatgcag cctgcatcgg ggccaacctc 1440

ggccactgtg ctcctgccag ctcgtgactc gag1473

<210> 2

<211> 485

<212> PRT

<213> rhALP

<400> 2

Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln Ala

1 5 1015

Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr Asn

202530

Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser

354045

Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn Pro

505560

Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala Leu

65707580

Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly Thr

859095

Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val Gly

100 105 110

Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Ser Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly Asn

115 120 125

Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser Val

130 135 140

Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala Ala

145 150 155 160

Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met Pro

165 170 175

Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu Met

180 185 190

His Asn Ile Arg Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys Tyr

195 200 205

Met Tyr Pro Lys Asn Lys Thr Asp Val Glu Tyr Glu Ser Asp Glu Lys

210 215 220

Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Val Asp Thr Trp Lys

225 230 235 240

Ser Phe Lys Pro Arg Tyr Lys His Ser His Phe Ile Trp Asn Arg Thr

245 250 255

Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro His Asn Val Asp Tyr Leu Leu Gly Leu

260 265 270

Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val Thr

275 280 285

Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Val Val Ala Ile Gln Ile Leu Arg

290 295 300

Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp

305 310 315 320

His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala Val

325 330 335

Glu Met Asp Arg Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ser Leu Thr Ser Ser Glu

340 345 350

Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr Phe

355 360 365

Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Met

370 375 380

Leu Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly Asn

385 390 395 400

Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser Met

405 410 415

Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro Leu

420 425 430

Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ser Lys Gly

435 440 445

Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Val Pro

450 455 460

His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Gly His Cys

465 470 475 480

Ala Pro Ala Ser Ser

485