一种提高米曲霉发酵淀粉合成L‑苹果酸的方法

摘要

本发明公开了一种提高米曲霉发酵淀粉合成L‑苹果酸的方法，属于基因工程领域。本发明在基因工程菌A.oryzae PN5的基础上，同时过表达葡萄糖苷酶编码基因agdA和淀粉酶编码基因amyB，所得重组菌A.oryzae GAA经96h摇瓶发酵，可将100g/L的淀粉转化成72g/L L‑苹果酸，6.4g/L琥珀酸和0.18g/L富马酸，苹果酸相对于淀粉的转化率(g/g)为0.72，生产强度为0.75，为进一步代谢改造米曲霉发酵淀粉生产L‑苹果酸奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高米曲霉发酵淀粉合成L-苹果酸的方法，属于基因工程领域。

背景技术

苹果酸作为一种重要的四碳二羧酸主要用作食品、饮料中的酸味剂，金属物的清洗剂，以及农业、化妆品和医药等领域。2004年，美国能源部将苹果酸和富马酸、琥珀酸这三种四碳二羧酸均作为可通过微生物利用可再生原料发酵大规模生产的12种平台化合物之一。

目前发酵法生产苹果酸主要是通过细菌或丝状真菌发酵葡萄糖，或高密度培养Ustilago trichophora发酵甘油等。细菌在糖代谢过程中，会产生乙酸、乳酸等副产物；丝状真菌的糖代谢则伴随着较高的柠檬酸、琥珀酸和富马酸等的产生。甘油发酵产酸需要较高浓度的菌体和较长的发酵周期，不利于工业化生产，而以葡萄糖作为发酵原料，与工业淀粉相比，成本高出1.2～1.5倍。

淀粉质原料来源广，价格低廉，是工业生产中理想的碳源。众所周知，米曲霉作为“generally regarded as safe”(GRAS)菌株，早在1000多年前已被应用于食品、饲料、产酸、酿酒等发酵工业，具有极强的淀粉酶分泌能力。基于现有技术关于发酵淀粉生产苹果酸的研究，米曲霉发酵淀粉生产苹果酸已变得可能，但仍存在很大的提升空间。由于可溶性淀粉溶于热水后成糊状，极低的流动性会影响传质和菌体生长，因此，提高菌体对淀粉的利用能力对于提高苹果酸的发酵水平有重要作用。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种基因工程菌，是以米曲霉为宿主，共表达编码淀粉酶的基因amyB和编码葡萄糖苷酶的基因agdA

在本发明的一种实施方式中，所述基因amyB是NCBI Gene ID为5996200的基因，所述基因agdA是NCBI Gene ID为5992274的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pBg32为载体，所述pBg32已于申请号为201610603538.0的发明专利中公开，该质粒以pMD19为出发质粒，通过连接米曲霉磷酸甘油酸激酶启动子(Ppgk)、构巢曲霉的苯菌灵抗性基因(e)和葡萄糖淀粉酶终止子(Tgla)构建而成。

在本发明的一种实施方式中，以淀粉诱导型强启动子PamyB表达基因amyB，以PagdA表达基因agdA；所述PamyB序列如SEQ ID NO.1所示；所述PagdA序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以过表达了葡萄糖淀粉酶基因glaA的工程菌A.oryzae PN5为宿主；所述A.oryzae PN5是以质粒pMD19为载体，以SEQ ID NO.7所示的淀粉诱导型的强启动子介导的，过表达NCBI Gene ID为5999830的glaA基因的重组米曲霉。

本发明的第二个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，所述方法是将Gene ID为5996200的基因amyB、Gene ID为5992274的基因agdA与载体连接，转化至宿主细胞中。

本发明的第三个目的是提供一种以淀粉为底物生产L-苹果酸的方法，所述方法是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，28～30℃，200～250rpm发酵48～96h。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基每L含有：可溶性淀粉100g，胰蛋白胨12g，K₂HPO₄>2PO₄>20>2.H₂0>3>4.7H₂0。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵为两步发酵，第一步是将32～34℃恒温培养3-7天的孢子接至种子培养基中，使得孢子终浓度为1.5×10⁶个/mL，30～34℃，200rpm培养12～16h；第二步是以5～10％的接种量将培养好的种子液接至发酵培养基中，30～34℃，200rpm培养48～96h。

本发明的第四个目的是提供所述基因工程菌在发酵领域生产有机酸产品中的应用。

有益效果：本发明提供的重组米曲霉提高发酵淀粉产酸的转化率和生产强度，且发酵产品中的副产物(杂酸)含量少。本发明构建的基因工程菌A.oryzae GAA经过96h摇瓶发酵L-苹果酸的产量达到72g/L，杂酸琥珀酸浓度低于6.4g/L，富马酸含量低于0.18g/L，为进一步代谢工程改造米曲霉生产苹果酸奠定了良好的基础。本发明提供的代谢改造丝状真菌生产有机酸的方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。

具体实施方式

种子培养基(g/L)：葡萄糖30，胰蛋白胨3，KH₂PO₄>2HPO₄>2PO₄0.56，K₂HPO₄>20>2.H₂0>4.7H₂0、1g柠檬酸)。

发酵培养基(g/L)：可溶性淀粉100，胰蛋白胨12，K₂HPO₄>2PO₄>20>2.H₂0>4.7H₂0，CaCO₃>

培养条件：米曲霉平板产孢条件为适量孢子液涂布于PDA平板，34℃恒温培养3-7天。米曲霉摇瓶种子培养基孢子终浓度为1.5×10⁶个/mL，30℃、200rpm培养14h，以10％的接种量转接发酵培养基，30℃、200rpm发酵96h。

苹果酸的测定方法：Agilent 1200，UV检测器，C18柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：10％甲醇和0.75mmol稀磷酸。流速0.7mL/min，柱温20℃，波长210nm，进样体积为10μL。

样品制备：向已知体积的发酵液中加入等体积的2M HCl以溶解生成的苹果酸钙沉淀和残留的CaCO₃。离心后再稀释5倍，经0.22μm滤膜过滤后，滤液用于液相检测。

实施例1 过表达载体的构建

根据NCBI上公布的米曲霉淀粉酶编码基因amyB和葡萄糖苷酶编码基因agdA的上下游序列，设计引物：

以米曲霉基因组为模板，通过PCR扩增目的基因。米曲霉的基因组的提取方法为天根植物基因组提取试剂盒法。用于构建表达载体的原始质粒为带有氨苄和苯菌灵抗性的pBg32(申请号：201610603538.0)。使用快切酶Hind III和Asc I双酶切得到amyB基因表达的目的片段，使用快切酶通过Sal I和Asc I双酶切agdA基因表达的目的片段，1％琼脂糖凝胶电泳回收纯化目的DNA。

实施例2 米曲霉原生质体转化和转化子的筛选

米曲霉重组方法为原生质体转化法，原生质体制备方法参见2013公开的论文《Metabolic engineering of Aspergillus oryzae NRRL3488 for increased production of L-malic acid》；原生质体转化方法参见2013年公开的论文《Six novel constitutive promoters for metabolic engineering of Aspergillus niger.》。

米曲霉原生质体制备和转化方法如上发明内容中所述，用于转化的宿主菌为A.oryzae PN5，转化产物涂布含苯菌灵的抗性平板。提取原生质体再生菌株基因组PCR验证，所得阳性转化子在抗性平板传代数次。

实施例3 米曲霉发酵生产L-苹果酸

将34℃培养3-7天的米曲霉的孢子用0.05％的吐温80洗脱，使用云母布过滤除去菌丝体。米曲霉摇瓶种子培养基孢子终浓度为1.5×10⁶个/mL，30℃、200rpm培养14h，以10％的接种量转接发酵培养基，30℃、200rpm发酵96h。

以未过表达amyB和agdA的A.oryzae PN5(以质粒pMD19为载体，以SEQ ID NO.7所示的淀粉诱导型的强启动子介导的，过表达NCBI Gene ID为5999830的glaA基因的重组米曲霉)，和按上述策略构建的分别只表达了amyB或agdA的基因工程菌(分别命名为A.oryzae GA1和A.oryzae GA2)做对照，在相同条件下培养、发酵，测定发酵液中苹果酸的含量，结果显示，经96h摇瓶发酵，A.oryzae PN5产量为63g/L，A.oryzae GA1和A.oryzae GA2的苹果酸产量分别为66g/L和65g/L。当同时过表达amyB和agdA，重组菌A.oryzae GAA苹果酸产量提高至72g/L以上，相比于对照A.oryzae PN5提高了14.3％。本发明中苹果酸相对于淀粉的转化率为0.72g/g，生产强度为0.75。同时，本发明中提供的基因工程菌还伴随着少量的副产物的生成，琥珀酸含量低于6.4g/L，富马酸含量低于0.18g/L。本发明的研究成果进一步证实了米曲霉发酵淀粉合成苹果酸的潜力，为进一步的代谢调控提供了优良的出发菌株，也为苹果酸的工业化生产提供了低廉的发酵原料。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高米曲霉发酵淀粉合成L-苹果酸的方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 617

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaattcatgg tgttttgatc attttaaatt tttatatggc gggtggtggg caactcgctt 60

gcgcgggcaa ctcgcttacc gattacgtta gggctgatat ttacgtaaaa atcgtcaagg 120

gatgcaagac caaagtagta aaaccccgga gtcaacagca tccaagccca agtccttcac 180

ggagaaaccc cagcgtccac atcacgagcg aaggaccacc tctaggcatc ggacgcacca 240

tccaattaga agcagcaaag cgaaacagcc caagaaaaag gtcggcccgt cggccttttc 300

tgcaacgctg atcacgggca gcgatccaac caacaccctc cagagtgact aggggcggaa 360

atttaaaggg attaatttcc actcaaccac aaatcacagt cgtccccggt attgtcctgc 420

agaatgcaat ttaaactctt ctgcgaatcg cttggattcc ccgcccctgg ccgtagagct 480

taaagtatgt cccttgtcga tgcgatgtat cacaacatat aaatactagc aagggatgcc 540

atgcttggag gatagcaacc gacaacatca catcaagctc tcccttctct gaacaataaa 600

ccccacagaa ggcattt 617

<210> 2

<211> 716

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggaattaatc tacctggagt ctactccatc tttgtcttgg tttagtctgt gccctaaagg 60

tcccctagcg tcactcctaa caaatgggag gacccatcgg taacaactcg ttccaaactc 120

acatcgggat tcgttgtaga gtcgtgttta tagttaactc cattataccc catcgaggct 180

aacggccgct taagaatggt ggaatcaggt tgtgagggag cgtggaagat gcagggaatc 240

tatagccacc ctgggttata ctgtacggag tgcataaatc agccttagca accccgaggg 300

gaccggccgt gccacacagc atattagagc agactctagt cagggatcaa ttcaagaagt 360

agaacagtct cacgtaatgg ttattccagg tttgaaaggc agctcatcgt gaacctagcc 420

tgctacttct gaaagaaaca gcgtaccaca ggcttgcatc cagcatgtgg ggatgtaagg 480

gaggcaccac tctcgggaag ccgaggtcaa aacagagaat gaatggcatt gaagaggatc 540

gtaacacctc cgaacctccc atgagccgaa ggtctatgac gatattccac tcttagcctg 600

ggctgagccg ctggtcccca cggggacttc attcctggac caaaggcaaa ttccccttat 660

ttggagcttg ttgtccatcc caaccaccca atactggaag ccatcggatg ctcccg 716

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cccaagcttg aattcatggt gttttgatca ttttaaatt 39

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaggaaaaaa gcggccgcaa tgaaaatctg agattaaatg gaaataca 48

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acgcgtcgac tcatggcacc actagagatg gcgtg 35

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaggaaaaaa gcggccgcga tattggctat ttctcgtacg tgtacagg 48

<210> 7

<211> 766

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cacaattact atatcatggt ctacccatga tctaggcctt cgcccagctc actatagatg 60

ttcttcagac aggggacggc gaattcacgg gcgaaatcac aattactata tcatggtcta 120

cccatgatct aggccttcgc ccagctcact atagatgttc ttcagacagg ggacggcgaa 180

ttcacgggcg aaatcacaat tactatatca tggtctaccc atgatctagg ccttcgccca 240

gctcactata gatgttcttc agacagggga cggcgaattc acgggcgaaa tcacaattac 300

tatatcatgg tctacccatg atctaggcct tcgcccagct cactatagat gttcttcaga 360

caggggacgg cgaattcacg ggcgaaatca caattactat atcatggtct acccatgatc 420

taggccttcg cccagctcac tatagatgtt cttcagacag gggacggcga attcacgggc 480

gaaatcaatt tgtggctgca tcctcatgtc ttgaaacaag cagtgtgatt ggaagtggtg 540

gcgtcttggc tccagccagc tgcatgacta tgagaaaata gtcaactagt cttggcttgc 600

agaatgactt ccggaaattt aacctggtgg ctgctctcag tattggctga cgctccgcac 660

ctctaattgt gcttcaggtc agtcaaagat gttttgaacc accaacgagc cgaacccttc 720

cgccgctaca atactcgggt tattataaaa cgcatcgtgg ttcatc 766