一种从三叶青块根中分离的小不整球菌EF01及其应用

摘要

本发明公开了一种从三叶青块根中分离的小不整球菌EF01及其促进三叶青生长、提高总黄酮含量中的应用，本发明从三叶青球形块根中分离到1株内生真菌，即小不整球壳菌EF01，具有促进三叶青的生长、提高总黄酮含量的功效，植株鲜重提高近1倍以上，根长也为对照组的1倍以上，叶青叶、茎和根中Th‑exp表达量均上调，总黄酮含量提高了87‑121％。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种提高三叶青生长发育的菌株，特别涉及一种小不整球壳菌(Plectosphaerella sp.)EF01在促进三叶青生长、提高总黄酮含量中的应用。

(二)背景技术

三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels&Gilg ex Diels)是珍稀的药用植物，主要以球形块根入药，含黄酮、类黄酮、维生素、氨基酸等多种药用成分，能清热解毒、消炎止痛。近年来发现有抗肿瘤功效。在自然生长条件下，对环境条件(如：温度、湿度和光照等条件等)要求苛刻，生长缓慢，通常需3-5年方能形成球形块根(钱丽华,戴丹丽,姜慧燕,林蔚红.濒危药用植物三叶青研究进展.浙江农业学报,2015,27(7):1301-1308)。

另一方面，内生真菌是生活在健康植物组织内部，不引起宿主植物出现明显病症的一类真菌。在长期的进化过程中，内生真菌与宿主互惠共生，既从宿主中吸收营养供自身生长，产生的代谢物又促进宿主植物的生长发育，增强宿主植物对病虫害、干旱、高温等生物及非生物胁迫的抗性(Jia M,Chen L,Xin HL,Zheng CJ,Rahman K,Han T,Qin LP.A Friendly relationship between endophytic fungi and medicinal plants:A systematic review.Front Microbiol,2016,7:906)。

寻找、分离、鉴定并分析三叶青的内生真菌，探究内生真菌与三叶青块根生长发育的相关性，可将内生真菌应用于三叶青的人工栽培，以便缩短三叶青的生长周期，对增加三叶青中药材资源具有重要意义。本发明从三叶青块根中分离纯化获得1株内生真菌(命名为EF01)。进一步对该内生真菌进行鉴定和分析，结果显示，EF01菌株具有促进三叶青的生长、提高总黄酮含量的功效。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种小不整球壳菌EF01及其在促进三叶青生长、提高总黄酮含量中的应用；可以克服三叶青生长过程中形成球形块根时间长、块根发育缓慢等问题。本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种从三叶青块根中分离的小不整球壳菌(Plectosphaerella sp.)EF01，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期2016年10月13日，保藏编号CGMCC NO.12968，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。

本发明还提供一种所述小不整球壳菌EF01在促进三叶青生长、提高总黄酮含量中的应用，具体所述的应用为：所述的应用为：将小不整球壳菌EF01接种在PDA固体培养基上，室温培养1-5d；取菌饼接于PDA液体培养基中，25-30℃、50-200r/min培养1-10天，将培养液进行过滤，所得滤液与MS液体培养基按体积比1:5-20混合，加入终浓度1-20g/L琼脂后灭菌，获得组培苗培养基；接种三叶青无菌组培苗于所述的组培苗培养基中，在18-25℃、1000-3000lux、5-15h/d条件下培养，获得所述的生长加速、总黄酮含量提高的三叶青植株。更优选所述的应用为：将小不整球壳菌EF01接种在PDA固体培养基上，室温℃培养3d；取菌饼接于PDA液体培养基中，28℃、100r/min培养5天，培养液经滤纸过滤，所得滤液与MS液体培养基按体积比1:9混合，加入终浓度10g/L琼脂后灭菌，获得组培苗培养基；接种三叶青无菌组培苗于所述的组培苗培养基，在18-25℃、2000lux、12h/d条件下培养，获得所述的生长加速、总黄酮含量提高的三叶青植株。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明从三叶青球形块根中分离到1株内生真菌，即小不整球壳菌EF01，具有促进三叶青的生长、提高总黄酮含量的功效，植株鲜重提高近1倍以上，根长也为对照组的1倍以上，叶青叶、茎和根中Th-exp表达量均上调，总黄酮含量提高了87-121％。

(四)附图说明

图1块根切块在PDA培养基上培养3天照片，左边切块未有内生真菌，右边切块长出内生真菌。

图2菌株EF01菌落形态。

图3菌株EF01的ITS rDNA电泳图，第1泳道为DS2000标准分子量，第2泳道为扩增的ITS产物。

图4菌株EF01对三叶青组培苗生长的影响，左侧为实验组，右侧为对照组。

图5菌株EF01对三叶青扩展蛋白基因表达的影响。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

1、材料和方法

(1)块根中内生真菌的分离纯化

采于浙江省缙云县山区的野生三叶青，取直径约2cm的球形块根，自来水冲掉表面泥土，置于洗洁精中浸泡10min，流水冲洗干净后，在操净台中将块根浸泡在稀释1倍的饱和次氯酸钠(安替福民)溶液中30min，最后用无菌水冲洗3次。切割成长宽3-5mm的小块，置于含50mg/L Str(链霉素)的PDA培养基(马铃薯200g/L(去皮切块，水中煮沸后纱布过滤除渣)、葡萄糖20g/L和琼脂14g/L，溶剂为去离子水，pH7.0)，切面朝向培养基，每皿4-6块。同时，收集最后一次冲洗块根的无菌水涂布于培养基上，并且将上述同样处理过的块根未经切割直接滚印于培养基上，作为对照，用于检测块根表面灭菌效果。28℃、黑暗培养5天。待菌丝体从切块面长出，挑取边缘菌丝转至含50mg/L Str的PDA培养基上继续培养。重复3-5次获得纯化的菌株EF01。

(2)内生真菌的形态和分子鉴定

参照《真菌的形态和分类》(戴芳澜，真菌的形态和分类。北京：科学出版社，1987年，第1-352页)，依据菌落的表面形态、边缘形态、颜色、生长速度等对分离到的菌株EF01进行形态鉴定。

用真菌基因组DNA抽提试剂盒(生工公司)提取菌株EF01基因组DNA。根据真菌rDNA的ITS序列，设计引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)(Valente P,Gouveia FC,de Lemos GA,Pimentel D,van Elsas JD,-Hagler LC,Hagler AN.PCR amplification of the rDNA internal transcribed spacer region for differentiation of Saccharomyces cultures.FEMS Microbiol Lett,1996,137(2-3):253-256).PCR扩增条件为：95℃变型2min，随后30个循环：95℃45s，55℃45s和72℃45s，最后在72℃延伸10min。PCR产物回收、纯化后，连接到测序载体pMD19-T(TaKaRa公司)，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。筛选的阳性克隆由生工公司测序。利用NCBI在线Blast软件(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对所得序列进行比对分析，确定分离到内生真菌菌株EF01的种属。

(3)真菌发酵液的制备和接种

取菌株EF01在PDA固体培养基上，室温(25℃)培养3d。用打孔器在菌落边缘取直径约5mm的菌饼3块，接于100mL PDA液体培养基(固体培养基去除琼脂)中，28℃，100r/min培养5天。培养液经滤纸过滤，所得滤液与MS液体培养基按体积比1:9混合，加入终浓度10g/L琼脂后灭菌，作为实验组培养基，用于培养三叶青无菌组培苗；以等量的无菌水与MS液体培养基体积比1:9的混合作为对照组培养基。

(4)三叶青生长情况的分析

取形态及生长状况一致的组培苗(组培苗的获取方法来源同文献：Du S,Xiang T,Song Y,Huang L,Sun Y,Han Y.Transgenic hairy roots of Tetrastigma hemsleyanum:induction,propagation,genetic characteristics and medicinal components.Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2015,122(2):373-382)，在超净工作台上用电子天平称取0.3g鲜重的无菌苗枝条，分别插入步骤(3)实验组和对照组培养基上。每组处理重复3次，25℃/18℃(昼/夜)，2000lux，12h/d。30天后，取出无菌苗洗去根部琼脂，测量鲜重。

(5)三叶青扩展蛋白基因表达的分析

在步骤(4)实验组和对照组上培养30天的三叶青组培苗，利用生工RNA抽提试剂盒分别提取叶、茎和细根的RNA，用cDNA合成试剂盒(TransGen公司)获取cDNA第一链。以actin基因作为内参，设计actin引物actin-F(5’-GCCCTTGACTATGAGCAGGA-3’)和actin-R(5’-GAAAAGGACTTCAGGGCAGC-3’)。根据GenBank登录号：KP693606，设计三叶青扩展蛋白基因(Th-exp)引物Thexp-F:(5’-CCCTGGTAGATGGCGAACTT-3’)和Thexp-R(5’-AACCGCCACTAATTTCTGCC-3’)。利用Bestar SybrGreen qPCR Mastermix Kit(DBI Bioscience公司)配制qRT-PCR反应体系。使用Step One PlusTM Real-Time PCR System(Applied Biosystems公司)进行扩增，PCR反应程序为95℃预变性2min，按照95℃变性10s，55℃退火31s，72℃延伸30s，进行40个循环。根据Schmittgen and Livak(2008)报道的方法计算Th-exp基因的相对表达量(Schmittgen TD,Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T)method.Nat Protoc,2008,3(6):1101-1108)。

(6)三叶青总黄酮含量的测定

剪取步骤(4)实验组和对照组三叶青的叶，70℃烘干，用粉碎机研成粉末。称取0.1g放入5mL的离心管，加入1.5mL体积浓度50％乙醇水溶液。使用超声提取仪提取0.5h，11000r/min离心后，取上清加入体积浓度50％乙醇水溶液至2.5mL，即为总黄酮溶液。吸取得到的总黄酮溶液1.0mL置于25mL容量瓶中，加入体积浓度50％乙醇水溶液至9mL，加入质量浓度5％NaNO₂水溶液1mL摇匀，放置6min，再加入质量浓度10％的Al(NO₃)₃水溶液1mL，摇匀后放置6min，最后加入质量浓度10％的NaOH水溶液10mL，用体积浓度50％乙醇水溶液定容至25mL，摇匀，静置15min，对样品进行显色。用紫外分光光度计测定500nm处的吸光值，并根据制定的标准曲线(标准曲线的准备同文献：Du>

2、结果

(1)块根内生真菌的分离

块根切块在PDA培养基上培养3天左右，菌丝体开始从切口处长出(图1，图中左边切块未有内生真菌，右边切块长出内生真菌)，而对照无菌体生长，表明外植体表面消毒彻底，长出的菌丝体为三叶青块根的内生真菌。挑取菌丝体尖端在PDA平板上纯化3-5次后可获得单一的菌落。在10次独立的实验中，根据菌落形态学特征的鉴定，共分离获得45株真菌。其中编号EF01菌株菌落形态见图2。

(2)菌株EF01的分类鉴定

使用引物ITS1和ITS4，对EF01株内生真菌ITS rDNA序列进行PCR扩增，均扩增出条带，大小约550bp(图3，图中第1泳道是DNA标准分子量，第2泳道是扩增的产物)。经过连接到克隆载体pMD19-T，挑选转化的阳性克隆测序，获得ITS序列，长度为558bp(SEQ ID NO.1所示)。ITS序列通过Blast比对结果表明，EF01菌株属于小不整球壳属(Plectosphaerella sp.)，即为小不整球壳菌(Plectosphaerella sp.)EF01。

EF01株内生真菌ITS rDNA序列(SEQ ID NO.1)：

TCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTTGGTGCCGCCGGAGCGGGCTTGTTGGGGGGTTTAGAGGCAGGAGAGCCCGCCGGCTCCCGATGCGAGGCTAATGCTACTACGCAAAGGAAGGGCCTAACGGGTCCGCCACTGTATTTCGGGGCCTGCCGTGGCAGATCCCCAACGCCGGGCCACGAGGGCTCGAGGGTTGAAACGACGCTCGGACAGGCATGCCTCCCAGGATACTGGAAGGCGCCATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACATATCGCGTTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCTGGAGCCAAGAGATCCGTTGTTAAAAGTTTTGACAGTTCGCTAAGAACACTCAGAAGTATCGTCGGGTTCGAAAACAGAGATTCTGATGAGACCGGCGGGCGCCCGCGAGGGACGCCGCCGAAGCAACAGGTATAATGGTTCACAAAGGGTAGTGAGTGTAGTACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCTACGGA。

(3)EF01对三叶青植株生长的影响

EF01菌株对三叶青组培苗生长的影响表现。在实验组培养基上培养的无菌苗，与对照组相比，表现为新生叶片稍增大，植株生长加快，根系生长加快(图4，图中左边：在实验组培养基上生长的植株，右边：在对照组培养基上生长的植株)。0.3g的枝条，在实验组培养基上培养30天后，鲜重增加量为0.426g；而对照组鲜重增加量为0.230g，实验组比对照组提高近1倍以上。而且，实验组植株的根长也为对照组的1倍以上。由此可见，EF01菌株显著促进植株的生长发育，尤其是能促进根的生长。

(4)EF01对三叶青扩展蛋白基因表达的影响

三叶青在实验组培养基上生长30d，荧光定量PCR检测Th-exp基因的相对表达量。与对照相比，实验组的三叶青叶、茎和根中Th-exp表达量均上调(图5)。

(5)EF01对三叶青总黄酮含量的影响

总黄酮含量测定结果显示，虽然三叶青根、茎和叶黄酮含量的不同，但在EF01处理后，三叶青根、茎和叶中总黄酮含量分别可达约为36.50mg/gDW、41.32mg/g·DW和20.51mg/gDW。而对照根、茎和叶中约为19.51mg/gDW、22.09mg/gDW和9.26mg/gDW。EF01发酵液处理，植株根、茎和叶中黄酮含量均显著增加。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州师范大学

<120> 一种从三叶青块根中分离的小不整球菌EF01及其应用

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<212> DNA

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tcggacaggc atgcctccca ggatactgga aggcgccatg tgcgttcaaa gattcgatga 300

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