三叶青扩展蛋白基因的克隆和块根内生真菌的分离鉴定及其分析

摘要

三叶青（Tetrastigma hemsleyanum Diels&Gilg ex Diels）为我国珍稀药用植物，全株均可入药，以球形块根药用价值最高;但自然条件下三叶青生长缓慢，目前已无法满足市场的需求。扩展蛋白是一类普遍存在于植物细胞壁的蛋白质，不仅可以使细胞伸长生长，而且可以通过调节细胞壁柔韧性使其适应周围环境;植物内生真菌在自然界广泛存在，且种类繁多，在长期的进化过程中，内生真菌与宿主植物形成互惠互利的关系，内生真菌既可以影响植物的生长发育，又可以提高植物的抗旱、抗盐、抗病等抗逆性，并且对宿主植物代谢产物的产生具有影响作用。
　　本研究首先克隆了三叶青扩展蛋白基因（Th-exp）全长cDNA序列;其次，分离鉴定了三叶青块根中的内生真菌并进行了细胞学观察;最后，测定了接种内生真菌发酵液的三叶青无菌苗中扩展蛋白基因表达量以及药用活性成分总黄酮的含量。具体研究结果如下:
　　(1)根据GenBank中登录的扩展蛋白基因保守区域序列设计1对简并引物，以三叶青球形块根cDNA为模板进行PCR扩增，再结合RACE技术，获得三叶青扩展蛋白基因全长cDNA序列（命名为Th-exp），共782bp，其中包含630bp开放阅读框，编码209个氨基酸（序列已被GenBank收录，登录号KP693606）。Th-exp编码的蛋白质具有典型的扩展蛋白结构特征，N端含有8个半胱氨酸的结构域，C端含有4个保守的色氨酸结构域，中间含有组氨酸功能域。Blast分析显示，Th-exp与葡萄、醉蝶花中扩展蛋白基因具有相似性。半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析表明，Th-exp基因在三叶青叶、茎、普通细根和球形块根中均有表达，但球形块根中表达强于其它器官。
　　(2)采用组织块分离法，从三叶青多年生块根中共分离到31株内生真菌，菌株颜色、质地、生长速度等具有差异性。通过对内生真菌的ITS rDNA序列进行扩增和分析，将分离到的内生真菌归于10个属，分别是镰刀菌属、根盘菌属、炭疽菌属、柱孢属、翅孢壳属、青霉属、小不整球壳属、曲霉属、链格孢属、帚枝霉属等;另有编号8.16-10-2菌株为未培养真菌(uncultured fungus)，其中镰刀菌属为三叶青块根中的优势菌属。此外，制作三叶青多年生块根石蜡切片，采用番红-固绿法染色并观察，结果显示，三叶青内生真菌多散乱分布于细胞皮层及韧皮部部位，定殖于宿主植物块根的单个或多个连续的细胞中。
　　(3)选取三叶青块根中出现频率较高菌属真菌的发酵液添加到MS培养基中培养三叶青无菌苗，荧光定量PCR检测显示，Th-9.7-1、Th-9.7-2、Th-11.23-1植株叶片中Th-exp基因均上调表达，其中，Th-9.7-2中表达量约是对照组的3倍多，差异性最大;而Th-8.16-8、Th-8.16-13-1中Th-exp基因的表达量降低;植株Th-9.7-5中该基因表达量无明显变化。使用紫外分光光度计测定叶片中药用成分总黄酮的含量，结果显示，9.7-1、9.7-5、8.16-8、11.23-1菌株均可诱导三叶青黄酮含量的升高，其中Th-9.7-5植株含量高达39.6194mg/g·DW，而Th-9.7-2、Th-8.16-13-1中黄酮含量与对照组无明显差异。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1 三叶青研究进展

1．1 三叶青的人工繁殖

1．2 三叶青的化学成分

1．3 三叶青的药理作用

2 扩展蛋白基因研究进展

2．1 扩展蛋白基因家族及蛋白结构

2．2 扩展蛋白与植物的抗逆性

3 内生真菌研究进展

3．1 内生真菌的物种普遍性与多样性

3．2 内生真菌的生物学功能

4 本研究的目的意义

第二章 三叶青扩展蛋白基因的克隆和表达分析

1 实验材料与方法

1．1 实验材料

1．2 扩展蛋白基因中间序列的克隆

1．3 扩展蛋白基因5’端序列的克隆

1．4 扩展蛋白基因3’端序列的克隆

1．5 扩展蛋白基因全长cDNA的获得

1．6 扩展蛋白基因的生物信息学分析

1．7 扩展蛋白基因的表达分析

2 结果与分析

2．1 扩展蛋白中间序列分析

2．2 扩展蛋白5’端序列分析

2．3 扩展蛋白3’端序列分析

2．4 Th-exp基因全序列的获得及生物信息学分析

2．5 Th-exp基因的表达分析

3 讨论

第三章 三叶青块根内生真菌分离鉴定及细胞学观察

1 实验材料和方法

1．1 实验材料

1．2 块根内生真菌的分离纯化

1．3 块根内生真菌的鉴定

1．4 块根内生真菌的进化分析

1．5 块根内生真菌的细胞学观察

2 结果与分析

2．1 块根内生真菌的分离

2．2 块根内生真菌的鉴定及进化分析

2．3 菌根石蜡切片观寨

3 讨论

第四章 三叶青内生真菌对扩展蛋白基因表达及黄酮含量的影响

1 实验材料和方法

1．1 实验材料

1．2 三叶青无菌苗的获得

1．3 三叶青无曹苗接种内生真菌

1．4 不同处理三叶青中Th-exp基因表达的测定

1．5 不同处理三叶青中总黄酮含量的测定

2 结果与分析

2．1 三叶青无菌苗的获得

2．2 三叶青的生长情况

2．3 不同处理三叶青中Th-exp基因表达分析

2．4 不同处理三叶青中总黄酮含量的分析

3 讨论

参考文献

附录

研究生期间的科研成果