一种PELCL/聚己内酯‑g‑聚乙二醇‑REDV电纺纤维膜及制备方法

摘要

本发明一种聚乙二醇‑b‑聚(L‑丙交酯‑co‑ε‑己内酯)/聚ε‑己内酯‑g‑聚乙二醇‑REDV共混超细电纺纤维膜及制备方法。聚乙二醇‑b‑聚(L‑丙交酯‑co‑ε‑己内酯)和聚ε‑己内酯‑g‑聚乙二醇‑REDV一起溶于氯仿和N,N‑二甲基甲酰胺以体积比4:1～8:1的混和溶剂中；溶液在流量为0.02～0.10mL/h、电压为12～20kV、接收距离为15～20cm的条件下进行电纺,得到厚度为50～200μm电纺超细纤维膜。该超细纤维膜表面含有REDV小肽，对促进血管内皮细胞粘附和生长作用好；用于包载核酸、蛋白、药物等生物活性物质，且具有控制释放的生物活性物质的能力。用于生物医用材料领域。

说明书

技术领域

本发明涉及了一种聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(PELCL)/聚己内酯-g-聚乙二醇-REDV电纺超细纤维膜及制备方法，属于生物医用材料领域。

背景技术

采用静电纺丝技术在组织工程支架中负载基因蛋白等生物活性物质，可以调控细胞的粘附、增殖和迁移，有利于组织的修复和再生。生物降解性聚丙交酯共聚物聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(PELCL)、聚ε-己内酯(聚己内酯，PCL)等生物相容性好，力学性能优良。采用静电纺丝技术,制备出超细纤维膜,模拟细胞外基质结构,可作为组织重建的支架材料。精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸(Arg-Glu-Asp-Val,REDV)存在于纤维连接蛋白的III-CS区域，含有该序列的合成肽能够特异性地粘附血管内皮细胞，而较少粘附平滑肌细胞和成纤维细胞，在血管组织工程支架的功能化中具有重要的应用价值。

为促进血管组织工程支架材料表面形成内皮细胞层，一般采用纤维膜表面物理或者化学修饰的方法，在纤维膜表面偶联REDV和RGD等小肽(Ren X,Feng Y,Guo J,Wang H,Li Q,Yang J,Hao X,Lv J,Ma N,Li W.Surface modification and endothelialization of biomaterials as potential scaffolds for vascular tissue engineering applications.Chemical Society Reviews 2015,44:5680-5742)。例如，通过表面浸涂的方式在PCL电纺纤维膜表面修饰RGD小肽，提高了细胞在纤维膜表面的粘附和铺展(Wang Z,Wang H,Zheng W,Zhang J,Zhao Q,Wang S,Yang Z,Kong D.Highly stable surface modifications of poly(ε-caprolactone)(PCL)films by molecular self-assembly to promote cells adhesion and proliferation.Chemical Communications 2011,47:8901-8903)。我们前期研究发现，在PELCL电纺纤维膜表面通过EDS/NHS活化的方法偶联具有特异粘附作用的REDV小肽,可以促进血管内皮细胞的特异性粘附和生长(Zhou F,Jia X,Yang Y,Yang Q,Gao C,Zhao Y,Fan Y,Yuan X Peptide-modified PELCL electrospun membranes for regulation of vascular endothelial cells.Materials Science and Engineering C 2016,68:623-631)。然而通过表面化学修饰的方法，在包载生物活性物质的电纺纤维膜表面偶联小肽，比如酸、碱或氨解处理，可能会降低生物活性物质的活性，从而增加原料成本。因此，在电纺纤维膜表面改性的同时，保证包载的生物活性物质的活性是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于制备一种聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(PELCL)/聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV电纺超细纤维膜，所述电纺纤维膜可以用于包载核酸、蛋白、药物等生物活性物质，所述电纺超细纤维膜对促进血管内皮细胞粘附和生长作用较好。

本发明的技术方案如下：

一种聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV电纺超细纤维膜(一种PELCL/聚己内酯-g-聚乙二醇-REDV电纺纤维膜)，其PELCL和聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV的质量比为(5～1):1，超细纤维膜由直径为400～1000nm的超细纤维构成，其厚度为50～200μm。

所述的聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)的数均分子量为(7～20)×10⁴。

所述的聚ε-己内酯的数均分子量为(1～5)×10⁴，聚ε-己内酯的分子式为：

式中m＝70～420；R₁为-CH₃或-CH₂O(COCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂O)_mCO(CH₂)₅OH。

所述聚乙二醇的数均分子量为(1～5)×10³；通式为R₁-(CH₂CH₂O)_n-R₂，式中n＝23～113，R₁为与巯基发生反应的活性基团，包括马来酰亚胺基团、吡啶二硫基团或硫醇基团；R₂为与氨基发生反应的活性基团，包括琥珀酰亚胺基团、乙酸基团、乙醛基团、异氰酸基团、异氰硫酸基团、丙烯酸基团或硝基酚基团。

本发明的一种聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV电纺超细纤维膜的制备方法，包括以下过程:

(1)聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)和聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV一起溶于氯仿和N,N-二甲基甲酰胺以体积比为(4～8):1的混和溶剂中,配制成浓度100～200mg/mL的电纺溶液；其PELCL和聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV的质量比为(5～1):1；

(2)将按步骤(1)所得溶液在溶液的流量为0.02～0.10mL/h、电压为12～20kV、接收距离为15～20cm的条件进行电纺,得到厚度为50～200μm的电纺超细纤维膜。

所述聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV的制备方法包括步骤：

(1)聚ε-己内酯的氨基化修饰；

(2)聚ε-己内酯-g-聚乙二醇的制备；

(3)聚ε-己内酯-g-聚乙二醇偶联小肽REDV。

上述的聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV的制备方法,具体说明如下：

步骤(1)是：

聚ε-己内酯的氨基化修饰：将聚ε-己内酯配成0.3～0.5g/mL的无水二氯甲烷溶液，使用N,N’-羰基二咪唑(CDI)活化羟基基团，按照摩尔比[单端羟基聚ε-己内酯]/[CDI]为1:1(或[双端羟基聚ε-己内酯]/[CDI]为1:2)加入CDI，在N₂中室温下搅拌反应24h，然后加入过量乙二胺，室温下搅拌反应48～72h，产物用过量的甲醇沉淀，真空干燥,得到产物聚ε-己内酯的氨基改性物。

步骤(2)是：

聚-己内酯-g-聚乙二醇的制备：将聚-己内酯的氨基改性物配制为溶度为200～300mg/mL的二氯甲烷溶液,按照聚ε-己内酯的氨基改性物中的氨基与双端PEG中R2基团摩尔比为1:1加入双端PEG,室温搅拌均匀6～10h,产物使用乙醇沉淀，得到聚-己内酯-g-聚乙二醇。

步骤(3)是：

聚ε-己内酯-g-聚乙二醇偶联小肽REDV：将聚ε-己内酯-g-聚乙二醇配成溶度为200～300mg/mL的二氯甲烷溶液，按照摩尔比[聚ε-己内酯-g-聚乙二醇]/[REDV]＝1:1加入REDV小肽,室温搅拌均匀2～5h,产物使用乙醇沉淀，得到聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV小肽。

本发明的优点在于上述聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV电纺超细纤维膜,在电纺过程中，随着溶剂的挥发，低分子量的聚ε-己内酯-REDV小肽粘度低，具有向纤维表面迁移的趋势。一方面，迁移到表面的聚ε-己内酯-REDV小肽具有促进血管内皮细胞粘附和生长的功能；另一方面，该电纺纤维膜可用于包载核酸、蛋白、药物等生物活性物质，包载生物活性物质后的纤维仍然具有良好的纤维形貌，释放的生物活性物质具有良好的生物活性。该发明可用于生物医用材料领域。

附图说明

图1：实施例1制备的聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV电纺超细纤维膜包载miRNA复合的纳米粒子的SEM照片。

具体实施方式

下面通过实施案例对本发明的技术方案作进一步的描述，以下实施案例是对本发明的进一步说明，并不限制本发明的适用范围。

聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV电纺超细纤维膜由直径为400～1000nm的超细纤维构成,其厚度为50～200μm.

聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯),其特征在于PELCL的数均分子量为(7～20)×10⁴；

聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV,其特征在于所述聚ε-己内酯的数均分子量为(1～5)×10⁴，所述聚ε-己内酯的分子式为：

式中，m＝70～420；R₁为-CH₃或-CH₂O(COCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂O)_mCO(CH₂)₅OH；

聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV,其特征在于聚乙二醇的数均分子量为(1～5)×10³，通式为R₁-(CH₂CH₂O)_n-R₂，式中n＝23～113，R₁为可以与巯基发生反应的活性基团，包括马来酰亚胺基团、吡啶二硫基团、硫醇基团。R₂为可以与氨基发生反应的活性基团，如琥珀酰亚胺基团、乙酸基团、乙醛基团、异氰酸基团、异氰硫酸基团、丙烯酸基团、硝基酚基团。

聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV的制备方法,其特征在于包括步骤：

(1)聚ε-己内酯的氨基化修饰：将聚ε-己内酯配成0.3～0.5g/mL的无水二氯甲烷溶液，使用N,N’-羰基二咪唑(CDI)活化羟基基团，按照摩尔比[单端羟基聚ε-己内酯]/[CDI]为1:1(或[双端羟基聚ε-己内酯]/[CDI]为1:2)加入CDI，在N₂中室温下搅拌反应24h，然后加入过量乙二胺，室温下搅拌反应48～72h，产物用过量的甲醇沉淀，真空干燥,得到产物聚ε-己内酯的氨基改性物。

(2)聚-己内酯-g-聚乙二醇的制备：将聚-己内酯的氨基改性物配制为溶度为200～300mg/mL的二氯甲烷溶液,按照聚ε-己内酯的氨基改性物中的氨基与双端PEG中R2基团摩尔比为1:1加入双端PEG,室温搅拌均匀6～10h,产物使用乙醇沉淀，得到聚-己内酯-g-聚乙二醇。

(3)聚ε-己内酯-g-聚乙二醇偶联小肽REDV：将聚ε-己内酯-g-聚乙二醇配成溶度为200～300mg/mL的二氯甲烷溶液，按照摩尔比[聚ε-己内酯-g-聚乙二醇]/[REDV]＝1:1加入REDV小肽,室温搅拌均匀2～5h,产物使用乙醇沉淀，得到聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV小肽。

聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV电纺超细纤维膜的制备方法,包括以下过程:

(1)聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV小肽和聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(PELCL)一起溶于氯仿和N,N-二甲基甲酰胺以体积比为(4～8):1的混和溶剂中，配制成浓度100～200mg/mL的电纺溶液，PELCL和聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV小肽共聚物的质量比为(5～1):1；

(2)将按步骤(1)所得溶液进行电纺,电纺条件为:流量为0.02～0.10mL/h，电压为12～20kV,接收距离为15～20cm,得到50～200μm厚度的电纺纤维膜。

实施例1：

在装有磁力搅拌的三口瓶中,将3g聚ε-己内酯(双端羟基)溶解于10mL无水二氯甲烷中，按照按照摩尔比[双端羟基聚ε-己内酯]/[CDI]为1:2加入CDI65.0mg，在N₂中室温下搅拌反应24h，然后加入2.0mL的乙二胺，室温搅拌反应48h，产物用过量的甲醇沉淀，真空干燥24h,得到聚ε-己内酯的氨基改性物。

将聚ε-己内酯的氨基改性物78mg溶解在3mL的二氯甲烷溶液,按照聚ε-己内酯的氨基改性物中的氨基与双端PEG中的NHS基团摩尔比为1：1加入双端PEG,马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯(MAL-PEG-NHS,)208mg,室温搅拌反应6h，产物使用乙醇沉淀，得到聚ε-己内酯-g-聚乙二醇。将聚ε-己内酯-g-聚乙二醇600mg溶解在3mL的二氯甲烷溶液，按照摩尔比[聚ε-己内酯-g-聚乙二醇]/[REDV]＝1:1加入REDV 44mg，室温搅拌反应3h，产物使用乙醇沉淀，得到聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV小肽。

所制得的聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV小肽和聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(LA:CL＝3:1,)按照质量比1:1，溶于氯仿和N,N-二甲基甲酰胺以体积比为8:1的混和溶剂中,配制成浓度200mg/mL的电纺溶液。将上述混和溶液作为电纺溶液的油相，将溶度为0.3mg/mL的miRNA复合物溶液作为水相。并按照水油比1:25混和20min至均匀。电纺条件为：溶液的流量为0.04mL/h,电纺的电压为12kV,接收距离是15cm,电纺24h,得到厚度100μm的电纺纤维膜。所制得包载miRNA的聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)/聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV电纺超细纤维膜。该纤维膜的SEM照片如图1所示,其中超细纤维直径为900～1000nm。

实施例2：

在装有磁力搅拌的三口瓶中,将5g聚ε-己内酯(双端羟基)溶解于10mL无水二氯甲烷中，按照摩尔比[双端羟基聚ε-己内酯]/[CDI]为1:2加入CDI 32.4mg，在N₂中室温下搅拌反应24h，然后加入2.0mL的乙二胺，室温搅拌反应60h,产物用过量的甲醇沉淀，真空干燥24h,得到聚ε-己内酯的氨基改性物。

将聚ε-己内酯的氨基改性物600mg溶解在3mL的二氯甲烷溶液,按照聚ε-己内酯的氨基改性物中的氨基与双端PEG中的NHS基团摩尔比为1:1加入双端PEG，马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯(MAL-PEG-NHS,)120mg,室温搅拌反应10h，产物使用乙醇沉淀，得到聚ε-己内酯-g-聚乙二醇。将聚ε-己内酯-g-聚乙二醇750mg溶解在3mL的二氯甲烷溶液，按照摩尔比[聚ε-己内酯-g-聚乙二醇]/[REDV]＝1:1加入REDV 16.9mg，室温搅拌反应3h，产物使用乙醇沉淀，得到聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV小肽。

所制得的聚ε-己内酯-g-小肽REDV和聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(LA:CL＝3:1,)按照质量比5:1，溶于氯仿和N,N二甲基甲酰胺以体积比为6:1的混和溶剂中,配制成浓度150mg/mL的电纺溶液。电纺条件为：溶液的流量为0.1mL/h,电纺的电压为13～15kV,接收距离是15～20cm,电纺12h，得到50μm厚度的电纺超细纤维膜，超细纤维膜的直径为800～900nm。

实施例3：

在装有磁力搅拌的三口瓶中,将4g聚ε-己内酯(单端羟基)溶解于10mL无水二氯甲烷中，按照摩尔比[单端羟基聚ε-己内酯]/[CDI]为1:1加入CDI 65.0mg，在N₂中室温下搅拌反应24h，然后加入2.0mL的乙二胺，室温搅拌反应72h，产物用过量的甲醇沉淀，真空干燥24h,得到聚ε-己内酯的氨基改性物。

将聚ε-己内酯的氨基改性物900mg溶解在3mL的二氯甲烷溶液,按照聚ε-己内酯的氨基改性物中的氨基与双端PEG中的NHS基团摩尔比为1:1加入双端PEG，马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯(MAL-PEG-NHS,)90mg,室温搅拌反应7h，产物使用乙醇沉淀，得到聚ε-己内酯-g-聚乙二醇。将聚ε-己内酯-g-聚乙二醇900mg溶解在3mL的二氯甲烷溶液，按照摩尔比[聚ε-己内酯-g-聚乙二醇]/[REDV]＝1:1加入REDV 50.7mg，室温搅拌反应2h，产物使用乙醇沉淀，得到聚ε-己内酯-g-聚乙二醇-REDV小肽。

所制得的聚ε-己内酯-g-小肽REDV和聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(LA:CL＝3:1,)按照质量比2:1，溶于氯仿和N,N二甲基甲酰胺以体积为4:1的混和溶剂中,配制成浓度100mg/mL的电纺溶液。电纺条件为：溶液的流量为0.02mL/h,电纺的电压为15～20kV,接收距离是15～20cm,电纺24h，得到100～200μm厚度的电纺纤维膜，超细纤维的直径为400～700nm。