用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法

摘要

本发明公开了一种用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法，其用于基于荧光液滴的核酸检测，包括以下步骤：1)获取所有荧光液滴的荧光强度的数据，并进行预处理；2)对数据进行首次分类，3)根据首次分类的结果得出阴性液滴和阳性液滴荧光强度分布；4)计算最终判决阈值t；5)利用所述判决阈值t对数据进行二次分类；6)计算样品浓度。本发明的方法对数字PCR荧光微滴荧光强度分布进行了准确描述，能够在无需阴性对照的情况下自动确定合适的阈值从而识别阳性微滴的数量，能有效提高数据分类的准确率，从而能显著提高荧光液滴检测结果的精确性。

说明书

技术领域

本发明涉及用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法技术领域，尤其是一种基于荧光液滴的核酸检测的阳性液滴自动识别方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究。数字PCR是近年来发展迅速的新一代定量PCR分析技术，利用微流控技术将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有至少一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。与传统的荧光定量PCR相比，具有高灵敏度、高特异性、无需标准定量曲线等优点。数字PCR技术提出至今，相关技术和产业化发展都非常迅速，迄今为止，数字PCR技术主要有三类:微反应室孔板、大规模集成微流控芯片和液滴数字PCR系统。

早期的数字PCR采用96/384孔板作为反应单元，随着对测试灵敏度和准确度的要求不断提高，反应单元的数目不断增加，使得操作的复杂度和所需试剂量也成倍增加。大规模集成微流控芯片技术的出现为数字PCR分析提供了一个低成本、小体积和高通量平行分析的方案。液滴式数字PCR系统源于乳液PCR技术，通过油水两相间隔得到的以液滴为单位的PCR反应体系，比微孔板和集成微流控芯片系统更容易实现小体积和高通量，而且系统简单，成本低，因此成为理想的数字PCR技术平台。

液滴微流控芯片是近年来在微流控芯片基础上发展起来的一种新的操纵微量液体的技术。与传统微通道芯片相比，微液滴的体积更小(10^-9L-10^-12L)，可灵活操控，尺寸均一，形状可变，传热传质性能优秀，并具有高通量分析的良好潜力。将液滴微流控技术应用在生化分析领域，常使用荧光标记感兴趣的细胞或分子，通过识别带荧光液滴检测样品中待测物浓度。因此准确地确定荧光阈值对最终结果具有重要影响，目前基于荧光微滴PCR核酸检测的阈值确定方法有两种，一种是使用无待测样品的阴性质控品，通过统计该质控品中微滴的最大荧光强度决定判别阈值，这种判决方法的识别准确性高，但需要参考阴性质控；另一种则基于Kmeans聚类算法，该方法无需对比，但由于荧光微滴的分布并非简单两类，而存在多种干扰，最终结果往往出现较大偏差。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法，其用于基于荧光液滴的核酸检测中液滴的自动识别，尤其可用于液滴式样品的荧光检测中的荧光液滴的自动识别，包括以下步骤：

一种用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法，其用于基于荧光液滴的核酸检测，其特征在于，包括以下步骤：

1)获取所有荧光液滴的荧光强度的数据，并进行预处理；

2)对所述步骤1)中的数据进行首次分类，得到阳性液滴和阴性液滴的首次分类范围，所述首次分类的方法包括传统聚类算法或基于模型的聚类算法；

3)根据所述步骤2)的首次分类结果得出阴性液滴和阳性液滴荧光强度分布，再利用极大似然估计方法分别将阴性液滴和阳性液滴荧光强度分布拟合为单参数正态分布，再根据各自的正态分布结果分别计算其统计特性值，包括峰值、均值和标准差；

4)根据判决公式：

t＝p_n+α·σ

计算最终判决阈值t，其中p_n为阴性液滴强度峰值，α为调整因子，σ为阴性荧光强度分布的标准差；

5)利用所述判决阈值t对所述步骤1)中的数据进行二次分类，识别阳性液滴与阴性液滴，并计算阳性液滴占总液滴的比例，再根据泊松公式：

计算出平均每滴液滴中的待测物拷贝数，其中为平均每滴液滴中的待测物浓度，p表示液滴为阳性液滴的概率，其估计值为即为阳性液滴占总液滴的比例，H为阳性液滴数，C为液滴总数；是p的无偏估计；

6)根据浓度计算公式：

计算出样品中的待测物浓度，其中Con为样品中的待测物浓度(拷贝数/uL)，Vd为液滴体积。

优选的是，所述步骤1)中获取所有荧光液滴的荧光强度的数据的方法包括：通过激发光依次照射激发所有样品液滴，使其产生荧光，再检测样品液滴产生的荧光强度的原始值，并收集激发光强度、样品液滴流速和样品液滴直径参数，再绘制时间-光强曲线并根据时间-光强曲线查找峰值，再利用所述收集的激发光强度、样品液滴流速和样品液滴直径参数校正测得的荧光强度的原始值，最终获得能用于所述步骤1)的所有荧光液滴的荧光强度的数据。

优选的是，所述步骤5)中识别阳性液滴与阴性液滴的方法包括：通过权利要求2中所述的时间-荧光强度曲线查找峰值，再将每个液滴的峰值荧光强度与所述步骤4)中得到的判决阈值t进行对比，峰值高于判决阈值t的即为阳性液滴，反之，则为阴性液滴。

优选的是，计算阳性占比的方法为：分别统计阳性液滴数与阴性液滴的个数，依次计为H和h，计算出阳性液滴占比

优选的是，所述步骤1)中的预处理方法为使用简单移动平均法对数据直接进行平滑，以去除随机背景噪声。

优选的是，所述步骤2)中的首次分类的方法包括Kmeans聚类算法。

优选的是，所述步骤2)中的首次分类的方法还包括GMM模型聚类算法。

优选的是，所述步骤4)中的调整因子α根据所述步骤3)中的统计特性值确定，调整因子α的值须使得99％以上的阴性液滴在判决阈值t以下。

本发明的用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法用于基于荧光液滴的核酸检测，在先获取所有荧光液滴的荧光强度的数据后，利用本发明提供的方法对获取的所有荧光液滴的荧光强度的数据进行处理，以最终得到荧光液滴的检测结果。

其中，所述步骤1)中获取所有荧光液滴的荧光强度的数据的装置可由专利号为201410682234.9、专利名称为“一种液滴式样品荧光检测系统和方法”的专利中提供，其先通过激发光检测模块调整光源强度至指定强度I；再将样品从储液池中吸入至充满样品通道，随后吸入载运液滴的分散相，并检测液路稳定后荧光探测模块接收到的光强平均值作为背景荧光，设其强度为F0；然后检测稀释后的样品液滴的荧光强度，在此过程中控制器模块通过激发光探测模块和荧光探测模块收集激发光强度、液滴流速和液滴直径-参数；再根据时间-荧光强度曲线查找峰值，并利用上述参数识别有效液滴并校正测得的荧光强度。其校正后的荧光强度即作为本发明所述的步骤1)中的荧光液滴的荧光强度的数据。

通过本发明提供的用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法，能确定更加精确用于荧光液滴分类的阈值，从而改善荧光液滴的识别精度，提高荧光检测结果的准确性。

本发明的有益效果：本发明的方法对数字PCR荧光微滴荧光强度分布进行了准确描述，能够在无需阴性对照的情况下自动确定合适的阈值从而识别阳性液与阴性液滴的数量，能有效提高数据分类的准确率，从而能显著提高荧光液滴检测结果的精确性。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书、以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

图1为本发明的用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法的原理算法示意图；

图2为一种获取所有荧光液滴的荧光强度数据的装置的功能单元示意图；

图3为一种获取所有荧光液滴的荧光强度数据的装置的结构示意图；

图4为时间-光强采集信号曲线图；

图5为液滴荧光强度曲线图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

图1为本发明的用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法的原理示意图，本实施例的一种用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法，其用于基于荧光液滴的核酸检测的阳性液滴自动识别，尤其可用于液滴式样品的荧光检测，包括以下步骤：

1)获取所有荧光液滴的荧光强度的数据，并进行预处理；

其中，对该数据进行清理，主要包括去除随机背景噪声，为了使得荧光强度分布不变形，预处理方法为使用简单移动平均法对数据直接进行平滑；

2)对所述步骤1)中的数据进行首次分类，得到阳性液滴和阴性液滴的首次分类范围；

其中，分类可通过多种方法进行，包括各种传统聚类算法如Kmeans聚类或基于模型的聚类算法如GMM模型聚类。此外，先通过前期试验可以分别确定必定属于阳性和必定属于阴性的荧光强度，随后使用二者之间过渡带的任意随机值也可用做首次分类阈值。

3)根据所述步骤2)的首次分类结果得出阴性液滴和阳性液滴荧光强度分布，再利用极大似然估计方法分别将阴性液滴和阳性液滴荧光强度分布拟合为单参数正态分布，再根据各自的正态分布结果分别计算其统计特性值，包括峰值、均值和标准差；

4)根据判决公式：

t＝p_n+α·σ

计算最终判决阈值t，其中p_n为阴性液滴强度峰值，α为调整因子，σ为阴性荧光强度分布的标准差；

其中，由于过渡带液滴大部分是由扩增不够充分的阳性液滴构成，尽可能靠近阴性液滴的结果能令计算结果更为准确；

其中，选择步骤3)中合适的统计特性以确定调整因子，由于判决公式中考虑的因素为阴性液滴，调整因子的选择需要覆盖尽可能多的阴性液滴，选择的调整因子应使得99％以上的阴性液滴在判决阈值t以下。

5)利用所述判决阈值t对所述步骤1)中的数据进行二次分类，识别阳性液滴与阴性液滴，并计算阳性液滴所占比例，再根据泊松公式：

计算出平均每滴液滴中的待测物拷贝数，其中为平均每滴液滴中的待测物拷贝数，即待测物浓度，p表示液滴为阳性液滴的概率，其估计值为即为阳性液滴占总液滴的比例，H为阳性液滴数，C为液滴总数，是p的无偏估计；

6)根据浓度计算公式：

计算出样品中的待测物浓度，其中Con为样品中的待测物浓度(拷贝数/uL)，Vd为液滴体积。

其中，需要理解的是，含有待测物的液滴定义为阳性液滴，反之则定义为阴性液滴。

其中，所述步骤1)中获取所有荧光液滴的荧光强度的数据的方法包括：通过激发光依次照射激发所有样品液滴，使其产生荧光，再检测样品液滴产生的荧光强度的原始值，并收集激发光强度、样品液滴流速和样品液滴直径参数，再绘制时间-光强曲线并根据时间-光强曲线查找峰值，再利用所述收集的激发光强度、样品液滴流速和样品液滴直径参数校正测得的荧光强度的原始值，最终获得能用于所述步骤1)的所有荧光液滴的荧光强度的数据。其中，所述步骤5)中识别阳性液滴与阴性液滴的方法为：根据权利要求中所述的时间-荧光强度曲线查找峰值，再将每个液滴的峰值荧光强度与所述步骤4)中得到的判决阈值t进行对比，峰值高于判决阈值t的即为阳性液滴，反之，则为阴性液滴。

其中，所述步骤5)中计算阳性占比的方法为：分别统计阳性液滴数与阴性液滴的个数，依次计为H和h，计算出阳性液滴占比

本实施例中还提供一种获取所有荧光液滴的荧光强度数据的装置，包括：激发光模块、激发光探测模块、荧光探测模块以及控制器模块，所述控制器模块连接荧光探测模块和激发光探测模块，且在激发光模块和荧光探测模块之间设有检测区域，所述检测区域放置待测的液滴样品，所述激发光模块发出的光照射并激发，所述液滴样品中含有荧光染料的液滴发出荧光，荧光探测模块中包括有光电探测器，所述荧光被所述荧光探测模块接收后转换成数字信号，并发送到控制器模块。

图2是本案引用的专利号为201410682234.9、专利名称为“一种液滴式样品荧光检测系统和方法”中的一种获取所有荧光液滴的荧光强度数据的装置的功能单元示意图，图3是本案引用的专利号为201410682234.9、专利名称为“一种液滴式样品荧光检测系统和方法”中的的一种获取所有荧光液滴的荧光强度数据的装置的结构示意图。经过稀释后的待测液滴33在特定的检测区域33中被激发光模块1的激光激发后并产生荧光，后者则被荧光探测模块4中的光电探测器31(如光电倍增管等)接收并产生电信号。激发光模块1包含：至少一个激发光源21、准直透镜22、滤光片23、分光镜24和聚焦透镜25等功能组件。

其中，激发光源可以使用特定波长范围的激光或LED。由激发光源21发射出的光经过准直镜22后，又通过滤光片23滤除激发光波长范围外的光线。如存在一个以上激发光源，在经过滤光片滤光后需要再经合束镜将光束合成，为防止干扰，各激发光源对应的滤光片通带波长范围应互不重叠。为监控激发光状态，激发光合束后经分光镜24分光，部分进入激发光检测模块3，大部分则被反射后经过聚焦透镜25进入待测芯片的检测区域激发荧光。

其中，激发光聚焦照射待测芯片检测通道中的液滴后发出荧光，随后在荧光检测模块4中进行检测。

为防止激发光干扰，荧光检测模块4的光轴与激发光模块的光轴并不平行，而是呈现一定的角度如60°或垂直。荧光检测模块4包含滤光片29、透镜30和至少一组光电探测器31，如液滴中发射出超过一种染料波长的荧光，则还需增加相应波长的分光镜。发射光经过通带为各自波长的滤光片29后经透镜30聚焦，随后被PMT所检测。

激发光探测模块3用于监测发射光源的光强值，激发光在经过分光镜后少部分监测光束经过滤光片26、聚焦透镜27后进入光电探测器28。由此，控制器可实时获得激发光强度。

该装置获取所有荧光液滴的荧光强度数据的的方法为：通过激发光模块发射激发光，利用激发光探测模块检测激发光的强度，从而结合激发光探测模块调节激发光强度至指定值；通过荧光探测模块接收检测区域内发出的荧光；先测定检测区域内无样品时荧光探测模块接收到的光强值，并将其作为背景荧光强度；然后将所有待测样品依次置于检测区域，检测待测样品的荧光强度，在此过程中，控制器模块通过激发光探测模块和荧光探测模块收集激发光强度、液滴流速和液滴直径参数；根据上述数据，绘制时间-光强曲线，并校正该曲线后，最终获取所有荧光液滴的荧光强度数据。

如图4和图5所示，一种根据判决阈值t识别阳性液滴与阴性液滴的具体方法：控制器通过激发光探测模块和荧光探测模块收集激发光强度等参数并绘制在时间-光强曲线上根据该曲线可进一步获得其他表征液滴的参数，并用于识别和校正液滴。50为背景荧光强度，由检测开始时空白载流相的荧光强度获得，51是峰值所在的时间点，强度大于背景荧光的持续时间52表征液滴直径td，将液滴直径与过去一段时间内(如过去的10个有效液滴)的有效液滴直径平均值之比作为调整因子α，峰峰值之间的时间间隔53用于表征液滴之间的间隔时间Δt，间隔时间Δt的倒数即为液滴频率。由于待测试芯片中的液滴由固定体积的样品生成，液滴数目可认为是固定的，根据已知的液滴数与液滴频率可计算剩余的测试时间。峰值强度由AD(模数转换器)采样时获得的局部极大值以及左右各数点强度平均获得，为校正液滴的影响，最终峰值强度54需要乘以调整因子α。为了验证液滴是否含有荧光，将液滴峰值强度与前述得到的判决阈值t55做比较，大于阈值的认为为阳性液滴，反之为阴性。有效的液滴总数等于阳性液滴加阴性液滴的数目。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。