一种有机荧光染料分子标记生物组织的荧光控制方法

摘要

本发明公开了一种有机荧光染料分子标记生物组织的荧光控制方法，利用金属离子与有机荧光染料分子结合形成六元环，淬灭有机荧光染料分子的荧光；利用金属离子螯合剂与金属离子形成配位键，破坏金属离子与有机荧光染料分子的结合，重激活有机荧光染料分子的荧光。本发明提供的荧光控制方法荧光淬灭彻底，重激活方便可控，本发明提供的有机荧光染料分子标记生物组织的荧光控制方法结合宽场成像系统能够对荧光染料分子标记的样品进行化学层析成像，实现有机荧光分子标记的大体积生物组织的快速化学层析成像。

说明书

技术领域

本发明属于生物成像领域，更具体地，涉及一种有机荧光染料分子标记生物组织的荧光控制方法。

背景技术

获取详细地生物组织中的分子和蛋白的空间分布，是理解生物体结构和功能关系的重要基础。荧光探针标记技术能够对特定的分子和蛋白进行标记，为了能够更好的研究这些分子和蛋白在生物组织中的空间分布及功能，在同一生物体内进行多种荧光探针标记的方法，已被广泛应用于生物学及医学领域。

针对荧光探针标记的生物组织进行光学成像时，目前已有的物理层析技术主要有两种：一种是光学层析技术，通过光学方法抑制焦面以外的荧光从而提高z向分辨率，光学层析技术的主要限制在于其z向分辨率较低，并且光学层析技术采用点扫描模式，对于多色荧光探针标记的生物组织，扫描时间较长；另一种是机械层析技术，通过将生物组织包埋在树脂中，通过物理切片的方式产生组织薄片，再对组织薄片进行宽场成像，物理层析技术的主要限制在于通过这种方法进行成像的过程中，组织薄片容易丢失，操做复杂，耗时较长，得到的图像，其后期处理及三维配准非常困难，无法用于大体积的生物组织。

有机荧光染料分子标记生物组织，具有如下的优势：发光效率高、稳定不易被淬灭、应用范围广并能够展示更多的神经精细结构。但是现有技术的物理层析技术对有机荧光染料分子标记生物组织进行荧光成像时，由于缺乏合适的荧光控制方法，导致成像时存在淬灭不彻底导致成像背景荧光干扰、图像采集通量低、Z向分辨率低、三维配准难以精确等技术问题。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种有机荧光染料分子标记生物组织的荧光控制方法，其目的在于通过利用金属离子与有机荧光染料分子结合形成六元环，降低有机荧光分子的共轭π电子密度，从而可逆的淬灭有机荧光染料分子的荧光；再利用金属离子螯合剂与金属离子形成配位键，破坏金属离子与有机荧光染料分子的结合，恢复其共轭π电子结构，从而重激活有机荧光染料分子的荧光，通过本发明的荧光控制方法，并将其应用于层析成像技术中，由此解决现有技术物理层析技术存在的淬灭不彻底导致成像背景荧光干扰、图像采集通量低、Z向分辨率低、三维配准难以精确等技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种有机荧光染料分子标记生物组织的荧光控制方法，利用金属离子与有机荧光染料分子结合形成六元环，淬灭有机荧光染料分子的荧光，利用金属离子螯合剂与金属离子形成配位键，破坏金属离子与有机荧光染料分子的结合，重激活有机荧光染料分子的荧光。

优选地，所述的荧光控制方法，包括如下步骤：

(1)淬灭荧光：将有机荧光染料分子标记的生物组织浸渍在金属离子化合物的水溶液中，金属离子与有机荧光染料分子结合形成六元环，从而降低荧光发色团的共轭π电子云密度以淬灭有机荧光染料分子的荧光，获得荧光淬灭的生物组织；

(2)重激活荧光：将步骤(1)获得的荧光淬灭的生物组织浸渍在金属离子螯合剂中，金属离子螯合剂与金属离子形成配位键，破坏金属离子与有机荧光染料分子的结合，重激活有机荧光染料分子的荧光。

优选地，所述有机荧光染料分子为Alexa系列荧光染料分子，包括Alexa488、Alexa 514、Alexa 532和/或Alexa 546中的一种或多种。

优选地，所述金属离子化合物为过渡金属离子化合物。

优选地，所述过渡金属离子化合物为Cr²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu⁺和/或Cu²⁺中的一种或多种的化合物，优选为Fe³⁺的化合物，进一步优选为Fe₂(SO₄)₃或FeCl₃。

优选地，所述过渡态金属离子的浓度为10mmol/L～500mmol/L。

优选地，所述过渡态金属离子的浓度为100～400mmol/L。

优选地，所述金属离子螯合剂为EDTA-Na₄、8-羟基喹啉、二甲基二硫代氨基甲酸钠、N-油酰肌氨酸、原卟啉钠、二乙二胺和/或去铁敏中的一种或多种。

优选地，所述金属离子螯合剂为去铁敏或EDTA-Na₄。

优选地，所述金属离子螯合剂的浓度为100mmol/L～500mmol/L。

优选地，所述金属离子螯合剂的浓度为200～500mmol/L。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

(1)本发明提供的有机荧光染料分子标记生物组织的荧光控制方法通过利用过渡金属离子与有机荧光分子形成六元环，降低有机荧光分子的共轭π电子密度，从而猝灭有机荧光染料分子的荧光，淬灭可逆、可控且彻底。

(2)通过利用螯合剂与金属离子形成配位健，其结合能力大于金属离子与有机荧光分子的结合力，从而破坏金属离子与有机荧光分子的结合，恢复其共轭π电子结构，重激活有机荧光染料分子的荧光，重激活方便，且程度高、效果好，其荧光强度对比度大大增加，其重新激活后的荧光强度是淬灭状态的荧光强度的10倍以上，保证了其用于进一步成像的成像效果。

(3)本发明荧光染料分子标记的生物组织的荧光控制方法，可应用于大体积生物组织的层析成像，通过精确控制淬灭和重激活的荧光对比度来最大程度地抑制背景荧光的干扰，另外通过控制重激活生物组织表层荧光并成像，生物组织表层的激活厚度即为Z向层析的厚度，Z向层析的厚度为0.5微米甚至纳米级，从而提高了Z向分辨率。

(4)本发明提供的荧光染料分子标记生物组织的荧光控制方法结合宽场成像系统能够对荧光染料分子标记的样品实现快速自动化扫描成像，操作简单，三维配准精确，后期处理可以实现自动化，图像采集通量高，Z向分辨率高，可以实现有机荧光分子标记的大体积生物组织的快速化学层析成像。

附图说明

图1是本发明的有机荧光染料分子标记生物组织的荧光控制方法流程图；

图2是Alexa 488荧光染料分子的淬灭-重激活机理；

图3是Alexa 514荧光染料分子的淬灭-重激活机理；

图4是Alexa 532荧光染料分子的淬灭-重激活机理；

图5是Alexa 546荧光染料分子的淬灭-重激活机理；

图6是实施例1的Alexa 488荧光染料分子免疫组化标记鼠脑组织的淬灭-激活成像图。图6(a)是Alexa 488荧光染料分子免疫组化标记鼠脑组织在10mmol/L FeSO₄溶液中淬灭后的图像，其为对比度增大10倍后的图像；图6(b)是Alexa>

图7是实施例2的Alexa 488荧光染料分子免疫组化标记鼠脑组织的淬灭-激活成像图。图7(a)是Alexa 488荧光染料分子免疫组化标记鼠脑组织在100mmol/L FeCl₃溶液中淬灭后的图像，其为对比度增大10倍后的图像；图7(b)是Alexa>4溶液中的重激活图像；

图8是实施例3的Alexa 514荧光染料分子免疫组化标记鼠脑组织的淬灭-激活成像图。图8(a)是Alexa 514荧光染料分子免疫组化标记鼠脑组织在200mmol/L NiSO₄淬灭后的图像，其为对比度增大10倍后的图像；图8(b)是Alexa>

图9是实施例5的Alexa 514荧光染料分子免疫组化标记鼠脑组织的淬灭-激活成像图。图9(a)是Alexa 514荧光染料分子免疫组化标记鼠脑组织在400mmol/L MnSO₄淬灭后的图像，其为对比度增大10倍后的图像；图9(b)是Alexa>

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供的有机荧光染料分子标记生物组织的荧光控制方法，包括如下步骤：

(1)固定和漂洗生物组织：将生物组织采用4％的PFA溶液进行固定和0.9％的NaCl溶液漂洗处理；

(2)标记生物组织：将固定和漂洗后的生物组织采用有机荧光染料分子进行免疫组化标记。首先采用20％DMSO和0.2％Triton X-100的PBS溶液对100微米固定和漂洗后的生物组织片进行打孔处理12小时，然后加入10％的血清封闭12小时，采用PBS漂洗1小时/3次后再按照500:1的比例加入一抗在37℃避光下振动孵育2天，37℃避光下振动孵育2天后再按照800:1的比例加入带有有机荧光染料分子的二抗在4℃避光下振动孵育8小时后采用PBS漂洗1小时/3次，获得有机荧光染料分子免疫组化标记的生物组织；

(3)淬灭荧光：将步骤(2)获得的有机荧光染料分子免疫组化标记后的生物组织浸渍在过渡金属离子化合物的水溶液中，过渡金属离子的浓度为10mmol/L～500mmol/L，优选为100～400mmol/L，过渡金属离子与有机荧光染料分子结合形成六元环，从而淬灭有机荧光染料分子的荧光，获得荧光淬灭的生物组织；

(3)重激活荧光：将步骤(2)获得的荧光淬灭的生物组织浸渍在金属离子螯合剂中，金属离子螯合剂的浓度为100mmol/L～500mmol/L，优选为200～500mmol/L，金属离子螯合剂与金属离子形成配位键，破坏金属离子与有机荧光染料分子的结合，重激活有机荧光染料分子的荧光。

其中，有机荧光染料分子为Alexa系列荧光染料分子，包括Alexa 488、Alexa 514、Alexa 532和/或Alexa 546中的一种或多种。

过渡金属离子化合物优选为为Cr²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu⁺和/或Cu²⁺中的一种或多种的化合物，优选为Fe³⁺的化合物，进一步优选为FeCl₃或Fe₂(SO₄)₃。

金属离子螯合剂为EDTA-Na₄、8-羟基喹啉、N-油酰肌氨酸、二甲基二硫代氨基甲酸钠、原卟啉钠、二乙二胺和/或去铁敏中的一种或多种，优选为去铁敏或EDTA-Na₄。

步骤(3)对标记后的生物组织浸渍在过渡金属离子化合物的水溶液中荧光淬灭的浸渍时间以及步骤(4)对获得的荧光淬灭的生物组织浸渍在金属离子螯合剂中的荧光重激活时间取决于选择的生物组织的具体厚度和其它性质，本发明实施例中的生物组织样品选用的是100微米鼠脑冠状面脑片，其步骤(3)荧光淬灭浸渍处理时间为10～60min，优选为10～30min；步骤(4)重激活荧光浸渍处理时间为10～60min，优选为10～30min。

图1为有机荧光染料分子标记生物组织的荧光控制方法流程图。图2、图3、图4和图5分别是荧光染料分子Alexa 488、Alexa 514、Alexa 532和Alexa 546利用本发明的荧光控制方法的淬灭-重激活机理示意图。

本发明提供的有机荧光染料分子标记生物组织的荧光控制方法通过利用过渡金属离子与有机荧光染料分子形成六元环，降低有机荧光分子的共轭π电子密度，从而将有机荧光染料分子标记在生物组织上的荧光猝灭，淬灭可控且彻底；再通过利用螯合剂与金属离子形成配位健，其结合能力大于金属离子与有机荧光分子的结合力，从而破坏金属离子与有机荧光分子的结合，恢复其共轭π电子结构，重激活有机荧光染料分子的荧光，重激活方便，效果好。

采用本发明的荧光控制方法，通过大量实验优选淬灭或激活试剂及其浓度以及荧光控制条件，可以使其荧光强度对比度大大增加，其重新激活后的荧光强度是淬灭状态的荧光强度的10倍以上，保证了其用于进一步成像的成像效果。

本发明提供的有机荧光染料分子标记生物组织的荧光控制方法可以结合宽场成像系统实现大体积生物组织的快速宽场成像，且Z向分辨率高。采用本发明的荧光淬灭方法先将荧光染料分子标记生物组织的荧光完全淬灭，然后再利用本发明的荧光重激活方法激活生物组织的表层荧光并成像，成像时由于荧光完全淬灭，因此无背景荧光干扰；重激活生物组织的表层厚度即为层析成像时的Z向分辨率，Z向层析的厚度为0.5微米甚至纳米级，从而提高了Z向分辨率。

按以下方法对以下实施例中激活前后的样品(100微米鼠脑冠状面脑片)荧光强度进行了测试：

样品：100微米鼠脑冠状面脑片。

仪器：德国Zeiss双飞秒激光器多光子显微镜。

测试条件：Laser 488nm,4％；pinhole 40；gain master 550；像素1024×1024，16bit；成像深度60微米，×20W。

以下为实施例：

实施例1

(1)将灌流后的鼠脑采用4％的PFA溶液进行固定和PBS溶液进行漂洗处理；

(2)将固定和漂洗后的100微米鼠脑组织片采用Alexa 488进行免疫组化标记并采用PBS溶液进行漂洗处理：首先采用20％DMSO和0.2％Triton X-100的PBS溶液对100微米固定和漂洗后的鼠脑组织片进行打孔处理12小时，然后加入10％的血清封闭12小时，采用PBS漂洗1小时/3次后再按照500:1的比例加入一抗在37℃避光下振动孵育2天，37℃避光下振动孵育2天后再按照800:1的比例加入带有Alexa 488的二抗在4℃避光下振动孵育8小时后采用PBS漂洗1小时/3次，获得Alexa 488免疫组化标记的100微米鼠脑组织片；

(3)将Alexa 488免疫组化标记的100微米鼠脑组织片在室温环境下浸泡在10mmol/L FeSO₄溶液进行淬灭处理20分钟后进行成像；

(4)将淬灭后的Alexa 488免疫组化标记的鼠脑组织片在室温环境下浸泡在100mmol/L去铁敏溶液进行重激活20分钟后进行荧光成像。

图6是实施例1的Alexa 488荧光染料分子免疫组化标记鼠脑组织的淬灭-激活成像图。图6(a)是Alexa 488荧光染料分子免疫组化标记鼠脑组织在10mmol/L FeSO₄溶液中淬灭后的图像，其为对比度增大10倍处理后的图像，便于和激活后的荧光强度进行对比；图6(b)是Alexa>

实施例2

(1)将灌流后的鼠脑采用4％的PFA溶液进行固定和PBS溶液进行漂洗处理；

(2)将固定和漂洗后的100微米鼠脑组织片采用Alexa 488进行免疫组化标记并采用PBS溶液进行漂洗处理：首先采用20％DMSO和0.2％Triton X-100的PBS溶液对100微米固定和漂洗后的鼠脑组织片进行打孔处理12小时，然后加入10％的血清封闭12小时，采用PBS漂洗1小时/3次后再按照500:1的比例加入一抗在37℃避光下振动孵育2天，37℃避光下振动孵育2天后再按照800:1的比例加入带有Alexa 488的二抗在4℃避光下振动孵育8小时后采用PBS漂洗1小时/3次，获得Alexa 488免疫组化标记的100微米鼠脑组织片；

(3)将Alexa 488免疫组化标记的100微米鼠脑组织片在室温环境下浸泡在100mmol/L FeCl₃溶液溶液进行淬灭处理30分钟后进行成像；

(4)将淬灭后的Alexa 488免疫组化标记的鼠脑组织片在室温环境下浸泡在200mmol/L EDTA-Na₄溶液进行重激活30分钟后进行荧光成像。

图7是实施例2的Alexa 488荧光染料分子免疫组化标记鼠脑组织的淬灭-激活成像图。图7(a)是Alexa 488荧光染料分子免疫组化标记鼠脑组织在100mmol/L FeCl₃溶液中淬灭后的图像，其为对比度增大10倍处理后的图像，便于和激活后的荧光强度进行对比；图7(b)是Alexa>4溶液中的重激活图像。可以看出，激活处理后，荧光强度与激活前荧光强度对比度放大10倍后的效果相当，即激活处理将荧光强度增强了10倍或以上。

实施例3

(1)将灌流后的100微米鼠脑组织采用4％的PFA溶液进行固定和PBS溶液进行漂洗处理；

(2)将固定和漂洗后的100微米鼠脑组织片采用Alexa 514进行免疫组化标记并采用PBS溶液进行漂洗处理：首先采用20％DMSO和0.2％Triton X-100的PBS溶液对100微米固定和漂洗后的鼠脑组织片进行打孔处理12小时，然后加入10％的血清封闭12小时，采用PBS漂洗1小时/3次后再按照500:1的比例加入一抗在37℃避光下振动孵育2天，37℃避光下振动孵育2天后再按照800:1的比例加入带有Alexa 514的二抗在4℃避光下振动孵育8小时后采用PBS漂洗1小时/3次，获得Alexa 514免疫组化标记的100微米鼠脑组织片；

(3)将Alexa 514免疫组化标记的100微米鼠脑组织片采用200mmol/L Fe₂(SO₄)₃溶液进行淬灭处理10分钟后进行成像；

(4)将淬灭后的Alexa 514免疫组化标记的鼠脑组织片采用500mmol/L EDTA-Na₄溶液进行重激活10分钟后进行荧光成像。

图8是实施例3的Alexa 514荧光染料分子免疫组化标记鼠脑组织的淬灭-激活成像图。图8(a)是Alexa 514荧光染料分子免疫组化标记鼠脑组织在200mmol/L Fe₂(SO₄)₃淬灭后的图像，其为对比度增大10倍处理后的图像，便于和激活后的荧光强度进行对比；图8(b)是Alexa>4溶液中的重激活图像。可以看出，激活处理后，荧光强度甚至比激活前荧光强度对比度放大10倍后的效果还要高，即说明激活处理将荧光强度增强了10倍以上，保证了其用于进一步的成像时的成像效果。

实施例4

(1)将灌流后的100微米鼠脑组织采用4％的PFA溶液进行固定和PBS溶液进行漂洗处理；

(2)将固定和漂洗后的100微米鼠脑组织片采用Alexa 514进行免疫组化标记并采用PBS溶液进行漂洗处理：首先采用20％DMSO和0.2％Triton X-100的PBS溶液对100微米固定和漂洗后的鼠脑组织片进行打孔处理12小时，然后加入10％的血清封闭12小时，采用PBS漂洗1小时/3次后再按照500:1的比例加入一抗在37℃避光下振动孵育2天，37℃避光下振动孵育2天后再按照800:1的比例加入带有Alexa 514的二抗在4℃避光下振动孵育8小时后采用PBS漂洗1小时/3次，获得Alexa 514免疫组化标记的100微米鼠脑组织片；

(3)将Alexa 514免疫组化标记的100微米鼠脑组织片采用500mmol/L NiSO₄溶液进行淬灭处理40分钟后进行成像；

(4)将淬灭后的Alexa 514免疫组化标记的鼠脑组织片采用500mmol/L原卟啉钠溶液进行重激活40分钟后进行荧光成像。

激活处理后，荧光强度比激活前荧光强度对比度放大10倍后的荧光强度高，保证了其用于进一步的成像时的成像效果。

实施例5

(1)将灌流后的100微米鼠脑组织采用4％的PFA溶液进行固定和PBS溶液进行漂洗处理；

(2)将固定和漂洗后的100微米鼠脑组织片采用Alexa 514进行免疫组化标记并采用PBS溶液进行漂洗处理：首先采用20％DMSO和0.2％Triton X-100的PBS溶液对100微米固定和漂洗后的鼠脑组织片进行打孔处理12小时，然后加入10％的血清封闭12小时，采用PBS漂洗1小时/3次后再按照500:1的比例加入一抗在37℃避光下振动孵育2天，37℃避光下振动孵育2天后再按照800:1的比例加入带有Alexa 514的二抗在4℃避光下振动孵育8小时后采用PBS漂洗1小时/3次，获得Alexa 514免疫组化标记的100微米鼠脑组织片；

(3)将Alexa 514免疫组化标记的100微米鼠脑组织片采用400mmol/L MnSO₄溶液进行淬灭处理60分钟后进行成像；

(4)将淬灭后的Alexa 514免疫组化标记的鼠脑组织片采用400mmol/L二甲基二硫代氨基甲酸钠溶液进行重激活60分钟后进行荧光成像。

图9是实施例5的Alexa 514荧光染料分子免疫组化标记鼠脑组织的淬灭-激活成像图。图9(a)是Alexa 514荧光染料分子免疫组化标记鼠脑组织在400mmol/L MnSO₄淬灭后的图像，其对比度增大了10倍；图9(b)是Alexa514荧光染料分子免疫组化标记鼠脑组织在400mmol/L二甲基二硫代氨基甲酸钠溶液中的重激活图像。激活处理后，荧光强度比激活前荧光强度对比度放大10倍后的荧光强度高，保证了其用于进一步的成像时的成像效果。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。