重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶及编码基因与表达和应用

摘要

本发明提供了一种重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶。本发明还提供了一种制备该重组外切菊粉酶的高效分泌表达方法，属于基因工程领域。该方法主要包括以下步骤：根据Swiss-Model建模结果，确定外源分离纯化标签引入鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的位置，即在远离该外切菊粉酶催化活性中心的N端引入编码6个组氨酸的分离纯化标签序列，将重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA，并将重组质粒经电转化法整合到毕赤酵母宿主菌X-33中，即可获得能高效分泌表达便于分离纯化、高活性的可降解菊粉产生高纯度果糖浆的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶。本发明制备的外切菊粉酶可广泛应用于食品、药品、生物能源等领域。

说明书

技术领域

本发明提供了一种携带6个组氨酸分离纯化标签的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶及其表达方法和应用。用该方法制备的上清中重组外切菊粉酶达到0.357mg/ml，酶活力高达2496U/ml，比活为6992U/mg，能高效降解菊粉产生高纯度的果糖浆，且便于分离纯化，可通过Ni-NTA>TMexcel>

背景技术

菊粉(inulin)是由D-呋喃果糖分子通过β-2,1-糖苷键相连而成的链状多糖，其末端与一分子葡萄糖残基相连。菊粉是继淀粉之后，植物中第二大储藏性多糖，广泛存在于菊芋(Jerusalem artichoke)、菊苣(Chicory)和大丽花(dahlia)等植物的根和块茎中(Kango N et al,Food Biotechnology,2011,25(3):165-212；He M et al,J Ind Microbiol Biotechnol,2014,41:105-114)。由于菊粉来源于非粮作物，近年来，菊粉作为生产果糖浆、果寡糖、生物乙醇、2,3-丁二醇及其它化学品的生物质原料受到广泛关注(Li Y et al,Biores Technol,2013,147:254–259；Wang GY et al,Biores Technol,2012,124:77–82)。开发利用菊粉，是生物炼制研究领域中一个重要的研究方向。

菊粉酶(inulinase)是一类能水解β-2,1-D果聚糖的水解酶，广泛存在于微生物和植物中，尤其是丝状真菌和酵母菌。菊粉酶能直接水解菊粉生产高纯度果糖浆、低聚果糖和燃料酒精，是果聚糖生物炼制中的关键一环，在食品、医药、生物能源方面具有十分重要的生产价值。根据水解菊粉的方式，菊粉酶可以分为外切菊粉酶(EC 3.2.1.80)和内切菊粉酶(EC 3.2.1.7)(Liu G L etal,Appl Microbiol Biotechnol,2014,98(21):9129-9138；李益民等，生物工程学报，2015，31(5)：670-681)。外切菊粉酶可以从菊粉分子的非还原末端催化水解下果糖残基产生果糖浆(Gao J et al,Applied biochemistry andbiotechnology,2014,173:1419-1430)。果糖广泛用于食品、医药和燃料乙醇等行业中。酶法生产果糖，相对于酸法制备果糖(80-100℃，pH＝1.0-2.0)，具有工艺简单、转化率高、产物纯、含量高等优点，是生产果糖最有前途的一条途径(Singh P et al,Food Technol.Biotechnol,2006,44,151–162)。产菊粉酶的微生物主要包括细菌、真菌和酵母菌，其中，酵母菌产菊粉酶的能力比真菌和细菌强，尤其是克鲁维酵母(Chi Z M et al,Appl MicrobiolBiotechnol,2009,82:211–220)。然而，自然界中分离产菊粉酶的菌株即耗时又耗力，且存在发酵周期长、产量不高、活性低等难题，难以满足大规模工业化生产的需求，即使产酶能力强的酵母菌，如来自龙舌兰汁的两株Kluyveromyces marxianus A1和A2所产菊粉酶的活性也仅为171U/mL(Cruz-Guerrero A E et al,World Journal of Microbiology andBiotechnology,2006,22(2):115-117)。采用优化培养基成分及培养条件、氯化锂-紫外线复合诱变、高密度发酵等方法，虽然在一定程度上提高了野生菌株产菊粉酶活性，如P.guilliermondii strain1的突变株M-30菊粉酶活力由原来48.1U/mL达到127.7U/mL(Gong F et al,J Ind Microbiolo Biotechnol,2007,34:179-185；Yu X j et al,Biochemical Engineering Journal,2009,43:266-271)，仍满足不了工业化需求。利用基因工程技术重组菊粉酶基因是解决天然菌株筛选所遇问题的有效措施。目前，许多不同微生物来源的外切菊粉酶基因利用基因重组方法进行了异源表达(Cao T S et al,Gene,2013,516:255-262；Kuzuwa S et al,Gene,2012,495:154-162；Gao J et al,Appliedbiochemistry and biotechnology,2014,173,1419-1430；Treichel H etal,Global Journal of Biochemistry,2012,3:1-13)，取得了一定的进展，将P.guilliermondiijiang strain1菌株的菊粉酶基因在毕赤酵母X-33中重组表达后，外切菊粉酶活力达到286.8±5.4U/mL(Zhang T et al,ProcessBiochemistry,2009,44:1335-1339)，总体而言，重组菊粉酶的活性低于600U/ml。目前为止，只有张素芳等将马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)CBS6556外切菊粉酶基因在毕赤酵母重组表达后，获得了活性高的重组外切菊粉酶(专利号CN 101469325B)，但重组的外切菊粉酶序列不携带分离纯化标签，只能通过超滤进行初步纯化，难以获得高纯度的酶，限制了其在食品、医药行业的应用，也不利于后期酶学性质研究。如何实现携带分离纯化标签序列且高效表达具有高活性的重组外切菊粉酶，成为本专利所要解决的问题。

经过分析发现，以往利用酵母系统进行外切菊粉酶重组表达时，携带的分离纯化标签一般在酶蛋白的C末端，而C端具有和底物结合的作用(M etal,J.Biol.Chem.2012,287:19674-19686)，引入分离纯化标签后可能会影响酶分子与底物的结合，进而对重组酶的活性产生影响；或引入分离纯化标签的同时添加了非酶蛋白自身的额外的氨基酸残基(Cao T Set al,Gene,2013,516:255-262；Zhang LH et al,Process Biochemistry,2003,38:1209-1212)，可能会对重组的外切菊粉酶的活性产生影响。

为此，我们采用Swiss-Model构建目的蛋白三维模型的方法，确定外源分离纯化标签引入鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的位置，即在远离该外切菊粉酶催化活性中心的N端引入编码6个组氨酸的分离纯化标签序列，并且不添加额外的氨基酸残基，然后将重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA，并将重组质粒经电转化法整合到毕赤酵母宿主菌X-33中。本发明制备的外切菊粉酶具有潜在的工业应用价值，可广泛应用于食品、药品、生物能源等领域。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种携带6个组氨酸分离纯化标签的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母(Kluyveromyces cicerisporus)CBS4857外切菊粉酶。

本发明的另一个目的是提供一种制备该重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的高效分泌表达方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种携带6个组氨酸分离纯化标签的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的高效分泌表达方法，其主要步骤为：首先利用Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org)对鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶进行三维模型构建，确定外源分离纯化标签引入该外切菊粉酶的位置，即在远离鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶催化活性中心的N端引入编码6个组氨酸分离纯化标签序列，然后将重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA，并将重组质粒经电转化法整合到毕赤酵母宿主菌X-33中，甲醇诱导表达即可获得重组的鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶。

本发明所述的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的编码基因(不带信号肽序列)是SEQ ID No.2中第16位至第1629位的碱基所构成的核苷酸序列，由其编码产生的外切菊粉酶的氨基酸序列为SEQ ID No.1；所述的分离纯化标签为目的蛋白N端的6个组氨酸，同时引入了XhoI酶切位点和Kex信号肽切割位点，确保对目的蛋白的天然N端进行纯化标签设计，不引入纯化标签序列以外的额外氨基酸残基，同时确保重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶在分泌表达过程中被有效的切割；所述的表达载体为毕赤酵母/大肠穿梭质粒pPICZαA；所述宿主细胞为毕赤酵母X-33；所述的重组质粒电转入毕赤酵母宿主细胞前，需用SacI限制性内切酶进行线性化处理，与宿主细胞在AOX1基因处整合，利用载体pPICZαA的醇氧化酶强启动子(pAOX1)进行外源蛋白的高效分泌表达。

一种高效分泌表达的携带6个组氨酸分离纯化标签的重组质粒的构建过程为：以鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因组为模板，设计了N端携带6个组氨酸分离纯化标签的引物，N-INU1-F：5’-TCTCTCGAGAAAAGAGATGGTGACAGCAAGGCCAT-3’和N-INU1-R：5’-CTCGCGGCCGCTCAAAGGTTAAATTGGGTAACG-3’，其中下划线分别为XhoI、NotI酶切位点，斜线为Kex2蛋白酶切割位点，黑体代表6×his标签序列，然后进行聚合酶链式反应(PCR)扩增得到N-端携带6个组氨酸标签序列的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因(不带信号肽序列)，通过TA克隆连接到T载体，测序正确后，经XhoI和NotI双酶切亚克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA(购自Invitrogen公司)，得到重组表达质粒pPICZαA-N-kcINU1。

一种高效分泌表达的携带6个组氨酸分离纯化标签的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的制备过程为：SacI线性化重组表达质粒后，电转化至毕赤酵母宿主细胞X-33(购自Invitrogen公司)，电转化的具体参数为：2mm转化杯，2000V电压，200Ω电阻，25uF电容，Zeocin抗性筛选后，酵母菌落PCR进行验证，具体过程参照Invitrogen公司毕赤酵母操作手册(pPICZαA,B,and C Pichia expression vectors for selection on Zeocin^TM>TM>

与现有技术相比，本发明的优势在于以下几点：

(1)和野生菌株生产菊粉酶相比，获得菊粉酶的发酵周期缩短，诱导24h即可检测到外切菊粉酶的活性，诱导96h发酵上清中的外切菊粉酶活性就可达到2496U/ml，比活为6992U/mg，上清中粗蛋白的表达量为0.357mg/ml。

(2)重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的N端携带6个组氨酸分离纯化标签，其优势在于，一是便于分离纯化，可通过Ni-NTA>TMexcel>TM>TM>TM>

附图说明

图1鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的3D结构模式图。模板为酿酒酵母蔗糖酶(Saccharomyces cevevisiae，PDB序列号4EQV)。鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的N端在酶分子外部，远离催化活性中心，C端被包裹在酶分子内部。D30、E215分别为鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的催化活性中心。

图2重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因PCR产物电泳图。产物大小为1643bp。M：DL 5,000DNA分子量标准；1：携带6个组氨酸标签的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因的PCR产物。

图3重组质粒pPICZαA-N-kcINU1构建模式图。

图4重组质粒pPICZαA-N-kcINU1双酶切鉴定结果电泳图。M：DL 5,000DNA分子量标准；1：pPICZαA-N-kcINU1的XhoI和NotI酶切鉴定结果，有两条带，一条为质粒pPICZαA，大小为3.5kb，一条为重组的鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶，大小为1.6kb。

图5重组质粒pPICZαA-N-kcINU1转化毕赤酵母X-33的酵母菌落PCR电泳图。

M：DL 5,000DNA分子量标准；1-8：重组质粒pPICZαA-N-kcINU1与毕赤酵母X-33基因组整合后的菌落PCR条带，条带大小约为2.2kb；9：空载pPICZαA与毕赤酵母X-33基因组整合后的菌落PCR条带，条带大小为540bp。

图6重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的诱导表达时间蛋白电泳图。泳道1：24h，泳道2：48h，泳道3：72h，泳道4：96h，泳道M：蛋白marker。

图7重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的蛋白纯化电泳图。泳道1：重组工程菌的诱导表达上清条带；泳道2：纯化的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶；泳道M：蛋白marker。

图8重组工程菌在诱导培养基中的菌体生长曲线图。

图9重组工程菌上清中外切菊粉酶的时间活性测定图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进一步说明。

序列表

SEQ ID No.1

(1)序列长度：538个氨基酸

(2)序列类型：氨基酸序列；链型：单链；拓扑结构：线性

(3)序列来源：人工序列

(4)序列特征：1-6位为组氨酸标签，7-538位为成熟鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶；7-359位为糖苷水解酶家族32的N端结构域，367-538位为糖苷水解酶家族32的C端结构域，360-366位是连接N端结构域与C端结构域的Linker区；潜在的N-糖基化修饰位点(NXT/S)共6个：209位，274位，369位，377位，392位，406位。

HHHHHHDGDSKAITNTTFSLNRPSVHFTPSHGWMNDPNGLWYDAKEEDWHLYYQYNPAATIWGTPLYWGHAVSKDLTSWTDYGASLGPGSDDAGAFSGSMVIDYNNTSGFFNSSVDPRQRAVAVWTLSKGPSQAQHISYSLDGGYTFQHYSDNAVLDINSSNFRDPKVFWHEGENGEDGRWIMAVAESQVFSVLFYSSPNLKNWTLESNFTITVWTGTQYECPGLVKVPYDSVADSSNSSDSKPDSAWVLFVSINPGGPLGGSVTQYFVGDFNGTHFTPIDDQTRFLDMGKDYYALQTFFNTPNEKDVYGIAWASNWQYAQQAPTDPWRSSMSLVRQFTLKDFSTNPNSADVVLNSQPVLNYDALRKNGTTYSITNYTVTSENGKKIKLDNPSGSLEFHLEYVFNGSPDIKSNVFADLSLYFKGNNDDNEYLRLGYETNGGAFFLDRGHTKIPFVKENLFFNHQLAVTNPVSNYTTNVFDVYGVIDKNIIELYFDNGNVVSTNTFFFSTNNVIGEIDIKSPYDKAYTINSFNVTQFNL

SEQ ID No.2

(1)序列长度：1643个bp

(2)序列类型：DNA序列

(3)序列来源：人工序列

(4)序列特征：编码区为16-1629位，4-9位为XhoI酶切位点，10-15位为Kex2蛋白酶切割位点，16-33位为6个组氨酸基因，上游引物序列为1-53位，下游引物序列为1611-1643位，1633-1640位为NotI酶切位点。

TCTCTCGAGAAAAGACATCATCATCATCATCATGATGGTGACAGCAAGGCCATCACTAACACCACTTTCAGTTTGAACAGACCTTCTGTGCATTTCACTCCATCCCATGGTTGGATGAACGATCCAAATGGTTTGTGGTACGATGCCAAGGAAGAAGACTGGCATTTGTACTACCAGTACAACCCAGCAGCCACGATCTGGGGTACTCCATTGTACTGGGGTCACGCTGTTTCCAAGGATTTGACTTCTTGGACAGATTACGGTGCTTCTTTGGGCCCAGGTTCCGACGACGCTGGTGCGTTCAGTGGTAGTATGGTTATCGATTATAACAATACTTCTGGTTTCTTCAACAGCTCTGTGGACCCAAGACAAAGAGCAGTTGCAGTCTGGACCTTGTCTAAGGGCCCAAGCCAAGCCCAGCACATCAGTTACTCGTTGGACGGTGGTTACACCTTCCAACACTATTCCGACAACGCCGTGTTGGACATCAACAGCTCCAACTTCAGAGACCCTAAGGTGTTCTGGCACGAGGGCGAGAACGGCGAAGATGGTCGTTGGATCATGGCCGTTGCTGAATCGCAAGTGTTCTCTGTGTTGTTCTACTCTTCTCCAAACTTGAAAAACTGGACCTTGGAATCCAACTTCACCATCACGGTCTGGACTGGTACCCAATACGAATGCCCAGGTCTAGTTAAGGTTCCATACGACAGTGTTGCTGACTCTTCGAACTCCTCCGACTCCAAGCCAGACTCCGCATGGGTCTTGTTTGTCTCCATCAACCCTGGTGGTCCATTGGGTGGTTCCGTTACCCAATACTTTGTTGGTGACTTCAACGGTACTCACTTCACTCCAATCGACGACCAAACCAGATTCCTAGACATGGGTAAGGACTACTACGCACTACAAACTTTCTTCAACACTCCAAACGAGAAGGACGTCTACGGTATCGCATGGGCTTCTAACTGGCAATACGCCCAACAAGCCCCAACTGACCCATGGCGTTCATCTATGAGTTTGGTTAGACAATTCACATTGAAAGACTTCAGCACAAACCCTAACTCCGCCGATGTCGTCTTGAACAGTCAACCAGTCTTGAACTATGATGCTTTGAGAAAGAACGGTACCACTTACAGCATCACAAACTACACCGTCACCTCCGAAAACGGCAAGAAGATCAAGCTAGACAACCCATCCGGTTCTCTTGAATTCCATCTTGAATACGTGTTTAACGGCTCCCCAGATATCAAGAGCAACGTGTTCGCTGATCTTTCCTTGTACTTCAAGGGTAACAACGACGACAACGAATACTTGAGATTGGGTTACGAAACCAACGGTGGTGCCTTCTTCTTGGACCGTGGCCACACCAAGATTCCTTTCGTGAAGGAGAACTTGTTCTTCAACCACCAATTGGCAGTTACCAACCCAGTTTCCAACTACACCACAAACGTCTTCGACGTTTACGGTGTCATTGACAAGAACATCATCGAATTGTACTTCGACAACGGTAACGTCGTCTCCACCAACACTTTCTTCTTCTCTACCAACAACGTTATTGGTGAAATTGACATCAAGTCACCATACGACAAGGCTTACACCATTAACTCATTTAACGTTACCCAATTTAACCTTTGAGCGGCCGCGAG

实施例1鹰嘴豆孢克鲁维酵母外切菊粉酶3D模型构建

利用同源建模服务器Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org)，以酿酒酵母蔗糖酶(Saccharomyces cevevisiae，PDB序列号4EQV)为模板，对鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶进行三维结构构建，3D结构如图1。鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的N端由5-折叠β-螺旋片组成，C-端是β-三明治结构，中间由linker连接。从图1可以看出，鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的N末端游离在酶分子外部，并且远离催化活性中心(D30/E215)不会对酶的催化活性产生影响，而C末端序列被包裹在酶分子内部，如果在其末端直接引入6个组氨酸标签，则不能起到分离纯化标签的作用，且C端具有和底物结合的作用(álvaro-Benito M etal,J.Biol.Chem.2012,287:19674-19686)，引入分离纯化标签后可能会影响酶分子与底物的结合，进而对重组酶的活性产生影响。因此，我们在远离鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶酶催化活性中心的N端引入编码6个组氨酸分离纯化标签序列。

实施例2N末端携带6个组氨酸标签序列的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因克隆

以鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因组为模板，N末端携带6个组氨酸分离纯化标签的碱基序列，N-INU1-F:5’-TCTCTCGAGAAAAGAGATGGTGACAGCAAGGCCAT-3’和N-INU1-R:5’-CTCGCGGCCGCTCAAAGGTTAAATTGGGTAACG-3’为引物，其中下划线分别为XhoI、NotI酶切位点，斜线为Kex2蛋白酶切割位点，黑体代表6个组氨酸标签序列，以LATaq>

实施例3重组质粒pPICZαA-N-kcINU1的构建

重组质粒pPICZαA-N-kcINU1的构建模式如图3，载体pPICZαA上的α-因子分泌信号序列基因与N末端携带6个组氨酸标签序列的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因(不带信号肽序列)直接相连，使用载体pPICZαA上的Kex2蛋白酶切割位点，切去分泌表达的鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶信号肽序列，得到成熟的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶。pPICZαA-N-kcINU1的具体构建过程如下。

将纯化的PCR产物与T载体pMD19-T进行TA连接，连接产物转化E.coliTop10，经蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定获得阳性克隆子，同时提取质粒送去北京六合华大基因科技股份有限公司测序。将测序正确的质粒和空载体pPICZαA(购自Invitrogen公司)分别用限制性内切酶Xho I和Not I进行双酶切，胶回收试剂盒纯化酶切产物，在T4DNA连接酶的作用下，将纯化的酶切产物进行连接，连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞后，涂布于含有25μg/ml博来霉素(Zeocin，Invitrogen公司)的LLB(酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂粉15g/L)固体培养基上，37℃培养12h，菌落PCR进行验证。挑取阳性单克隆接入含有25μg/ml Zeocin的液体LLB培养基中培养，提取质粒。将重组质粒分别用限制性内切酶Xho I和Not I进行酶切，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物(如图4)，得到条带大小正确的酶切产物，初步证明构建的重组质粒正确，然后将该重组质粒pPICZαA-N-kcINU1送去北京六合华大基因科技股份有限公司测序。结果表明，在pPICZαA的Xho I和Not I酶切位点之间插入了成熟鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶基因且N末端携带有6个组氨酸分离纯化标签，插入方向正确，进一步证明构建的重组质粒正确。

实施例4重组质粒电转化至毕赤酵母X-33

用SacI线性化重组质粒pPICZαA-N-kcINU1，参照GeneJET Gel Extractionand DNA Cleanup Micro Kit(法国Fermentas公司)的操作说明对单酶切产物进行柱式纯化，1％琼脂糖凝胶电泳检测纯化效果，按照Invitrogen公司毕赤酵母操作手册(pPICZαA,B,and C Pichia expression vectors forselection on Zeocin^TM>

实施例5重组菌株的诱导表达与纯化

将阳性克隆单菌落接种至50ml BMGY(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB13.4g/L，10％甘油100ml，4×10^-5％生物素，100.0mM>-5％生物素，100.0mM>

按照GE Healthcare公司提供的纯化方法用Ni-NTA sepharose^TM>

实施例6重组外切菊粉酶活性的测定

重组外切菊粉酶活性测定采用DNS法(3，5-二硝基水杨酸试剂)。

(1)DNS试剂的配制：

甲液—溶解6.9g结晶酚(上海华舜生物工程有限公司，产品编号0946)于15.2mL 10％NaOH中，用蒸馏水稀释至69mL，再加入6.9g NaHSO₃。

乙液—称取255g酒石酸钾钠，加到300mL 10％NaOH中，再加入880mL 1％3，5-二硝基水杨酸溶液。

将甲液与乙液相混合即得黄色DNS试剂，贮于棕色试剂瓶中。在室温下，放置7-10天以后使用。半年内有效。

(2)pH4.6HAc-NaAc缓冲液的配置方法：

①2MNaAc母液：称取272.16g乙酸钠溶于适量蒸馏水中，定容至1000mL。

②2M HAc母液：称取120.10g乙酸溶于适量蒸馏水中，定容至1000mL。

③取24.5mL 2M NaAc溶液和25.5mL 2M HAc溶液混合，定容至1000mL，即得pH 4.6的0.1M HAc-NaAc缓冲液

(3)5％菊粉溶液的配制：

精密称取5.00g菊粉(伊利产品来自大连理工大学)于适量pH4.6HAc-NaAc缓冲液，定容至100mL容量瓶中。

(4)外切菊粉酶活性测定

取适量重组外切菊粉酶，用0.1MHAc-NaAc pH4.6缓冲液稀释(上清稀释100倍、纯化酶稀释1000倍)，取50μL稀释液加入450μl 5％菊粉溶液，混匀，55℃水浴反应10min(精确计时)，立即取出沸水浴灭活5min，从反应液中取出50μl，加入0.3ml DNS试剂和0.35ml水，混匀，沸水浴中反应10min(精确计时)，冷水冷却，定容至5ml，测OD_540nm。对应果糖标准曲线计算得样品反应液中的含糖量A(mg)。

对照设置：重组外切菊粉酶稀释液，沸水浴灭活5min，取50μl加入450μl 5％菊粉溶液，混匀，55℃水浴反应10min(精确计时)，从反应液中取出50μl，加入0.3ml DNS试剂和0.35ml水，混匀，沸水浴中反应10min(精确计时)，冷水冷却，定容至5ml,测OD_540nm。对应果糖标准曲线计算得样品反应液中的含糖量A(mg)作为对照，调零。

酶活单位(U)为每分钟水解产生1微摩尔果糖所需要的酶量。

酶活计算：每毫升发酵上清液中菊粉酶活性为

实施例7重组酵母菌生长曲线分析和表达上清外切菊粉酶活性测定

将每天取样的重组菌液1ml，12000g离心10min收集菌体沉淀，测菌体湿重，上清用来测定外切菊粉酶的活性和蛋白浓度(空载体pPICZαA重组菌的表达上清中蛋白浓度作为对照)，活性测定方法见实施例6，同时将每天收集的菌液稀释后用紫外分光光计在OD_600nm处进行菌体密度的测定。根据结果绘制菌体湿重及菌体密度的生长曲线，如图8，同时绘制重组菌每天表达的上清外切菊粉酶的活性测定图，诱导96h后发酵上清中的粗蛋白含量为0.357mg/ml，重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的活性达2496U/ml，比活为6992U/mg，可经Ni-NTA>TM>

实施例8重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的应用(外切菊粉酶降解菊粉制备果糖浆)

利用实施例5中纯化的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶，对菊粉进行了水解实验。取0.5ml纯化的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶(酶活达19875U/ml)与50ml 10％的菊粉溶液(pH4.6的0.1mol/LHAc-NaAc缓冲液配制)，55℃反应24h，降解率达到95％以上，表明所获得的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶可用于高果糖浆的制备。

实施例9C末端携带6个组氨酸标签序列的重组基因克隆、表达及纯化

通过PCR方法将6个组氨酸标签序列基因直接引入到鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的C端，引物序列为INU1-C-his-F:5’-TCTCTCGAGAAAAGAGATGGTGACAGCAAGGCCAT-3’和INU1-C-his-R:5’-CTCGCGGCCGCTCAAAGGTTAAATTGGGTAACG-3’，其中下划线分别为XhoI、NotI酶切位点，斜线为Kex2蛋白酶切割位点，黑体代表6个组氨酸标签序列。按照实施例2-6相同的方法，将重组基因kcINU1-C-his克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA，将重组质粒经电转化法整合到毕赤酵母宿主菌X-33中，甲醇诱导进行分泌表达，镍柱亲和层析法纯化目的蛋白，DNS法进行外切菊粉酶的活性测定。结果显示，重组外切菊粉酶无法从分泌的上清中纯化出来，C末端的6个组氨酸不能起到分离纯化标签序列的作用，分析原因可能是C末端序列的组氨酸标签被包裹在酶分子内部，无法与Ni-NTA>TM>

通过PCR方法将linker(G4S)-His₆-tag基因引入到鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的C端，引物序列为INU1-linker-C-his-F:5’-TCTCTCGAGAAAAGAGATGGTGACAGCAAGGCCAT-3’和INU1-linker-C-his-R:5’-CTCGCGGCCGCTCAAAGGTTAAATTGGGTAACG-3’，其中下划线分别为XhoI、NotI酶切位点和linker(G4S)基因，斜线为Kex2蛋白酶切割位点，黑体代表6个组氨酸标签序列。按照实施例2-6相同的方法，诱导96h后发酵上清中的粗蛋白含量为0.206mg/ml，C端连接linker(G4S)后携带6个组氨酸标签的重组外切菊粉酶的活性为963U/ml，比活为4685U/mg，表达量仅为N端携带6个组氨酸标签的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶的58％，活性仅剩43％，比活为74％。虽然可以得到纯化的C端连接linker(G4S)后携带6个组氨酸标签的重组外切菊粉酶，但无论从粗蛋白的含量、活性还是比活与N端携带6个组氨酸标签的重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶相比都有较大幅度的下降。分析可能原因，一是C端序列上有潜在的糖基化位点，携带组氨酸标签后封闭了某个潜在的糖基化位点，影响了毕赤酵母X-33对重组蛋白的糖基化修饰，而糖基化修饰可以影响蛋白的分泌表达，并且对维持酶活力具有非常重要的作用，所以C端连接linker(G4S)后携带6个组氨酸标签的重组外切菊粉酶的表达量、活性与比活都比较低；二是C端可能具有促进酶和底物分子结合的作用，携带组氨酸标签影响了酶和底物的结合，使其活性降低。