一种宽叶厚唇兰的种苗试管繁殖方法

摘要

本发明公开了一种宽叶厚唇兰的种苗试管繁殖方法，包括如下步骤：步骤1：采集宽叶厚唇兰发育至成熟而未开裂的果实作为外植体；步骤2：将外植体中的粉末状胚进行无菌萌发获得原球茎，所述的无菌萌发所采用的培养基的组分含量为：0.5～2.0g/L花宝1号、0.2～1.0mg/L NAA、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、50～100ml/L椰子汁，pH为5.4～5.8；步骤3：将原球茎增殖获得类原球茎；步骤4：将类原球茎分化培养得到小苗；步骤5：将小苗培养得到试管苗；步骤6：将试管苗移栽即得种苗。本发明的目的是提供一种宽叶厚唇兰的种苗试管繁殖方法，该方法的优势在于，其能够保持非常高的萌发率高。

说明书

技术领域

本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，尤其涉及一种宽叶厚唇兰的种苗试管繁殖方法。

背景技术

宽叶厚唇兰(Epigeneium amplum(Lindl.)Summerh.)属于兰科厚唇兰属植物，是属内中国产区中植株个体最大的品种，其萼片和花瓣先端急渐尖，唇瓣中裂片近菱形，其上面无褶片，是较易识别的厚唇兰品种。宽叶厚唇兰主要分布于我国云南、西藏和广西等地，生于海拔1000～1900米的林下或溪边岩石上和山地林中树干上。在云南、西藏等少数民族地区，宽叶厚唇兰常被用于治疗支气管炎、脑炎、肺结核、肝炎、痢疾、慢性骨髓炎等疾病。由于宽叶厚唇兰的广泛药理作用，人们对宽叶厚唇兰进行过度采挖，加上其野生环境遭到严重破坏，导致其野生资源锐减，分布范围急剧减少，因此迫切需要对宽叶厚唇兰进行人工繁育。

目前，宽叶厚唇兰种苗主要通过分株方式繁殖，但存在繁殖效率低，成本高，周期长的问题，无法满足宽叶厚唇兰规模化商业种植种苗的需求。另外，宽叶厚唇兰种子由于胚发育不完全，自然状态下极难萌发。

发明内容

本发明的目的是提供一种宽叶厚唇兰的种苗试管繁殖方法，该方法的优势在于，其能够保持非常高的萌发率高。

本发明的技术方案为：一种宽叶厚唇兰的种苗试管繁殖方法，包括如下步骤：

步骤1：采集宽叶厚唇兰发育至成熟而未开裂的果实作为外植体；

步骤2：将外植体中的粉末状胚进行无菌萌发获得原球茎，所述的无菌萌发所采用的培养基的组分含量为：0.5～2.0g/L花宝1号、0.2～1.0mg/L NAA、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、50～100ml/L椰子汁，pH为5.4～5.8；

步骤3：将原球茎增殖获得类原球茎；

步骤4：将类原球茎分化培养得到小苗；

步骤5：将小苗培养得到试管苗；

步骤6：将试管苗移栽即得种苗。

在上述的宽叶厚唇兰的种苗试管繁殖方法中，所述的步骤2中，在外植体中的粉末状胚的获取方法为：将外植体于乙醇中浸泡1～5分钟，无菌水漂洗3～5次后于消毒10～30分钟，无菌水漂洗5～7次切开果实，得到粉末状胚；

更为具体来说，将外植体于75vol％的乙醇中浸泡1～5分钟，无菌水漂洗3～5次后于0.1％升汞溶液中消毒10～30分钟，无菌水漂洗5～7次切开果实，得到粉末状胚。

在上述的宽叶厚唇兰的种苗试管繁殖方法中，所述的步骤2中，粉末状胚在培养基中培养时间为90～120天。

在上述的宽叶厚唇兰的种苗试管繁殖方法中，步骤3中增殖所用到的培养基的组分为：改良Knudson C、0.1～1.0mg/L 6-BA、0.01～0.3mg/L TDZ、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、50～100ml/L椰子汁、0.2～0.5g/L活性炭，pH为5.4～5.8。

需要说明的是改良Knudson C是本领域常用的培养基，具体可以参考《云南植物研究》6(2)，224,1984，文章名称为《植物激素和培养基对天麻种子萌发的影响》，作者段金玉。

在上述的宽叶厚唇兰的种苗试管繁殖方法中，所述的步骤3中的培养时间为30～45天，增殖系数为3～5倍。

在上述的宽叶厚唇兰的种苗试管繁殖方法中，所述的步骤4中，分化所用的培养基的组分为：改良Knudson C、0.1～1.0mg/L NAA、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、50～100ml/L椰子汁、0.2～0.5g/L活性炭，pH为5.4～5.8。

在上述的宽叶厚唇兰的种苗试管繁殖方法中，所述的步骤4中，分化培养所用的时间为40～60天。

在上述的宽叶厚唇兰的种苗试管繁殖方法中，所述的步骤5所用的培养基的组分为：0.1～1.0g/L花宝1号、0.1～1.0g/L花宝2号、0.1～1.0mg/L NAA、15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂、50～100g/L香蕉汁、0.2～0.5g/L活性炭，pH为5.4～5.8。

在上述的宽叶厚唇兰的种苗试管繁殖方法中，所述的步骤5培养所用时间为20～30天。

在上述的宽叶厚唇兰的种苗试管繁殖方法中，所述的步骤6具体为：步骤5得到的试管苗株高为3～5cm，将试管苗转移置于温室的自然光下炼苗5～7天后，洗净根部的培养基后在温室的自然光放置至根系发白，在体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即得种苗。

本发明的有益效果如下：

本发明利用植物组织培养技术进行宽叶厚唇兰的种苗试管繁殖，建立宽叶厚唇兰种苗试管繁殖技术体系，具有种子萌发率高、成苗快、种苗品质好、成本低等特点。

本发明的种子萌发率主要通过对无菌萌发所采用的培养基的组分选择，达到100％的萌发率。

本发明进一步筛选增殖用的培养基，使其增长率可以达到3～5倍。

进一步地，本发明进一步筛选分化所用培养基，使其分化率达到89％以上；

进一步地，本发明通过对小苗培养所用的培养基的优选以及对移栽的混合基质的控制，使其移栽成活率达到93-100％。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

本发明的宽叶厚唇兰的种苗试管繁殖方法，包括以下的工艺步骤：

(1)外植体采集：从野外采集宽叶厚唇兰发育至成熟而未开裂的果实为外植体。

(2)无菌萌发：将步骤(1)所述的果实于75％的乙醇中浸泡1～5分钟，无菌水漂洗3～5次后于0.1％升汞溶液中消毒10～30分钟，无菌水漂洗5～7次切开果实，将其粉末状胚接种到无菌萌发培养基上培养90～120天即可得到原球茎，所述的无菌萌发培养基为：0.5～2.0g/L花宝1号(HYPONeX 1)+0.2～1.0mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂+50～100ml/L椰子汁，pH为5.4～5.8。

(3)原球茎增殖：将步骤(2)所得的原球茎接种到原球茎增殖培养基中培养30～45天即可增殖得到大量的类原球茎，增殖系数为3～5倍，所述的原球茎增殖培养基为：改良Knudson C+0.1～1.0mg/L 6-BA+0.01～0.3mg/L TDZ+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂+50～100ml/L椰子汁+0.2～0.5g/L活性炭，pH为5.4～5.8。

(4)分化培养：将步骤(3)所得的类原球茎接种到原球茎分化培养基中培养40～60天即能分化出小苗，所述的原球茎分化培养基为：改良Knudson C+0.1～1.0mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂+50～100ml/L椰子汁+0.2～0.5g/L活性炭，pH为5.4～5.8。

(5)壮苗培养：将步骤(4)得到的小苗转接到壮苗培养基中培养20～30天即能形成试管苗，所述的壮苗培养基为：0.1～1.0g/L花宝1号(HYPONeX 1)+0.1～1.0g/L花宝2号(HYPONeX 2)+0.1～1.0mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂+50～100g/L香蕉汁+0.2～0.5g/L活性炭，pH为5.4～5.8。

(6)移栽：将步骤(5)所得株高为3～5cm的试管苗转移置于温室的自然光下炼苗5～7天后，洗净根部的培养基后在温室的自然光放置至根系发白，在体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即得种苗。

上述步骤(2)～(5)的培养条件为：培养温度为25～28℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为12～16小时/天。

为了进一步的对本发明的优势进行说明，本发明提供以下实施例进行进一步的论证。

实施例一

(1)外植体采集：从野外采集宽叶厚唇兰发育至成熟而未开裂的果实为外植体。

(2)无菌萌发：将步骤(1)所述的果实于75％的乙醇中浸泡2分钟，无菌水漂洗3次后于0.1％升汞溶液中消毒10分钟，无菌水漂洗5次后切开果实，将其粉末状胚接种到无菌萌发培养基上培养93天即可得到原球茎，污染率为5.9％，种子萌发率100％。所述的无菌萌发培养基为：1.0g/L花宝1号(HYPONeX 1)+0.5mg/L NAA+18g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+55ml/L椰子汁，pH为5.6。

(3)原球茎增殖：将步骤(2)所得的原球茎接种到原球茎增殖培养基中培养30天即可增殖得到大量的类原球茎，增殖系数达到3.5倍，所述的原球茎增殖培养基为：改良Knudson C+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L TDZ+15g/L蔗糖+3.5/L琼脂+80ml/L椰子汁+0.3g/L活性炭，pH为5.6。

(4)分化培养：将步骤(3)所得的类原球茎接种到原球茎分化培养基中培养40天即能分化出小苗，分化率达到93％以上。所述的原球茎分化培养基为：改良Knudson C+0.3mg/L NAA+15g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+50ml/L椰子汁+0.2g/L活性炭，pH为5.6。

(5)壮苗培养：将步骤(4)得到的小苗转接到壮苗培养基中培养20天即能得到株高3cm以上的试管苗，所述的壮苗培养基为：0.5g/L花宝1号(HYPONeX 1)+0.5g/L花宝2号(HYPONeX 2)+0.3mg/L NAA+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+50g/L香蕉汁+0.2g/L活性炭，pH为5.6。

(6)移栽：将步骤(5)所得株高为3～5cm的试管苗转移置于温室的自然光下炼苗5天后，洗净根部的培养基后在温室的自然光放置至根系发白，在体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽2个月后的成活率达96％以上。

上述步骤(2)～(5)的培养条件为：培养温度为25℃，光照强度为1500lx，光照时间为12小时/天。

实施例二

(1)外植体采集：从野外采集宽叶厚唇兰发育至成熟而未开裂的果实为外植体。

(2)无菌萌发：将步骤(1)所述的果实于75％的乙醇中浸泡1分钟，无菌水漂洗3次后于0.1％升汞溶液中消毒10分钟，无菌水漂洗5次切开果实，将其粉末状胚接种到无菌萌发培养基上培养100天即可得到原球茎，污染率为10％，种子萌发率达到95％以上。所述的无菌萌发培养基为：1.5g/L花宝1号(HYPONeX 1)+0.4mg/L NAA+30g/L蔗糖+5.0g/L琼脂+75ml/L椰子汁，pH为5.4。

(3)原球茎增殖：将步骤(2)所得的原球茎接种到原球茎增殖培养基中培养38天即可增殖得到大量的类原球茎，增殖系数达到4.2倍，所述的原球茎增殖培养基为：改良Knudson C+0.7mg/L 6-BA+0.2mg/L TDZ+20g/L蔗糖+5.5g/L琼脂+50ml/L椰子汁+0.15g/L活性炭，pH为5.4。

(4)分化培养：将步骤(3)所得的类原球茎接种到原球茎分化培养基中培养43天即能分化出小苗，分化率达到97％以上，所述的原球茎分化培养基为：改良Knudson C+0.3mg/L NAA+25g/L蔗糖+4.3g/L琼脂+65ml/L椰子汁+0.35g/L活性炭，pH为5.4。

(5)壮苗培养：将步骤(4)得到的小苗转接到壮苗培养基中培养28天即能得到株高4cm以上的宽叶厚唇兰试管苗，所述的壮苗培养基为：0.8g/L花宝1号(HYPONeX 1)+0.4g/L花宝2号(HYPONeX 2)+0.3mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.5g/L琼脂+75g/L香蕉汁+0.3g/L活性炭，pH为5.4。

(6)移栽：将步骤(5)所得株高为3～5cm的试管苗转移置于温室的自然光下炼苗6天后，洗净根部的培养基后在温室的自然光放置至根系发白，在体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽2个月后的成活率达93％以上。

上述步骤(2)～(5)的培养条件为：培养温度为26℃，光照强度为1800lx，光照时间为14小时/天。

实施例三

(1)外植体采集：从野外采集宽叶厚唇兰发育至成熟而未开裂的果实为外植体。

(2)无菌萌发：将步骤(1)所述的果实于75％的乙醇中浸泡5分钟，无菌水漂洗5次后于0.1％升汞溶液中消毒30分钟，无菌水漂洗7次切开果实，将其粉末状胚接种到无菌萌发培养基上培养110天即可得到原球茎，污染率低于3％，种子萌发率达到90％以上。所述的无菌萌发培养基为：2.0g/L花宝1号(HYPONeX 1)+1.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+100ml/L椰子汁，pH为5.8。

(3)原球茎增殖：将步骤(2)所得的原球茎接种到原球茎增殖培养基中培养42天即可增殖得到大量的类原球茎，增殖系数为4.6倍，所述的原球茎增殖培养基为：改良KnudsonC+1.0mg/L 6-BA+0.3mg/L TDZ+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+100ml/L椰子汁+0.5g/L活性炭，pH为5.8。

(4)分化培养：将步骤(3)所得的类原球茎接种到原球茎分化培养基中培养40天即能分化出小苗，分化率达到89％。所述的原球茎分化培养基为：改良Knudson C+1.0mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+100ml/L椰子汁+0.5g/L活性炭，pH为5.8。

(5)壮苗培养：将步骤(4)得到的小苗转接到壮苗培养基中培养25天即能得到株高约5cm的宽叶厚唇兰试管苗，所述的壮苗培养基为：0.1g/L花宝1号(HYPONeX 1)+1.0g/L花宝2号(HYPONeX 2)+1.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+100g/L香蕉汁+0.5g/L活性炭，pH为5.8。

(6)移栽：将步骤(5)所得株高为3～5cm的试管苗转移置于温室的自然光下炼苗7天后，洗净根部的培养基后在温室的自然光放置至根系发白，在体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即得种苗。移栽2个月后的成活率达到100％。

上述步骤(2)～(5)的培养条件为：培养温度为28℃，光照强度为2000lx，光照时间为15小时/天。

以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。