来自红海卤池生物的DNA聚合酶

摘要

用于扩增核酸的DNA聚合酶组合物可以耐受极端条件。

说明书

优先权要求

本申请要求2014年4月11日提交的美国临时申请号61/978,406的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。

序列表

本申请包含已以ASCII格式的电子版提交的序列表并且其全部内容通过引用并入本申请。2015年10月14日创建的所述ASCII副本的文件名为18605.0094PCT_SL.txt，文件大小为53,211字节。

发明领域

本发明涉及DNA聚合酶。

背景

聚合酶链式反应(PCR)是一种用于快速和指数级扩增目标核酸序列的方法。已发现其在基因表征和分子克隆技术中具有多种用途，包括对PCR扩增DNA的直接测序、确定等位基因变体和检测感染性和遗传疾病。已将多种热稳定的DNA聚合酶用于PCR应用；例如从水生栖热菌(Thermus aquaticus，Taq)中分离的TaqDNA聚合酶、来源于激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的pfu聚合酶、从Thermococcus kodakaraensis中分离的KOD聚合酶以及从嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis，Tli)中分离的Vent^TM>

概述

在一个方面，提供了一种用于扩增核酸的DNA聚合酶组合物，所述DNA聚合酶组合物包含分离的DNA聚合酶，所述分离的DNA聚合酶具有与SEQ ID NO:1-4所示的序列具有至少80％同源性的氨基酸残基。可以从卤池嗜热古细菌物种中分离该聚合酶。该聚合酶可以与从嗜热高温球菌中分离的DNA聚合酶具有约40％的序列同源性。

在某些实施方式中，在存在浓度高达300mM的氯离子的条件下该聚合酶保持其最佳DNA聚合酶活性的至少100％。其活性随着氯离子浓度的增加而增加，300mM是最佳浓度。

在某些实施方式中，在存在浓度高达300mM的硫酸根离子的条件下该聚合酶保持其最佳DNA聚合酶活性的至少50％。其活性随着硫酸根离子浓度的增加而增加，100mM是最佳浓度并且在硫酸盐浓度为300mM时活性降至50％。

在某些实施方式中，在存在浓度高达250mM的谷氨酸钾的条件下该聚合酶保持其最佳DNA聚合酶活性的100％。其活性随着谷氨酸钾浓度的增加而增加，250mM是最佳浓度。

在某些实施方式中，在存在浓度高达1mM的Zn²⁺离子的条件下该聚合酶保持其最佳DNA聚合酶活性的至少50％。在Zn²⁺离子浓度为0.5mM时其活性是最佳的并且在1mM时降至50％。

在某些实施方式中，在存在浓度高达100mM的Mg²⁺离子的条件下该聚合酶保持其DNA聚合酶活性的100％。其活性随着Mg²⁺离子浓度的增加而增加，100mM是最佳浓度。

在某些实施方式中，该聚合酶的DNA延伸速率大于每秒450个碱基。

在某些实施方式中，该聚合酶具有每个DNA结合事件循环平均2000个碱基的DNA延伸持续合成能力。

在某些实施方式中，该聚合酶的DNA校正活性是pfu聚合酶活性的至少2倍。

在某些实施方式中，在65℃下加热15分钟后，该聚合酶保持其稳定性的100％。

在某些实施方式中，该聚合酶在室温下具有活性。

在某些实施方式中，在7.5-9.0的pH条件下，该聚合酶保持其DNA聚合酶活性的100％。

在另一个方面，提供了一种用于扩增核酸的方法，所述方法包括将作为模板的DNA、引物、dNTP和DNA聚合酶组合物反应，并且延伸引物以合成DNA引物延伸产物。

在另一个方面，提供了一种用于扩增核酸的方法，其中的聚合酶具有在盐和金属离子浓度较高以及存在不同类型金属离子的条件下延伸DNA的能力，能够利用其改进当前可用的分子生物学、生物化学和生物物理技术。

在另一个方面，提供了一种用于扩增核酸的试剂盒，所述试剂盒含有DNA聚合酶组合物。

在另一个方面，提供了一种载体，所述载体可以包含编码DNA聚合酶的基因。

在另一个方面，提供了一种质粒，所述质粒可以包含编码用于形成DNA聚合酶重组体的基因。

其他方面、实施方式和特征从下文的说明书、附图和权利要求中将是显而易见的。

附图简述

图1A是比较在不同盐浓度下BR3聚合酶和pfu聚合酶活性的图像。在这些实验中使用的盐是NaCl。BR3和pfu的浓度是50nM。图1B是在不同盐浓度下KOD聚合酶活性的图像。在这项实验中使用的盐是KCl和KOD的浓度是50nM。

图2A-2C是比较在存在不同盐的条件下BR3聚合酶和pfu聚合酶活性的图像。在这些实验中使用的盐是：KCl(2A)、NH₄(SO)₄(B)和谷氨酸钾(C)。BR3和pfu的浓度是50nM。

图3A-3C是比较在存在不同金属离子的条件下BR3聚合酶和pfu聚合酶活性的图像。在(A)和(B)中使用的金属离子的浓度是MgCl₂、MnCl₂、CaCl₂、ZnSO₄、LiCl均为1mM。BR3和pfu的浓度是50nM。

图4A是比较在存在不同浓度Mg²⁺的条件下BR3聚合酶和pfu聚合酶活性的图像。BR3和pfu的浓度是50nM。图4B是在存在不同浓度Mg²⁺的条件下KOD聚合酶活性的图像。

图5是比较BR3聚合酶和pfu聚合酶校正活性的图像。图5按照出现的先后顺序分别公开了SEQ ID NO 7-11。

图6是显示用于检测BR3和pfu聚合酶速率和持续合成能力的单分子测定的图像和曲线以及显示BR3和pfu聚合酶合成DNA的速率和持续合成能力的柱状图。

图7是显示BR3聚合酶热稳定性的图像。

图8是显示BR3聚合酶ddNTP掺入效率和对其活性位点进行工程改造以掺入ddNTP的策略的图像。图8按照出现的先后顺序分别公开了SEQ ID NO12和13。

图9表示BR1、BR2、BR3和BR6聚合酶的序列。

图10表示BR3聚合酶开放阅读框架的序列(核苷酸序列如SEQ ID NO:14，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)。

图11表示BR3(SEQ ID NO:3)、KOD(SEQ ID NO:15)、Pfu(SEQ ID NO:16)和Tli(SEQID NO:17)聚合酶的一级序列比对。根据在DNA聚合酶中的共同结构域结构对序列的颜色高亮显示，在催化中的关键氨基酸以加粗的红色和蓝色表示以及与聚合酶结构的热稳定性相关的半胱氨酸残基以加粗的黄色表示。

详细描述

红海的深海缺氧盐水被认为是地球上最偏远、最具挑战性和最极端的环境之一，同时仍是研究最少的区域之一。目前已知约有25个这样的填充有盐水的池，其均是缺氧、高盐度的深海水体，具有升高的温度、重金属浓度，其具有与覆盖的海水形成特征性尖锐的梯度丰富的界面的不同类型的金属离子。参见Backer H&Schoell M(1972)New deeps withbrines and metalliferous sediments in Red Sea.Nature-Physical Science 240(103):153，和Hartmann M,Scholten JC,Stoffers P,&Wehner F(1998)Hydrographicstructure of brine-filled deeps in the Red Sea-new results from the Shaban,Kebrit,Atlantis II,and Discovery Deep.Mar Geol 144(4):311-330，其全部内容均通过引用并入。与频繁的地质和地球化学研究相比，很少有研究关注红海的深海盐水微生物学，并且没有研究关注其在生物技术方面的应用。最初的不依赖于培养和基于培养的研究第一次见识到了此地微生物群落出人意料的巨大生物多样性，研究鉴定了若干新群并分离了在这些环境中繁殖的新的极端微生物。参见Antunes A,Eder W,Fareleira P,SantosH,&Huber R(2003)Salinisphaera shabanensis gen.nov.,sp nov.,a novel,moderatelyhalophilic bacterium from the brine-seawater interface of the Shaban Deep,RedSea.Extremophiles 7(1):29-34，Antunes A等，(2008)A new lineage of halophilic,wall-less,contractile bacteria from a brine-filled deep of the Red Sea.JBacteriol 190(10):3580-3587，Antunes A等，(2008)Halorhabdus tiamatea sp nov.,anon-pigmented,extremely halophilic archaeon from a deep-sea,hypersalineanoxic basin of the Red Sea,and emended description of the genusHalorhabdus.Int J Syst Evol Micr 58:215-220，Eder W,Ludwig W,&Huber R(1999)Novel 16S rRNA gene sequences retrieved from highly saline brine sediments ofKebrit Deep,Red Sea.Arch Microbiol 172(4):213-218，Eder W,Jahnke LL,SchmidtM,&Huber R(2001)Microbial diversity of the brine-seawater interface of theKebrit Deep,Red Sea,studied via 16S rRNA gene sequences and cultivationmethods.Appl Environ Microb 67(7):3077-3085，和Eder W,Schmidt M,Koch M,Garbe-Schonberg D,&Huber R(2002)Prokaryotic phylogenetic diversity andcorresponding geochemical data of the brine-seawater interface of the ShabanDeep,Red Sea.Environ Microbiol4(11):758-763，其全部内容均通过引用并入。由于这种环境的条件极其严苛，因而驻留于此的微生物为了生存非常有可能产生新的代谢途径、跨膜转运系统、酶和化学物质。

这种环境为DNA复制机制以及DNA加工酶复制和保持基因组DNA提供了最严苛的条件，表明其利用了新的适应机制和核酸结合蛋白。可以使用来自卤池的古细菌和细菌物种筛选新的DNA测序聚合酶和其他关键的DNA修饰酶。

用于DNA测序的经典链终止方法Sanger法依赖于使用具有较高链终止子双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)掺入速率的DNA聚合酶。参见Tabor S&Richardson CC(1995)A singleresidue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family iscritical for distinguishing between deoxy-and dideoxyribonucleotides.ProcNatl Acad Sci U S A 92(14):6339-6343，其全部内容均通过引用并入。DNA聚合酶通常催化引物的3’-OH基团亲核攻击引入的dNTP的α-磷酸。在该反应中需要两个Mg²⁺离子以便将引物/模板链和引入的dNTP对齐并且介导取代亲核攻击反应。参见Johnson>3-10⁵个核苷酸有1个错误)并且编码校正核酸外切酶活性以除去错误掺入的核苷酸(使准确度增至每掺入10⁵-10⁷个核苷酸有1个错误)。因此，理想的DNA测序聚合酶将具有较高的DNA合成速率和持续合成能力、较高的dNTP掺入准确度、校正核酸外切酶活性、较高热稳定性和较高ddNTP掺入速率。

实际上所有这些性质已通过将四种DNA聚合酶引入市场实现，它们是分离自古细菌物种的激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶(pfu DNA Pol)、嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)Vent^TM>

表1：DNA聚合酶的特征。该表来自Takagi M等，(1997)Characterization of DNApolymerase from Pyrococcus sp.strain KOD1and its application to PCR.Appliedand Environmental Microbilogy 63(11):4504-4510

本申请公开的是一种以产生市售聚合酶为目的利用来自卤池的DNA聚合酶的方法，该聚合酶利用广泛的盐和金属离子浓度以及金属离子类型具有耐用的反应性质以及增强的速率持续合成能力和校正活性。还公开了一种用于扩增核酸的方法和组合物，其中在高盐和高金属离子浓度、在存在不同类型金属离子条件下和在高温条件下能够利用聚合酶的能力以改进当前可用的分子生物学、生物化学和生物物理技术。没有一种常规聚合酶在诸如高盐浓度、高金属浓度和高温的严苛条件下是理想的，更不用说两种或多种这些条件的组合。本申请公开的是一种不仅仅能耐受这些严苛条件之一，而其还能够耐受多种这些条件的组合的聚合酶，例如高盐和高金属浓度、高金属浓度和高温、高盐浓度和高温或者高盐和高金属浓度和高温。

从卤池中分离的耐用的DNA测序酶能够支持PCR过程中较宽范围的盐和金属离子浓度、不同类型的金属离子和较宽范围的pH。已从卤池中鉴定得到四个DNA聚合酶克隆(图9，表2)。这些来自卤池微生物的聚合酶能够用于在较宽范围的缓冲条件以及金属离子浓度和类型下进行PCR反应。PCR的优化仍是复杂的，因为其可能需要筛选获得较高收率、较高持续合成能力和较高扩增DNA片段准确度的适宜的盐和金属离子浓度。来自卤池的热古细菌物种具有在较高盐浓度下复制其基因组的能力表明其DNA聚合酶以相对较高的亲和性与DNA结合，这或许能够增强PCR的灵敏度，从而耐受宽泛的盐浓度。而且，这些DNA聚合酶耐受较高金属离子浓度的能力表明其能够在较宽范围的金属离子浓度下工作。最后，这些DNA聚合酶耐受不同类型金属离子的能力表明其能够在较宽范围的金属离子类型下工作。对来自卤池嗜热古细菌物种的DNA聚合酶进行了克隆、表达、纯化和鉴定。

表2：对来自卤池的DNA聚合酶的鉴定

特别地，与嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)的DNA依赖性聚合酶具有42％同源性的克隆3(称为BR3，图10)与在PCR和DNA测序中使用的任何已知的市售可用的DNA聚合酶相比具有高得多的耐用性质。

BR3耐受极为通用的缓冲条件。图1A和1B显示了在高达300mM NaCl下BR3聚合酶保持其最佳活性，而pfu和KOD仅在高达10mM下保持其最佳活性。BR3聚合酶还能够耐受不同类型的盐。图2显示了BR3能够耐受高达300mM的KCl(图2A)、高达100mM的(NH₄)₂SO₄(图2B)和高达250mM的谷氨酸钾(图2C)。其范围是pfu聚合酶的至少15-30倍。

图3显示了在存在MgCl₂和MnCl₂且盐浓度较高的条件下与pfu聚合酶相比BR3聚合酶显示出高得多的活性(图3B)。而且，BR3聚合酶显示出较高的金属离子耐受性，例如0.1-100mM>2(图4A和4B)。该范围是pfu聚合酶和KOD聚合酶的10倍。当盐浓度较低时(图3A)，在存在MgCl₂和MnCl₂下pfu聚合酶显示出更高活性。当存在钙或锂离子时，这两种聚合酶均未显示出显著活性。值得注意的是，在高盐浓度下，在存在锌离子下BR3保持其活性(图3B和3C)。BR3聚合酶是首个已知使用锌离子或Mg²⁺和Mn²⁺以外的任意金属离子的聚合酶。

BR3聚合酶的校正活性是pfu聚合酶的至少2倍(图5)。图5显示了在引物链上存在高达3个错配的条件下BR3仅需要pfu聚合酶浓度的一半就能够产生相同活性水平。

图6显示了用于检测BR3的速率和持续合成能力的单一分子测定并将其与pfu聚合酶进行比较和表3显示了这项检测的结果，其中BR3聚合酶的速率和持续合成能力是pfu聚合酶的至少1.5倍。

表3：对BR3聚合酶和pfu聚合酶的速率和持续合成能力的比较

在pH范围在7.5-9.0之间BR3聚合酶保持相同的聚合活性。其还显示了高达65℃的较高的热稳定性(图7)。还可能通过引入在极端嗜热聚合酶的活性位点中形成高度保守的二硫键增加其热稳定性。BR3聚合酶对ddNTP的掺入也有很好的鉴别(图8)。极有可能通过将BR3活性位点中的F残基突变为Y增加ddNTP的掺入效率(图8)。

这些性质使得这种聚合酶能够理想地用于DNA测序和分子生物学技术，其需要最小的反应优化并且可以用于不同样品类型和制备物。

可以使用重组技术生产BR3聚合酶。

如在本申请中使用的，术语“多肽”和“蛋白”可以互换使用，指氨基酸残基的聚合物。术语“重组多肽”指由重组技术生产的多肽，其中通常将编码所表达蛋白的DNA或RNA插入适宜的表达载体中，再使用其转化宿主细胞以产生多肽。

如在本申请中使用的，术语“同源物”和“同源的”指包含与相应的多核苷酸或多肽序列至少约50％一致的序列的多核苷酸或多肽。优选地，同源的多核苷酸或多肽具有与相应的氨基酸序列或多核苷酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源性的核苷酸序列或氨基酸序列。如在本申请中使用的，术语序列“同源性”和序列“一致性”可以互换使用。本领域的普通技术人员熟知确定两个或多个序列之间同源性的方法，例如使用BLAST。

突变体或变体多肽指具有至少一个氨基酸不同于相应野生型多肽的氨基酸序列的多肽。在一些实施方式中，突变体多肽具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或多个氨基酸取代、增加、插入或缺失。例如，突变体可以包含一个或多个保守的氨基酸取代。如在本申请中使用的，“保守的氨基酸取代”是其中的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的一个。在本领域中已定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。

优选的多肽的变体或多肽的片段保留了相应野生型多肽的一些或全部生物功能(例如酶活性)。在一些实施方式中，变体或片段保留了相应野生型多肽至少约75％(例如至少约80％、至少约90％或至少约95％)的生物功能。在其他实施方式中，变体或片段保留了相应野生型多肽约100％的生物功能。在又一个实施方式中，变体或片段具有大于相应野生型多肽100％的生物功能。应理解本申请所述的多肽可以具有附加的保守或非保守氨基酸取代，其对多肽的功能不具有实质性影响。

实施例

酶：使用引物(5’-CACCATGGCAAATCAGACAACAAATGG-3’(SEQ ID NO:5)和5’-TTATTTGAATTTTCCGAGTTTTACTTGTCG-3’(SEQ ID NO:6))通过PCR扩增与BR3对应的cDNA片段(参见图9，SEQ ID NO:3)并克隆至pENTR-D/TOPO载体(Life Technology)。通过使用LRClonase II酶混合物(Life Technology)将BR3的ORF转移至pDEST17载体(LifeTechnology)。在使用质粒pDEST17/BR3转化后BR3在大肠杆菌Rozetta2(DE3)(Novagen)中过表达。通过加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(终浓度1mM)诱导过表达，并且在孵育3h后收集细胞。将所收集的细胞溶解在裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.0、80mM KCl、5mM2-巯基乙醇、1mM EDTA)中并在冰上使用溶菌酶(终浓度1mM)孵育30m，然后通过超声处理破坏。将粗提物离心以除去细胞碎片，收集上清液并使用80％的饱和度进行铵沉淀。将从铵沉淀中获得的球团溶解在缓冲液A(10mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA)中并上样至SephacrylSepharose(GE Healthcare)柱。收集从Sephacryl Sepharose柱的流出组分并进行充分稀释以降低EDTA的浓度，然后上样至HisTrap HP 5ml(GE Healthcare)并使用缓冲液B(10mMTris-HCl pH 8.0、50mM KCl、500mM咪唑)洗脱结合蛋白。收集峰组分并通过HiTrap肝素1ml(GE Healthcare)，并且通过制造针对缓冲液C(10mM Tris-HCl pH 8.0、50mM KCl、1M KCl)的梯度洗脱含有纯蛋白的组分。针对缓冲液D(50mM Tris-HCl pH 7.5、50mM KCl、1mM DTT、0.1％吐温20、50％甘油)透析纯化的BR3蛋白。通过使用280nm处的吸光度和消光系数确定蛋白浓度并根据BR3蛋白的氨基酸序列计算分子量。

引物延伸和校正活性测定：根据已发表的文献(参见Lundberge K.S.等(1991)High-fidelity amplification using a thermostable DNA polymerase isolated fromPyrococcus furiosus(Polymerase chain reaction；mutation archaebacteria)frequency；lack；proofreading；3’40-5 exonuclease；recombinant DNA.Gene(108):1-6)使用下述针对校正测定的修饰对聚合酶和校正活性进行鉴定。将含有内部EcoRI位点的35-mer模板退火为在3’末端具有0、1和3个错配的15-mer Cy3-标记的引物。在45℃下在22μl中进行5min反应并且其中含有碱性缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.8、10mM(NH₄)₂SO₄、50mMKCl、2mM>4、0.1％TritonX-100)、200μM dNTP和1mM>2。从各反应物中移出10μl并通过加入4μl终止溶液(100mM>

在单一分子水平进行引物延伸测定：如此前所述通过实时监测个体DNA分子的长度对DNA合成情况进行检测(参见Tanner,N.A.等(2008)Single-molecule studies offork dynamics in Escherichia coli DNA replication.Nature structural&molecularbiology(15):170-176，Jergic,S.等(2013)A direct proofreader-clamp interactionstabilizes the Pol III replicase in the polymerization mode.The EMBO journal(32):1322-1333和Lee,J.B.等(2006)DNA primase acts as a molecular brake in DNAreplication.Nature(439):621-624，其全部内容均通过引用并入)。简言之，含有生物素化引物的ssDNA模板通过一个末端连接至玻璃盖玻片的表面并通过另一个末端连接至微流体流动池中的磁珠(图6)。利用层流在小珠上施加2.6皮牛(pN)的拖拽力以拉伸DNA分子。如图6所示意的并且如图6中的轨迹所示，引物延伸将表面上栓系的ssDNA(较短)转化为dsDNA(较长)并增加DNA的长度。测定在25℃下在含有(20mM Tris-HCl pH 8.8、10mM(NH₄)₂SO₄、2mM>4、0.1％TritonX-100)、200μM dNTP、1mM>2以及在BR3聚合酶的情况下250mMKCl或在pfu的情况下50mM>

其他实施方式在下述权利要求的范围内。