一种两亲性聚合物以及由其形成的磁性胶束纳米载体和其用途

摘要

本发明提供了一种两亲性聚合物，其结构如式(Ι)所示。本发明还提供了由所述两亲性聚合物形成的磁性胶束纳米载体及其用途。本发明的聚合物具有两亲性，包含二硫键，使得聚合物还具备有还原敏感特性，而且制备方法简便、反应条件温和。本发明的聚合物用于制备磁性胶束纳米载体，可负载药物传输，可以对肿瘤细胞内还原环境发生响应，使得该纳米载体的肿瘤靶向性能更优。

说明书

技术领域

本发明涉及一种功能纳米材料领域，具体涉及一种两亲性聚合物、以及由其形成的磁性胶束纳米载体和其用途。

背景技术

纳米材料药物载体传递体系中，靶向肿瘤作用是非常关键的，它可以将载药后的载体靶向输送到特定部位实现药物控制释放，提高药物载体的靶向聚集能力，从而达到提高该药物生物利用率、减少对正常组织杀伤等毒副作用的目的。目前，常用的纳米药物载体靶向修饰主要有两类：一类是连接靶向配体的生物靶向修饰，利用相应配体对肿瘤细胞的特异性识别功能将载药纳米材料胶束在肿瘤位点累积，并释放药物。因这类靶向的纳米载体可以靶向特异性识别肿瘤细胞，针对肿瘤的微环境进行靶向，所以被称作是主动靶向。另一类是通过使用物理方法辅助进行靶向作用的物理靶向。它主要包括肿瘤的切除手术、射频消融、微波凝固、氩氦刀、放射疗法以及化疗药物磁性靶向修饰等。化疗药物磁性靶向修饰是将磁性纳米颗粒(SPIO)和抗癌药物同时装载，利用外加磁场的引导将载药纳米胶束牵引到肿瘤组织。

磁性纳米材料载药系统作为一种新型靶向给药方式，近些年来研究者们对其探索比较广泛，载体体系中磁性纳米颗粒除了可以辅助药物载体在外加磁场引导作用下将药物靶向传递到特定肿瘤组织并释放药物达到化疗的目的外，还可以在外加交变磁场作用下产生磁致热效应达到对肿瘤组织施加热疗作用，并且由于含有铁磁性物质，使得其本身可以用作成像系统的造影剂，实现对靶向位点的组织核磁共振成像(NMR-imaging)，从而将肿瘤的诊断、治疗、监察结合起来。超顺磁性铁氧化物纳米颗粒(SPION)因其特有的小粒径尺度、生物安全性以及较好的超顺磁性等诸多优点成为当前科学家研究磁性纳米载药系统的热门磁性材料之一。

发明内容

为克服现有技术存在的技术缺陷，本发明的一个目的是提供一种两亲性聚合物。

本发明的另一目的是提供一种磁性胶束纳米载体及其用途。

本发明提供的两亲性聚合物，其由聚乙二醇单丙烯酸酯、胱胺双丙烯酰胺(cystamine bisacrylamide，CBA)或双硫二醇双丙烯酸酯(DTDA)、以及十二烷胺反应制得。

优选地，本发明的两亲性聚合物由聚乙二醇单丙烯酸酯、双硫二醇双丙烯酸酯以及十二烷胺反应制得，其结构如式(Ι)所示：

其中，m表示2～20的整数，n表示45～450的整数。

其中，所述两亲性聚合物的数均分子量为5～30kDa。

其中，所述反应在DMSO中于60～100℃下进行，反应结束后使用乙醚沉淀即得所述聚合物。

本发明提供的磁性胶束纳米载体由以上技术方案任一项所述的两亲性聚合物包覆改性或未改性的超顺磁性铁氧化物纳米颗粒形成。

其中，所述改性的超顺磁性铁氧化物纳米颗粒为包覆有油酸的超顺磁性铁氧化物纳米颗粒。

其中，所述超顺磁性铁氧化物纳米颗粒为超顺磁性四氧化三铁(Fe₃O₄)纳米颗粒。

本发明还提供了所述磁性胶束纳米载体作为药物载体的用途。

其中，所述药物为抗肿瘤药物。

优选地，所述抗肿瘤药物为疏水性抗肿瘤药物。包括但不限于阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、姜黄素、喜树碱、羟基喜树碱等。

更优选地，所述抗肿瘤药物为阿霉素。

本发明的聚合物具有两亲性，包含二硫键，使得聚合物还具备有还原敏感特性，而且制备方法简便、反应条件温和。

本发明的聚合物用于制备磁性胶束纳米载体，可负载药物传输，可以对肿瘤细胞内还原环境发生响应，使得该纳米载体的肿瘤靶向性能更优。

附图说明

图1为实施例制备的MPEG-rPAE的核磁图谱；

图2A、2B分别为油酸包覆的超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒、实施例制备的rMM的透射电镜(TEM)照片；

图3为实施例制备的rMM的粒径分布图；

图4为实施例制备的rMM的动态光散射图；

图5为实施例制备的rMM的MRI横截面图像以及T2加权像；

图6为实施例制备的rMM的磁滞回线测试；

图7A、7B、8A、8B、9A、9B分别为测试例5不同条件下的共聚焦激光扫描显微镜图像。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行详细说明，以使本发明的特征和优点更清楚。但应该指出，实施例用于理解本发明的构思，本发明的范围并不仅仅局限于本文中所列出的实施例。

如没有特别说明，实施例所使用的原料均为市售产品、所使用的操作均为本领域的常规操作。

实施例

1、双硫二醇双丙烯酸酯(2,2’-Dithiodiethanol Diacrylate，DTDA)的制备

双硫基二乙二醇(2,2’-Dithiodiethanol)(7.7克，50毫摩尔)和三乙胺(Triethylamine，TEA)(18.75毫升，150毫摩尔)溶解于200毫升的无水四氢呋喃(THF)中，并置于500毫升圆底烧瓶。将圆底烧瓶放置于冰浴中，缓慢滴加丙烯酰氯(27.15克，300毫摩尔)的50毫升无水四氢呋喃溶液，逐滴加入超过2小时。滴加完毕后，该反应在室温下继续反应过夜。反应完毕后，过滤去除三乙胺的盐酸盐颗粒固体沉渣，溶液使用旋转蒸发方法纯化。将得到的产物溶解于二氯甲烷(dichloromethane)中，并用碳酸钠水溶液洗5次以上，用无水硫酸镁除水干燥。过滤，旋转蒸发至溶剂挥发完毕的干燥状态得到棕色粘稠液体。

2、MPEG-rPAE的制备

将MPEG(5000)-丙烯酸酯(0.1mmol)、DTDA(1mmol)、十二烷胺(DD,1mmol)添加到双颈瓶中，加入10ml DMSO溶解。在80℃氩气保护下下混合搅拌5天。混合物冷却，使用大量过剩的乙醚沉淀2次，转移到提前称重的样品瓶内，使用油泵抽气装置连接干燥器，持续抽真空状态10小时使样品真空干燥，得到干燥的聚合物。其核磁图谱如图1所示。GPC测定(THF,1.0mL/min,30℃,polystyrene standards)Mn＝9.2kDa,PDI＝2.1。反应式如下：

3、油酸包覆的超顺磁性铁氧化物纳米颗粒(Superparamagnetic iron oxide nanoparticles coated with Olic Acid，OA@SPIONs)的制备、筛选及纯化

将试剂级FeCl₃(0.08摩尔)及FeCl₂(0.04摩尔)用50毫升蒸馏水溶解配制成混合溶液置于三口球形烧瓶中。之后在铁架台上构建好反应装置：三口烧瓶中垂直口深入强力搅拌转头，旁边口分别用作试剂添加口和保护气体通入口。保护气体选择高纯度氩气(99.999％)，保护气流于反应前10min持续稳速通入，于液面形成惰性气体保护层避免后续加热过程中的氧化。

剧烈搅动至液面波动趋于稳定，同时将50毫升氢氧化铵(25％)溶液滴加到上述混合溶液，生成磁铁矿泥浆沉淀。于温控搅拌器上，甲基硅油介导加热该混合物，加热到95摄氏度，后续补充加入55毫升的10％油酸/煤油。在这个过程中，磁铁矿纳米晶体被涂上一层亲水性油酸铵分子，并且油酸铵在温度升至78摄氏度时开始分解并释放出大量气体。在连续加热的环境下，氨气的蒸发改变磁铁矿纳米晶体涂层与疏水性油酸的排列关系，从而在铁磁纳米粒子表面形成疏水性油酸包裹层。

静置之后，不同液相之间出现分离，上部的有机液相中，油酸包覆的磁铁矿纳米晶体稳定分散，有别于底部的水相。使用吸管吸取大部分的水相弃去，加热直到残留的水相完全消失。降温至常温后，将装置恢复至搅拌状态，加入100毫升的丙酮使得该油酸包覆的磁铁矿纳米晶体产生絮凝，永久磁铁(1.4特斯拉)用于收集这磁絮凝，上清液弃去。得到这种絮凝然后用80毫升的丙酮清洗，消除未能参与反应的油酸，设定800G转速进行离心。在此减压条件(50毫米汞柱)下，丙酮从产生的沉淀物中除去，沉淀物静置等待丙酮挥发完全。准确称量20毫克干燥磁铁矿纳米晶体溶于10毫升三氯甲烷中，得到分散性良好的铁磁溶液，成分是用油酸包覆的超顺磁性铁氧化物纳米颗粒，以备接下来的表征和后续修饰等一系列实验。

4、还原响应性磁性纳米胶束的制备

定量用油酸包覆的超顺磁性铁氧化物纳米颗粒(OA@SPIONs)(1毫克)和MPEG-rPAE(10毫克)溶解于氯仿溶液(终体积1毫升)中。然后，将上述溶解好的有机溶液强有力地探入式超声，与此同时，将10毫升蒸馏水逐滴滴加到上述有机相中，由此产生的胶体性混合物，强力搅拌24h使原有机溶剂氯仿充分挥发。之后，离心该胶质与水相分离得纳米胶束(rMM)。

5、rMM载阿霉素(DOX-rMM)的制备

将阿霉素(1mg)溶解在1毫升氯仿溶液搅拌，加入1.5当量的三乙胺，加入OA@SPIONs(1毫克)和MPEG-rPAE(10毫克)溶解于氯仿溶液，共同搅动60分钟。10毫升蒸馏水在剧烈搅拌下逐滴补充进上述反应体系。为了分散载药DOX以后的聚合物胶束，采用透析24h(截留分子量＝7000)去除没有包进纳米材料的自由阿霉素小分子和其他副产物。期间换水3次以保证透析的效果。

6、Rh-MPEG-rPAE的制备

将MPEG(5000)-丙烯酸酯(0.1mmol)、DTDA(1mmol)、十二烷胺(DD,1mmol)添加到双颈瓶中，加入10ml DMSO溶解。在80℃氩气保护下下混合搅拌5天。后加入1mmol的乙二胺用来将反应掉末端剩余的丙烯酸酯键，得到末端伯氨基的聚酯胺。使用大量过剩的乙醚沉淀2次，得到干燥的聚合物。将过量的Rhodamine-ITC与上述的伯氨基封端的MPEG-rPAE进行反应，得到Rh-MPEG-rPAE。

反应式如下：

7、Rh-rMM的制备

将MPEG-rPAE替换为Rh-MPEG-rPAE，其余同前。

8、Rh-rMM载阿霉素的制备

将rMM替换为Rh-rMM，其余同前。

测试例1

透射电子显微镜(TEM)观测

制样过程：将制备的油酸包裹的超顺磁性铁氧化物纳米颗粒(OA@SPION)溶液、rMM溶液滴于透射电镜专用超薄铜网上，用滤纸从边缘轻轻吸去多余的液体，洁净空间内静置等待自然晾干，必要时滴加磷钨酸(phosphotungstic acid)负染，检测其形态与大小。

如图2A所示，超顺磁性铁氧化物纳米颗粒呈现出了比较好的球形表面。如图2B所示，rMM显示为团簇的纳米颗粒和形成的核壳结构的纳米组装体。

测试例2

粒径分析仪检测rMM的粒径大小

使用马尔文激光粒径分析仪(马尔文公司Zetasizer Nano-S)检测粒径大小及分布，如图3所示，粒径分布比较均匀，多集中在100nm左右。

向rMM中加入10mM二硫苏糖醇(Dithiothreitol，简称为DTT)后，经过预定时间后，采用动态光散射技术对纳米胶束的尺寸变化过程进行检测。如图4所示，图中可以看出纳米颗粒的尺寸在加入DTT后出现明显变化，并且这种变化的程度随着时间增加而增强，呈现出纳米rMM离解后产生的小尺寸的颗粒以及大尺寸的聚集体。因此，说明该纳米颗粒显示出了还原环境敏感的特性。

测试例3

通过低场核磁共振技术获得造影剂的弛豫率及体外T2加权成像

配制rMM纳米颗粒(1mg/mL)的水溶液，测试样品分别为原液稀释的8、16、32、64、128倍。使用MesoMR23-060H-I中尺寸核磁共振分析与成像系统(上海纽迈电子科技有限公司)，共振频率为23.315MHz,磁体强度为0.55T，线圈直径为60mm，磁体温度为32℃。

rMM纳米颗粒测试样品超声10分钟后放入仪器中检测，采集样品MRI横截面图像，完成T2加权像。如图5所示，说明：1、造影剂T2弛豫效率与浓度呈现线性关系：造影剂弛豫率与浓度之间的线性度R2＝0.9982。2、T2加权体外成像抑制了长弛豫的信号，突出短弛豫的信号，成像规律明显。表明制得的rMM纳米颗粒中包含有超顺磁Fe₃O₄纳米颗粒。

测试例4

rMM纳米颗粒的磁性性质是在室温(300K)下测定磁滞曲线来评估的，由高精度振动样品磁强计记录。典型操作过程为：称取10mg干燥磁性纳米粒子，加入高精度振动样品磁强计记录磁滞回线。

如图6所示，磁性纳米载药载体的磁滞曲线显示其仍具有Fe₃O₄纳米粒子的超顺磁性行为，具有超顺磁性的纳米粒子可以在外界磁场的引导下将载体系统靶向传递到特定部位，且图中可以显示在室温下载体的磁滞曲线表现为零剩余磁化强度和零矫顽力，此时载体的饱和磁化强度(Ms)约为7.50emu/g，与裸露的Fe₃O₄纳米粒子磁化饱和程度相比(裸露的Fe₃O₄纳米粒子的饱和磁化强度为58.6emu/g)，它的磁化饱和程度要小一些，分析原因为可能是Fe₃O₄纳米粒子处于胶束的疏水性内核，外层由于共聚物胶束的包覆，使得其磁性饱和度减小，但其满足生物医学上对其磁性应用的要求。

测试例5

共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy，CLSM)检测阿霉素在细胞内的分布

长势良好的人乳腺癌细胞(MCF-7)加入单体阿霉素、DOX-rMM，以15分钟、2小时为时间梯度进行细胞孵育。

首先，盖玻片进行消毒灭菌，酒精浸泡，置入规格相适应的六孔板或培养皿内。MCF-7细胞接种在培养皿内的盖玻片上，细胞密度为2×10⁵个/孔(直径＝10厘米)，培养24小时，然后将细胞暴露于单体阿霉素与DOX-rMM下。

预定的孵化时间(分别为15分钟、2小时)后，盖玻片用预热的PBS洗涤三次，然后用4％的多聚甲醛室温固定15分钟。

固定后，细胞用含0.1％Triton x–100的PBS固化处理10分钟，然后用PBS冲洗三次。

细胞用10nM的鬼笔环肽(phalloidine)/1％(w/v)BSA溶液处理20分钟，然后用PBS冲洗三次。然后细胞覆盖10μM的DAPI染液20分钟，用PBS冲洗三次。

自然风干后进行封片：在载玻片适当位置滴加10μl抗淬灭的封片剂，将盖玻片有细胞的一面封进封片剂内，轻轻盖到载玻片上，使封片剂充分浸润载玻片和盖玻片之间的缝隙，用镊子轻轻压实盖玻片，可存放于4℃长期保存。在共聚焦激光扫描显微镜下检查样品形貌。

为了观察纳米颗粒与细胞中各亚细胞器(内涵体、线粒体)的共定位情况，将MCF-7细胞种在培养皿内的盖玻片上，细胞密度为2×10⁵个/孔(直径＝10厘米)，培养24小时，然后将细胞暴露于Rh-rMM的纳米颗粒下。预定的孵化时间(分别为15分钟，2小时)后，将培养基更换成不含有血清的DMEM预热培养基。为了防止内涵体向溶酶体的转变，在加入纳米颗粒之前，加入50×10^-9M的巴弗洛霉素A1进行处理30分钟。而后加入50×10^-9M>

图7A、图7B展示的是Rh-rMM纳米颗粒与细胞共培养15分钟和2小时后，Rh-rMM纳米颗粒与细胞内部亚细胞器-内涵体的共定位情况。如图所示，可见随着细胞孵育时间的增加，通过内涵体进入细胞质的Rh-rMM纳米颗粒逐渐增多，与内涵体的共定位数目上也明显增加。

说明：1、rMM纳米颗粒可经由胞吞的形式进入细胞。2、能够有效地突破内涵体的生理屏障，进入细胞质，这与组成纳米颗粒的聚合物的阳离子特性有着直接的关系，该聚合物结构中的胺基基团在内涵体的酸性条件作用下，快速质子化，产生质子海绵效应，突破内涵体。3、在细胞质内高效率的聚集而不被排出，为药物的细胞内靶向药物输送提供了重要条件。

图8A、图8B展示的是DOX-rMM纳米颗粒与细胞共培养15分钟和2小时后，DOX-rMM纳米颗粒与细胞内部亚细胞器-线粒体的共定位情况。如图8A及8B所示，可见随着细胞孵育时间的增加，在细胞质中的DOX-rMM纳米颗粒明显增加，但是很少与线粒体发生共定位。

图9A、图9B展示的是DOX-rMM纳米颗粒与细胞共培养15分钟和2小时后，DOX-rMM纳米颗粒在细胞内释放阿霉素的情况以及阿霉素的细胞内分布。如图9A及9B所示，细胞内红色的DOX的荧光强度随着时间的增加而增强，而且随着时间增加，在细胞核中的红色荧光显著增加，说明DOX进入了细胞核中。

说明：1、组成纳米颗粒的聚合物的降解行为，尤其是针对肿瘤细胞内部高的还原环境的降解行为，能够提供有效的药物缓释。2、经由纳米颗粒输送的阿霉素在细胞内高浓度存在，并且能够有效到达作用靶点。3、避免了耐药性的产生。

除非特别限定，本发明所用术语均为本领域技术人员通常理解的含义。

本发明所描述的实施方式仅出于示例性目的，并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进，因而，本发明不限于上述实施方式，而仅由权利要求限定。