基于PDMAEMA两亲性聚合物的基因/药物纳米载体结构设计与体外评价

摘要

高分子丰富的结构和纳米粒自组装方法的多样性，为功能性基因/药物递送载体的设计提供了很大的空间。本课题着眼于递送系统的安全性和高效性两个重要性能，以聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯为基础，采用功能修饰、多元组装等手段，实现载体生物相容性和转染效率或药物疗效的同步提高。
　　首先，为了在提高转染效率的同时依旧保持良好生物相容性，本文合成了磺胺嘧啶修饰的两亲性阳离子聚合物：聚己内酯-接枝-聚(甲基丙烯酸二甲氨基乙酯-共聚-磺胺嘧啶)聚合物(PCL-g-P(DMAEMA-co-SDZ)，PC-SDZ)，且PC-SDZ能够在水中自组装成阳离子型聚合物纳米粒。研究了磺胺嘧啶功能化修饰对阳离子型聚合物自身亲疏水性的影响，对PC-SDZ纳米粒的粒径、电位和质子缓冲能力的影响，体外评价了PC-SDZ NPs/DNA纳米复合物的转染效率、细胞摄取、细胞内分布及细胞毒性。结果表明，磺胺嘧啶修饰后的短链阳离子载体具有更低的表面电荷，因而细胞毒性相对较低；具有更致密的壳层结构、更强的质子缓冲能力、增强的疏水性，最终导致了PC-SDZ NPs/DNA复合物更好的转染效率。
　　课题组前期研究工作表明PCL-g-PDMAEMA纳米粒具有较高的核酸递送功效，但对抗肿瘤化药的负载能力低，为了提高递送系统基因/药物共负载功能性。本文通过腙键把阿霉素(DOX)键合在PDMAEMA侧链上，制备了PCL-g-P(DMA EMA-co-HEMA)-hyd-DOX(PCD)及其纳米粒，组装成PCD NPs/DNA纳米粒，并把聚阴子透明质酸-接枝-聚乙二醇(HA-g-mPEG，HgP)组装到PCD NPs/DNA二元复合物表面，自组装形成NPs/DNA/HgP三元纳米复合物。本文研究采用马尔文激光粒度仪、透射电镜等设备表征纳米粒的粒径、电位和表面形貌，采用CCK8法、绿色荧光蛋白表达等手段评价复合物的生物相容性和转染效率，采用激光共聚焦技术、流式细胞技术、蛋白印迹等技术评价了载体在细胞水平上的共递送过程和效果。结果表明，相对于PCNPs/DNA二元复合物，PC NPs/DNA/HgP三元复合物显示了更好的生物相容性；腙键键接聚合物的方式既提高了DOX负载量，又能有效提高阿霉素在肿瘤细胞微环境中的释放速率；此外，相比DNA或阿霉素的单独负载形式，DNA和阿霉素共负载能有效提高抑制肿瘤细胞效果。

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第一章 前言

第二章 文献综述

2.1 核酸递送简介

2.2 核酸递送中普遍的途径与障碍

2.2.1 核酸递送载体的设计

2.2.2 基因体内递送障碍

2.2.3 基因细胞内递送障碍

2.3 载体的类型

2.3.1 脂质体

2.3.2 聚合物

2.3.3 无机物

2.4 本课题研究目的及内容

第三章 磺胺嘧啶修饰聚阳离子纳米粒用于核酸载体

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 实验原料

3.2.2 基础反应物的制备及化学试剂的精制

3.2.3 PC和PC-SDZ的合成及表征

3.2.4 纳米粒(NPs)及纳米粒/DNA复合物的制备

3.2.5 纳米粒的粒径、zeta电位、表面形貌表征

3.2.6 材料接触角表征（WCA）

3.2.7 琼脂糖凝胶电泳阻滞分析

3.2.8 NPs/DNA复合物转染效率评价

3.2.9 NPs/DNA复合物的细胞内吞及其细胞内分布

3.2.10 NPs/DNA复合物的细胞毒性评价

3.3 结果与讨论

3.3.1 PC-SDZ的合成及表征

3.3.2 NPs的结构形态表征

3.3.3 纳米粒的质子缓冲能力与相转变行为

3.3.4 聚合物的疏水性

3.3.5 聚阳离子/DNA复合能力及稳定性

3.3.6 体外转染效果评价

3.3.7 NPs/DNA复合物的细胞内吞与细胞内分布

3.3.8 NPs/DNA复合物的细胞毒性

3.4结论

第四章 聚阳离子前药/核酸/聚乙二醇修饰透明质酸多元组装纳米递送系统

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 实验原料

4.2.2 基础反应物的制备及化学试剂的精制

4.2.3 聚合物PC、PCD和HgP的制备

4.2.4 聚合物结构表征

4.2.5 纳米粒及三元复合物的制备

4.2.6 纳米粒的粒径电位及表面形貌表征

4.2.7 NPs/HgP二元复合物物理化学性质表征

4.2.8 药物体外释放实验

4.2.9 凝胶电泳实验

4.2.10 细胞毒性评价

4.2.11 体外转染试验

4.2.12 共递送过程评价实验

4.2.13 协同效果评价实验

4.3 结果与讨论

4.3.1 PC-hyd-DOX (PCD)和HgP的合成与表征

4.3.2 聚阳离子纳米粒及多元复合物的物理化学性质表征

4.3.3 药物体外释放实验

4.3.4 二元复合物与三元复合物对DNA的负载能力

4.3.5 二元复合物与三元复合物的细胞毒性

4.4.6 聚阴离子对细胞毒性与转染效果的综合影响

4.4.7 三元复合在肿瘤细胞的转染效率评价

4.4.8 三元复合物的基因/药物共递送过程效果体外评价

4.4.9 药物/基因在细胞水平上的协同效果评价

4.4 结论

第五章 全文结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢