原位实时监测植物中果糖含量的微电极生物传感器及其应用

摘要

本发明涉及微电极生物传感技术，具体公开了一种原位实时监测植物中果糖含量的微电极生物传感器。本发明在工作电极上通过滴涂方法组装巯基乙酸，然后吸附离子液体[Bmim]PF

说明书

技术领域

本发明涉及微电极生物传感技术，具体地说，涉及一种原位实时监测植物果糖含量的微电极生物传感器及其应用。

背景技术

植物通过叶片进行光合作用形成碳水化合物供给植株的生长发育需要，糖类是光合作用的主要终产物，研究表明，蔗糖、葡萄糖、果糖是植物体内的主要糖类，这些糖类的合成、运输、积累与作物的产量和品质密切相关，并参与植物细胞渗透压的调节及逆境时的信号传导等。如温暖季节设施栽培的番茄常出现30～35℃亚高温现象，如长期处于这种温度下，植株叶片的光合作用下降，光合产物形成减少，糖类物质的代谢改变，最终导致果实品质下降、产量降低。因此检测植物中的糖类物质的含量具有重要意义。

目前植物中糖类物质的含量多通过气相色谱法、液相色谱法、比色法、近红外光谱法等。这些方法多为离体、静态的方式，需要离体取样，对植物体造成较大的破坏；并且这种方式只能反映某一时间点的静态浓度或累积效应，不能反映植物体内各代谢物质在环境变化时的实时动态变化。

随着研究的深入，人们希望获得植物中这些重要糖类物质的实时动态变化，以便更加全面、清晰的了解植物的生理活动规律，从而更好的指导农业生产，因而有必要发展新型的检测方法，实现对植物中糖类物质的原位实时监测。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种原位实时监测植物中果糖含量的微电极生物传感器及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种原位实时监测植物中果糖含量的微电极生物传感器，具有三电极体系，包括Ag/AgCl的参比电极，铂对电极，金工作电极，所述金工作电极上吸附有果糖脱氢酶。

进一步地，所述金工作电极上依次吸附有巯基乙酸，离子液体[Bmim]PF₆，果糖脱氢酶与铁氰化钾媒介体小分子的混合物，离子液体[Bmim]PF₆，果糖脱氢酶与铁氰化钾的混合物。

本发明所述金工作电极通过以下方法制备得到：

(1)在金工作电极上滴涂巯基乙酸TGA，得到TGA/Au电极；

(2)将离子液体[Bmim]PF₆滴涂到TGA/Au电极上,

(3)逐步滴涂果糖脱氢酶FDH和铁氰化钾的混合PBS溶液，室温放置，固定果糖脱氢酶，制得单层酶电极FDH/[Bmim]PF₆/TGA/Au；

(4)再在FDH/[Bmim]PF₆/TGA/Au电极上滴涂[Bmim]PF₆，再逐步滴涂FDH和铁氰化钾的混合PBS溶液，制得双层酶电极(FDH/[Bmim]PF₆)₂/TGA/Au。

在步骤(1)之前，将微电极置于0.5M稀硫酸溶液中进行循环伏安扫描(-0.2～1.6V)得到典型的循环伏安谱图，确保电极表面清洁。

进而，步骤(1)的巯基乙酸TGA浓度为1-5mM。

步骤(3)的果糖脱氢酶FDH浓度为10-50mg/mL，铁氰化钾浓度为1-10mM，所述混合PBS溶液pH7.4,室温放置1-4h固定果糖脱氢酶。

本发明的微电极生物传感器其微电极是通过微机电技术(MEMS)在硅片基底上制备而成，长约4-5cm，其中裸露导电部分长约10-20mm。本发明的微电极生物传感器的外观具有穿透植物组织的能力，见图1，裸露导电部分长度为10-20mm。

本发明提供了上述微电极生物传感器在原位实时监测植物果糖含量中的应用。

所述植物为作物、花卉、蔬菜或林木。

优选地，检测部位为植物的茎、叶、果实或嫩芽。

本发明提供了一种原位实时监测植物果糖含量的方法，包括：

(1)将上述的微电极生物传感器连接至电化学工作站，与不同浓度的果糖标准溶液反应，在工作电压下通过计时电流法进行连续检测，由浓度与电流关系获得稳定的监测果糖的工作曲线；

(2)将上述的微电极生物传感器插入待测植物组织，连接电化学工作站，获取电流变化，导入工作曲线，计算被测样本内果糖的浓度。

在本发明的实施例中，上述方法的步骤(1)，具体为分别配制浓度为0.1、0.5、1、5、10、50、100mM果糖的PBS(pH＝7.4)溶液，选择0.25V作为工作电位，使用制备的酶电极进行计时电流法检测，得到一组浓度与电流的关系曲线，制作果糖的标准曲线y＝0.24x+0.04958(r＝0.9826)。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种基于微型生物传感技术的植物体内果糖含量的原位实时监测方法，从而更全面、深入地了解植物体内果糖的调节规律及作用机制。本发明在工作电极通过滴涂方法组装巯基乙酸，然后吸附离子液体[Bmim]PF6，进一步修饰果糖脱氢酶与铁氰化钾媒介体小分子的混合物，之后重复这一过程，实现离子液体与果糖脱氢酶的多层修饰工作电极，果糖脱氢酶可以催化D-果糖生成5-keto-D-果糖，通过计时电流法记录酶对果糖变化的实时响应。应用本发明的微电极生物传感器可实现原位实时监测植物中果糖含量，对被测样本不造成本质伤害；得到的数据结果可实时动态的反映植物体内果糖的含量变化，实际应用操作简便，易于掌握。

附图说明

图1为本发明所述微电极生物传感器三电极体系外观结构图以及金工作电极的制备与检测果糖的示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1工作电极的制备

(1)微电极阵列通过微机电加工技术(MEMS)制备，在硅片基底上制备而成，长约4-5cm，包括Ag/AgCl的参比电极，铂对电极及金工作电极，其中裸露导电部分长约10-20mm；将微电极置于0.5M稀硫酸溶液中进行循环伏安扫描(-0.2～1.6V)得到典型的循环伏安谱图，确保电极表面清洁。

(2)在金工作电极上滴涂1mM巯基乙酸(TGA)，得到TGA/Au电极。

(3)然后将离子液体[Bmim]PF₆滴涂到TGA/Au电极上,再逐步滴涂40mg/mL果糖脱氢酶(FDH)和1mM铁氰化钾媒介体的PBS溶液(pH7.4),室温放置2h，固定果糖脱氢酶，制得单层酶电极FDH/[Bmim]PF₆/TGA/Au。

(4)再次在FDH/[Bmim]PF₆/TGA/Au电极上滴涂[Bmim]PF₆,再逐步滴涂FDH和铁氰化钾的混合溶液(PBS,pH7.4),制得双层酶电极(FDH/[Bmim]PF₆)₂/TGA/Au。

实施例2微电极生物传感器的应用

(1)分别配制浓度为0.1、0.5、1、5、10、50、100mM果糖的PBS(pH＝7.4)溶液，选择0.25V作为工作电位，使用含有实施例1制备的酶电极的生物传感器进行计时电流法检测，得到一组浓度与电流的关系曲线，制作果糖的标准曲线y＝0.24x+0.04958(r＝0.9826)，线性范围为0.1-100mM。

(2)实验材料选择盆栽甜玉米，以乳熟期甜玉米果实为检测对象，将微电极随机插入甜玉米的玉米粒中，连接电化学工作站，通过计时电流法，在0.25V的工作电压下记录3天内乳熟期甜玉米中果糖浓度的实时变化。

(3)实验结果对比选择乳熟期两个不同品种普甜E22和T26的甜玉米籽粒，用高压液相色谱法在某一时间点对其果糖含量进行检测，与本发明的电化学方法同一时间点的检测即时结果进行对比，如下表1所示。结果表明该微电极传感方法检测结果可靠。

表1测试结果对比

由上表看出，利用微电极在线检测玉米粒中果糖含量与传统HPLC方法测量结果数据基本吻合。该方法数据可靠、选择性高，可实现对果糖高度灵敏、专一的识别，适用于植物的茎、叶、果实等不同组织部位，可实现植物体内果糖的原位实时监测，有助于了解果糖参与植物生命活动的调控规律及作用机制。

实施例3

1)用实施例1制得的双层酶电极(FDH/[Bmim]PF₆)₂/TGA/Au，在0.25V的工作电位下，连续检测不同浓度果糖的标准溶液(0.1、0.5、1、5、10、50、100mM)，得到果糖浓度与电流的关系曲线，同实施例2。

2)将微电极随机插入乳熟期两个不同品种甜玉米普甜E22和T26的玉米粒中，连接电化学工作站，通过计时电流法，在0.25V的工作电压下记录一定时间内乳熟期甜玉米中果糖浓度的实时变化。本发明制备的在线监测传感器采样间隔为0.1秒，可实时反应出玉米粒在一定时间段内的果糖的动态变化。而HPLC方法则只能对某几个时间点进行采样，经过复杂的处理过程再进行检测，需要的采样量多，而得到的信息量少，不能实现动态变化信息的采集，某些情况下可能丢失重要信息。

对比例1

(1)在清洁后的金工作电极上滴涂1mM巯基乙酸(TGA)，得到TGA/Au电极。

(2)然后将离子液体[Bmim]PF₆滴涂到TGA/Au电极上,再逐步滴涂40mg/mL果糖脱氢酶(FDH)和1mM铁氰化钾媒介体的PBS溶液(pH7.4),室温放置2h，固定果糖脱氢酶，制得单层酶电极FDH/[Bmim]PF₆/TGA/Au。

(3)分别配制浓度为0.1、0.5、1、5、10、50、100mM果糖的PBS(pH＝7.4)溶液，选择0.25V作为工作电位，使用制备的酶电极进行计时电流法检测，得到果糖浓度与电流的关系曲线为y＝0.16x+0.7366(r＝0.9796)，与修饰了双层FDH/[Bmim]PF₆的酶电极相比，灵敏度降为0.16，检测范围变为2-50mM。

(4)以乳熟期甜玉米果实为检测对象，将微电极随机插入甜玉米的玉米粒中，连接电化学工作站，通过计时电流法，在0.25V的工作电压下，记录3天内乳熟期甜玉米中果糖浓度的实时变化，取某一时间点的即时浓度与同一时间点的HPLC的检测结果相比，偏差变大。

表2测试结果对比

对比例2

(1)在清洁后的金工作电极上滴涂1mM巯基乙酸(TGA)，得到TGA/Au电极。

(2)然后逐步滴涂40mg/mL果糖脱氢酶(FDH)和1mM铁氰化钾媒介体的PBS溶液(pH7.4),室温放置2h，固定果糖脱氢酶，制得单层酶电极FDH/TGA/Au。

(3)分别配制浓度为0.1、0.5、1、5、10、50、100mM果糖的PBS(pH＝7.4)溶液，选择0.25V作为工作电位，使用制备的酶电极进行计时电流法检测，得到果糖浓度与电流的关系曲线为y＝0.096x-0.7938(r＝0.9855)，与修饰了双层FDH/[Bmim]PF₆的酶电极相比，灵敏度降为0.096，检测范围变为5-40mM。

(4)以乳熟期甜玉米果实为检测对象，将微电极随机插入甜玉米的玉米粒中，连接电化学工作站，通过计时电流法，在0.25V的工作电压下，记录3天内乳熟期甜玉米中果糖浓度的实时变化，有些时间段的结果检测不到。取某一时间点的即时浓度与同一时间点的HPLC的检测结果相比，偏差变大。

表3测试结果对比

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。