一种从禽蛋清中联合提取簇蛋白和卵巨球蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种从禽蛋清中联合提取簇蛋白和卵巨球蛋白的方法，该方法包括以下步骤：1)向蛋清中加pH为5.5‑7的缓冲液，搅拌混合均匀；然后再加入高分子胶体聚合物，搅拌，离心，收集上清液；2)将上清液稀释，然后用截留分子量为100‑500kDa的超滤膜过滤，收集上层截留液；3)向截留液中加入金属盐，或者调节溶液的pH至8‑11，或者向溶液中加入阴离子表面活性剂，然后再次用截留分子量为100‑500kDa的超滤膜过滤，分别收集上层截留液和下层滤液，截留液即为卵巨球蛋白，滤液即为簇蛋白。本发明工艺简单，仅需三步就能得到高纯度的蛋清簇蛋白和卵巨球蛋白。

说明书

技术领域

本发明涉及禽蛋活性蛋白质的提取方法，具体为一种从禽蛋清中联合提取簇蛋白和卵巨球蛋白的方法。

背景技术

禽蛋价格低廉，蛋清中主要干物质为蛋白质，是理想的生物活性蛋白资源之一。蛋清簇蛋白是一种分子量约65-70kDa的糖蛋白，含有α和β两个亚基。现有研究显示，蛋清簇蛋白在防止蛋壳基质蛋白过早聚集和沉淀等方面具有潜在的重要作用，进而调控蛋壳的矿化过程。此外，在蛋清蛋白质组学研究发现，簇蛋白在禽蛋贮藏过程中发生了显著的变化，随着贮藏时间的延长和蛋清品质的劣变，簇蛋白在二维电泳中的蛋白点发生变化，与蛋清品质变化具有较高的相关性，可以做为禽蛋新鲜度的指示蛋白。卵巨球蛋白是由四个相同亚基组成的糖蛋白，其分子量为760kDa，具有抑制蛋白酶、调控细胞生长、促进伤口愈合等功能。因此，蛋清簇蛋白和卵巨球蛋白在禽蛋品质监测、医学研究、生物制药、功能食品等方面具有广阔的应用前景。

然而，两种蛋白质在蛋清中的含量很低，卵巨球蛋白仅占蛋清总蛋白质的0.5％，而簇蛋白更是低达0.05％，因此，纯化获得两种蛋白质的纯品是其研究和应用所面临的首要难题。目前，蛋清簇蛋白的分离纯化均通过多步层析的方法获得，步骤繁多、耗时漫长、提取率低，使得生产成本极高；卵巨球蛋白的纯化方法亦需要通过液相层析，工艺仍然较为复杂，且制备规模较小，不能满足应用所需。此外，目前尚无联合提取两种蛋白的技术方案。因此，建立出一种操作简单、得率高、适合大规模制备的卵巨球蛋白、簇蛋白分离纯化方法，将对其应用和相关产品的开发具有重要的促进作用。

发明内容

本发明的目的是针对上述缺陷，提供一种可同时获得簇蛋白和卵巨球蛋白，且操作简单、成本低、收率和纯度高、适合大规模生产的纯化技术。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种从禽蛋清中联合提取簇蛋白和卵巨球蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

1)取新鲜禽蛋，收集蛋清，向蛋清中缓缓加入1～5倍体积pH为5.5-7的缓冲液，搅拌混合均匀，然后向混合液中加入占混合液重量0.5～5％的高分子胶体聚合物，搅拌0.5～3h后，离心，收集上清液；

2)将步骤1)中的上清液用水稀释1-10倍，然后用截留分子量为100-500kDa的超滤膜过滤，收集上层截留液；

3)向步骤2)获得的截留液中加入金属盐使金属盐离子浓度达到0.3-1mol/L，或者调节截留液的pH至8-11，或者加入阴离子表面活性剂使其浓度达到0.2-1g/L，然后用截留分子量为100-500kDa的超滤膜过滤，分别收集上层截留液和下层滤液，截留液即为卵巨球蛋白，滤液即为簇蛋白。

优选地，该方法包括以下步骤：

1)取新鲜禽蛋，收集蛋清，向蛋清中缓缓加入3倍体积pH为6的缓冲液，搅拌混合均匀，然后向混合液中加入占混合液重量2％的高分子胶体聚合物，搅拌1.5h后，离心，收集上清液；

2)将步骤1)中的上清液用水稀释6倍，然后用截留分子量为100kDa的超滤膜过滤，收集上层截留液；

3)向步骤2)获得的截留液中加入金属盐使金属盐离子浓度达到0.5mol/L，或者调节截留液的pH至9.5，或者加入阴离子表面活性剂使其浓度达到0.6g/L，然后用截留分子量为100kDa的超滤膜过滤，分别收集上层截留液和下层滤液，截留液即为卵巨球蛋白，滤液即为簇蛋白。

进一步优选地，所述高聚物分子为羧甲基纤维素钠、硫酸葡聚糖、聚乙二醇中的一种或几种。

进一步优选地，所述阴离子表面活性剂为十二烷基磺酸钠。

进一步优选地，所述金属盐为钠盐或钾盐。

蛋清中的簇蛋白与卵巨球蛋白发生相互作用，两者结合在一起形成相对稳定的复合体。该方法中，步骤1)的目的是除去蛋清中的大分子量物质如卵黏蛋白，其中加入缓冲液调节pH为5.5-7的目的是调解蛋清蛋白质表面电荷性质，使卵黏蛋白与其它蛋清蛋白质形成的复合物解体，加入高分子聚合物的目的是促进卵黏蛋白的沉淀，从而将卵黏蛋白与其它蛋清蛋白质分离，此时的蛋清溶液中，卵巨球蛋白和簇蛋白形成的复合体分子量最大。

步骤2)中，超滤膜截留分子量100-500kDa，其它小分子蛋清蛋白质都穿过超滤膜，而由于簇蛋白和卵巨球蛋白的复合体分子量超过800kDa，因此被截留下来。

步骤3)中，通过加盐增加溶液离子强度，或者调解pH值改变电荷，或者加入表面活性剂，从而使簇蛋白和卵巨球蛋白的复合体解体，解体后卵巨球蛋白分子量约为750kDa，簇蛋白的分子量约为70kDa，因此可以再次通过超滤膜将二者分离，分别获得纯化的卵巨球蛋白(截留液)和簇蛋白(滤液)。

本发明的有益效果是：

1)本发明工艺简单，仅需三步就能得到高纯度的卵巨球蛋白和簇蛋白，从而缩短了生产周期，降低了生产成本。

2)本发明制备的蛋清簇蛋白和卵巨球蛋白相对纯度均可达90％以上，提取率分别可达67％和55％以上，产品质量有很大的提高。

3)本发明工艺中的操作主要为搅拌、离心、超滤，各环节的生产规模可根据实际生产需要进行扩大，可实现大规模的制备。

附图说明

图1是簇蛋白的反相-高效液相色谱图；

图2是卵巨球蛋白的排阻-高效液相色谱图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行详细地说明。

实施例1

一种从禽蛋清中联合提取簇蛋白和卵巨球蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

1)取新鲜禽蛋(鸡蛋)，收集蛋清，向蛋清中缓缓加入3倍体积pH为6的磷酸盐缓冲液，搅拌混合均匀，然后向混合液中按混合液的重量加入2％的硫酸葡聚糖，搅拌1.5h后，离心，收集上清液；

2)将步骤1)中的上清液用水稀释6倍，然后用截留分子量为100kDa的超滤膜过滤，收集上层截留液；

3)向步骤2)获得的截留液中加入氯化钠使Na离子浓度达到0.5mol/L，然后再次用截留分子量为100kDa的超滤膜过滤，分别收集上层截留液和下层滤液，截留液即为卵巨球蛋白，滤液即为簇蛋白。

实施例2

一种从禽蛋清中联合提取簇蛋白和卵巨球蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

1)取新鲜禽蛋(鸭蛋)，收集蛋清，向蛋清中缓缓加入1倍体积pH为5.5的磷酸盐缓冲液，搅拌混合均匀；然后向混合液中按混合液的重量加入0.8％的羧甲基纤维素钠，搅拌0.5h后，离心，收集上清液；

2)将步骤1)中的上清液用水稀释10倍，然后用截留分子量为100kDa的超滤膜过滤，收集上层截留液；

3)向步骤2)获得的截留液中加入硫酸钾使钾离子浓度达到0.3mol/L，然后再次用截留分子量为100kDa的超滤膜过滤，分别收集上层截留液和下层滤液，截留液即为卵巨球蛋白，滤液即为簇蛋白。。

实施例3

一种从禽蛋清中联合提取簇蛋白和卵巨球蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

1)取新鲜禽蛋，收集蛋清，向蛋清中缓缓加入5倍体积pH为7的缓冲液，搅拌混合均匀；然后向混合液中按混合液的重量加入5％的聚乙二醇，搅拌3h后，离心，收集上清液；

2)将步骤1)中的上清液用水稀释1倍，然后用截留分子量为500kDa的超滤膜过滤，收集上层截留液；

3)向步骤2)获得的截留液中加入氯化钾使钾离子浓度达到1mol/L，然后再次用截留分子量为500kDa的超滤膜过滤，分别收集上层截留液和下层滤液，截留液即为卵巨球蛋白，滤液即为簇蛋白。。

实施例4

一种从禽蛋清中联合提取簇蛋白和卵巨球蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

1)取新鲜鸡蛋，收集蛋清，缓缓加入4倍体积pH为6.5的缓冲液，搅拌混合均匀；然后向混合液中按混合液的重量加入1％的硫酸葡聚糖，搅拌2h后，离心，收集上清液；

2)将步骤1)中的上清液用水稀释3倍，然后用截留分子量为100kDa的超滤膜过滤，收集上层截留液；

3)调节步骤2)获得的截留液的pH至9.5，然后再次用截留分子量为100kDa的超滤膜过滤，分别收集上层截留液和下层滤液，截留液即为卵巨球蛋白，滤液即为簇蛋白。

实施例5

一种从禽蛋清中联合提取簇蛋白和卵巨球蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

1)取新鲜禽蛋，收集蛋清，向蛋清中缓缓加入2倍体积pH为6的缓冲液，搅拌混合均匀；然后向混合液中按混合液的重量加入3％的硫酸葡聚糖，搅拌1h后，离心，收集上清液；

2)将步骤1)中的上清液用水稀释9倍，然后用截留分子量为100kDa的超滤膜过滤，收集上层截留液；

3)向截留液中加入十二烷基磺酸钠使其浓度达到0.6g/L，然后用截留分子量为100kDa的超滤膜过滤，分别收集上层截留液和下层滤液，截留液即为卵巨球蛋白，滤液即为簇蛋白。

试验例

对实施例1-5的产物进行质谱鉴定，下层滤液样品的质谱鉴定结果为：序列覆盖率13％，蛋白鉴定得分114，表明鉴定准确度非常高，经数据库检索，样品被鉴定为鸡簇蛋白；上层截留液样品的质谱鉴定结果为：序列覆盖率11％，蛋白鉴定得分324，表明鉴定准确度非常高，经数据库检索，样品被鉴定为鸡卵巨球蛋白。

对实施例1-5的产物进行高效液相含量测定，簇蛋白样品采用反相-高效液相测定，结果如图1，6.2分钟和9.2分钟各有一个色谱峰，分别对应于蛋清簇蛋白的α亚基和β亚基。卵巨球蛋白样品采用排阻-高效液相测定，结果如图2，在6.8分钟处有一个单一的色谱峰，根据排阻色谱柱的标准保留系数估算，分子量约为600kDa，与卵巨球蛋白分子量较为接近。通过峰面积积分法计算产物的相对纯度，并计算产率，结果见下表：

表1实施例1-5的产物纯度和产率

从以上结果可以看出，本发明制备的蛋清簇蛋白和卵巨球蛋白的纯度可达90％以上，产率可分别达67％和55％以上。