α2巨球蛋白在文昌鱼受精卵中的存在及其抑菌作用分析——头索动物母源性免疫新证据

摘要

与哺乳动物相比，大多数水生动物将其卵子释放到充满病原菌的水环境中，并且在水中完成受精以及进行胚胎发育。那么发育中的胚胎在自身免疫系统成熟之前是怎样保护自身免受病菌的侵害呢？这是一个非常有意义的问题，但是依然没有很好的得到解决。
　　在鱼类中，已经证明许多母源性免疫因子可以通过不同的作用模式来为早期发育中的胚胎提供保护。无脊椎动物缺乏产生抗体的能力，但是在一些物种也发现了被动免疫的母体传递现象。但是，对于无脊椎动物的母源性免疫尤其是母源性免疫组分的研究数据非常有限。
　　α2巨球蛋(alpha2 macroglobulin，A2m)是一种广谱性蛋白酶抑制剂，能够抑制内源性的或者来自入侵病菌的外源性蛋白酶，被认为是进化过程中天然免疫系统中的保守组成部分。头索动物文昌鱼是现存的与脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物。已有实验证明在文昌鱼的卵巢中检测到了A2m mRNA的表达，这使我们设想A2m是否会作为一个母源性的免疫因子存在于受精卵中，并且在胚胎早期发育过程中发挥防御功能？基于如上，我们首先检测文昌鱼的卵液是否能有效抑制细菌的生长，如果能够，则验证A2m是否作为一种母源性免疫因子存在于受精卵中，并且参与卵液的抑菌作用。
　　在本研究中，我们首先制备了的1-2cell时期文昌鱼受精卵卵液，并进行了抑菌实验。结果发现，文昌鱼的卵液能够有效的抑制大肠杆菌(E.coli，革兰氏阴性菌)和金黄色葡萄球菌(S.aureus，革兰氏阳性菌)的生长，而且其抑菌活性与卵液的浓度有明显的相关性。
　　其次，利用基因克隆、原核表达技和蛋白分离纯化技术获得了文昌鱼A2m重组蛋白，并用纯化后的A2m重组蛋白作为抗原对新西兰兔子进行免疫注射，制备了抗A2m的抗血清。为了鉴定A2m是否存在于文昌鱼的受精卵中，则将卵液进行了SDS-PAGE电泳，分别用商业化的抗-人A2m抗体和自制的抗-文昌鱼A2m抗血清进行了免疫印迹(Western blotting)检测，结果分别获得一条分子量约为170kDa的阳性条带，这与文昌鱼A2m相对分子量大小相一致。这充分证明了A2m作为一种母源性免疫因子存在于头索动物文昌鱼受精卵中。
　　在文昌鱼受精卵中，母源性的A2m除了以蛋白形式存在之外，是否也存在其mRNA呢？因此，我们利用地高辛标记的A2m RNA探针对1-4细胞时期胚胎进行了原位杂交，结果在受精卵中检测到了明显的阳性信号。这说明了受精卵中存在母源性的A2m mRNA。进一步，我们利用实时定量PCR技术对不同发育时期胚胎的A2m表达水平进行了分析。发现，1-4细胞时期中mRNA的丰度最高。这与原位杂交结果相互印证，充分证明了母源性A2m mRNA存于文昌鱼卵子中。因此，A2m作为母源性免疫因子以蛋白和mRNA两种形式并存于文昌鱼受精卵中。
　　为了探索母源性的A2m是否在卵液抑菌活性中发挥作用，我们又进行了一系列的实验。首先，当利用抗体沉淀A2m后，发现卵液对大肠杆菌和葡萄球菌的抑菌活性发生明显降低。这说明，母源性的A2m在一定程度上参与了卵液的抑菌作用。此外，研究还发现重折叠的A2m重组蛋白可以抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，并呈现出一定的浓度依赖性。进一步研究发现，利用FITC荧光素标记的A2m蛋白可以与大肠杆菌进行有效地结合。除此之外，通过扫描电镜技术研究了A2m和大肠杆菌的相互作用，发现A2m能够使大肠杆菌细胞发生皱缩，甚至破坏它们的结构。这些数据表明，母源性的A2m在卵液的抑菌中发挥了重要作用，可能直接作用于细菌。
　　综上所述，头索动物文昌鱼的卵液具有抑菌活性。其中，A2m作为一种重要的母源性免疫因子存在于受精卵中，并在卵液的抑菌作用中扮演了重要的角色。毫无疑问，本研究为探讨无脊椎动物母源性免疫防御机制提供了新的证据。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．母源性免疫

1．1 母源性免疫的研究进展

1．2 影响母源性免疫传递的因素

1．3 母源性免疫的功能和意义

1．4 母源性免疫的应用前景分析

2．文昌鱼的介绍

2．1 文昌鱼的发现、定名与分布

2．2 文昌鱼的生活习性

2．3 文昌鱼的生殖腺

2．4 文昌鱼的生殖与胚胎发育

2．5 文昌鱼的进化地位与价值

3．A2m的研究

3．1 A2m的形式与结构

3．2 A2m的特性

3．3 A2m的存在与位置

3．4 A2m的功能

3．5 A2m的系统进化

4．研究目的意义和技术路线

4．1 研究目的意义

4．2 技术路线

第二章 文昌鱼卵液的抑菌作用分析

1．前言

2．材料与方法

2．1 文昌鱼受精卵液的制备

2．2 文昌鱼1-2cell时期受精卵液的抑菌实验

3．结果

3．1 文昌鱼受精卵液的抑菌作用

4．讨论

第三章 A2m在文昌鱼受精卵液中的鉴定与分析

1．前言

2．材料与方法

2．1 文昌鱼A2m基因序列的克隆

2．2 重组蛋白pET-32a—A2m的原核表达与鉴定

2．3 文昌鱼A2m抗血清的制备

2．4 SDS-PAGE和Western blotting

2．5 原位杂交

2．6 实时定量PCR

3．结果

3．1 文昌鱼A2m基因序列的克隆结果

3．2 重组蛋白的诱导表达、纯化、鉴定及抗血清的制备结果

3．3 文昌鱼受精卵液中A2m蛋白的存在性分析

3．4 1细胞时期胚胎(受精卵)的原位杂交结果

3．5 实时定量PCR结果

4．讨论

第四章 A2m在文昌鱼卵液抑菌活性中的作用分析

1．前言

2．材料与方法

2．1 文昌鱼卵液中A2m的抑菌作用分析

2．2 复性重组蛋白A2m的抑菌机制分析

2．3 统计分析

3．结果

3．1 受精卵液中的A2m在抑菌活性的作用

3．2 复性重组蛋白A2m的抑菌机制

4．讨论

总结与展望

参考文献

附录

致谢

个人简历

学术论文