先天性肾上腺皮质增生症基因筛查试剂盒、筛查方法及其应用

摘要

本发明公开了一种先天性肾上腺皮质增生症基因筛查试剂盒，包括：用于检测CYP21A2基因共17个突变位点的PCR扩增引物混合液；针对上述17个突变位点的延伸引物混合液；dNTP；10×PCR缓冲液；25mM Mg

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种中国人群先天性肾上腺皮质增生症基因筛查试剂盒、筛查方法及其应用。

背景技术

先天性肾上腺皮质增生症(Congenital adrenal hyperplasia，CAH)属于一组因类固醇激素生物合成过程中某种酶的先天性缺陷而引起的常见常染色体隐性遗传病，有着广泛的临床表现，在新生儿的发生率为1/5000，不同类型CAH的临床表型及生化表现基于缺陷酶的种类及残余酶活性的不同各有其特点，90％-95％的21-羟化酶缺乏症患者在CYP21A2基因上存在有害突变。CYP21A2基因编码区的常见突变谱和突变热点主要包括基因的点突变、小缺失、小插入和完全重组等，21-羟化酶缺乏症的程度反映在临床症状上可分为失盐型、单纯型和迟发型三类型，失盐型和单纯性统称为经典型，各种类型的临床症状见表1，筛查的同时，分析基因型与表现型的关系，有着重要的意义。

21-羟化酶基因是先天性肾上腺皮质增生症的致病基因，该基因位于人类第6号染色体短臂6p21.3的人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)Ⅲ类基因区，由无活性的假基因CYP21A1和有活性的真基因CYP21A2组成，真假基因皆为3.3kb，真假基因之间均有10个外显子，9个内含子，外显子和内含子同源性分别达到98％和96％(如图2，B)，真假基因串联排列在C4A和C4B基因的3’端，两者相距30Kb，C4/CYP21A1与其端粒侧RPI基因和着丝粒侧TNXB基因以及他们的截短假基因RP2和TNXA基因串联构成RCCX模块(RP-C4-CYP21-TNX)(如图2，A)。目前CYP21A2基因改变的发生机制尚未完全弄清，研究表明大约95％的CYP21A2基因突变是由于活性基因和其临近连锁的假基因相互作用引起的，高度同源性使得在有丝分裂或减数分裂期间可能发生不等互换或重组，而导致基因缺失、插入或点突变，其中大约20％的突变等位基因携带30Kb的DNA缺失片段是由减数分裂时不等互换引起，然而在CYP21A2中75％携带一种或多种突变，这些在CYP21A1假基因中是正常存在的，也由于CYP21A2处于HLA基因复合体中，而HLA基因簇是人类最活跃的区域，重组发生率高，且基因型多样化，因此基因转换在21-羟化酶的发病中比基因缺失更常见。另外5％的患者等位基因含有特别的突变，这仅发生在个别的家庭，它们代表了个别人群中的稀有等位基因。此外，有些突变没有影响到21-羟化酶活性，可以认为是由于21-羟化酶基因型的多态性所致。

目前分子水平检测的主要困难是21-羟化酶真基因CYP21A2和假基因CYP21A1P具有高度的同源性，难于区分。对CYP21A2基因突变主要检测方法包括Southern杂交、CYP21A2基因测序、多重连接依赖的探针扩增(MLPA)、等位基因特异性聚合酶链反应(Allele-specific PCR，AS-PCR)、变性高效液相色谱(Denaturing high-performance liquidchromatography，DHPLC)等，由于上述技术存在繁琐、高成本、低通量，或需要高质量的DNA等问题，临床应用难度较大，因此有必要创立一种高通量、高效能、低成本的CYP21A2基因突变筛查方法，以实现临床快速检测。

基因型分析与分型对21-羟化酶缺乏症患者基因型诊断和胎儿产前患病危险率评估和先天性肾上腺皮质增生症类型鉴别均有重要意义。许多先进国家在开展新生儿筛查的同时，还进行了基因诊断和产前诊断方面的研究。采用基因诊断法即对21-羟化酶唯一致病基因CYP21A2的检测被推荐作为第二层次的筛查方法。因此，通过早期筛查CYP21A2基因，对于提前预知和早期干预治疗从而预防21-羟化酶缺乏症患者的发生具有极其重要的临床应用价值，如表1所示。

表1.21-羟化酶缺乏症的临床表现形式的特点

SNaPshot技术是一种基于单碱基延伸原理的SNP分型新方法，以巢式PCR扩增目的区域后，经寡核苷酸引物延伸标记扩增，突变位点匹配上一个荧光标记的双脱氧核苷酸后终止延伸，然后通过毛细管电泳进行片段分析，相当于单个位点的微测序，可以检测单核苷酸的突变。延伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色，延伸引物的片段长度决定峰的位置，延伸引物的浓度影响电泳检测的峰高。SNPs作为第三代遗传标记应用于疾病基因的定位、克隆和鉴定，具有快速、简便、高效、高通量的特点。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种简单、高通量、高效能、低成本的适合中国人群的先天性肾上腺皮质增生症基因筛查试剂盒，其包括：

1)用于检测CYP21A2基因

位点突变92C→TIVS2-13A/C→G332-339del8bp518T→A704indel9bp710T→A713T→A719A→T844G→T923-924insT955C→T968A→G1069C→T1294G→A1360C→T1447C→T1450C→T

共17个突变位点的PCR扩增引物混合液；

2)针对上述17个突变位点的延伸引物混合液；

3)dNTP；

4)10×PCR缓冲液；

5)25mM Mg²⁺离子；

6)Fast StartTaq酶；

7)由SAP酶、Exon I酶与配套缓冲液组成的纯化试剂；

8)SNaPshot Multiplex混合液；

9)单个位点纯合、杂合突变的阳性和阴性对照DNA；

10)去离子水。

所述检测CYP21A2基因的92 C→T位点、IVS2-13A/C→G位点、332-339缺失8个碱基GAGACTACT的G→C位点、518T→A位点的初级PCR扩增引物序列一致，具体序列如SEQ IDNo.1与SEQ ID No.2所示。

所述检测CYP21A2基因的704缺失9个碱基TCACATCGT同时插入8个碱基CCACAACG的T→C位点、710 T→A位点，713 T→A位点、719 A→T位点、844 G→T位点、923-924插入T的G→T位点、955 C→T位点、968 A→G位点、1069 C→T位点、1294 G→A位点、1360 C→T位点、1447 C→T位点、1450 C→T位点的初级PCR扩增引物序列一致，具体序列如SEQ ID No.3与SEQ ID No.4所示。

所述检测CYP21A2基因的92C→T位点的次级PCR扩增引物序列如SEQ ID No.5与SEQ ID No.6所示。

所述检测CYP21A2基因的IVS2-13 A/C→G位点、332-339缺失8个碱基GAGACTACT的G→C位点、518 T→A位点的次级PCR扩增引物序列一致，具体序列如SEQ ID No.7与SEQ IDNo.8所示。

所述检测CYP21A2基因的704缺失9个碱基TCACATCGT同时插入8个碱基CCACAACG的T→C位点、710 T→A位点，713 T→A位点、719 A→T位点、844 G→T位点、923-924插入T的G→T位点的次级PCR扩增引物序列一致，具体序列如SEQ ID No.9与SEQ ID No.10所示。

所述检测CYP21A2基因的955 C→T位点、968 A→G位点、1069 C→T位点的次级PCR扩增引物序列一致，具体序列如SEQ ID No.11与SEQ ID No.12所示。

所述检测CYP21A2基因的1294 G→A位点、1360 C→T位点、1447 C→T位点、1450 C→T位点的次级PCR扩增引物序列一致，具体序列如SEQ ID No.13与SEQ ID No.14所示。

进一步的，以CYP21A2基因的92 C→T位点，IVS2-13A/C→G位点，332-339 del8bp，518T→A位点，704 indel9bp，710T→A位点，713T→A位点，719A→T位点，844G→T位点，923-924 insT位点，955C→T位点，968A→G位点，1069C→T位点，1294G→A位点，1360C→T位点，1447C→T位点，1450C→T位点等17个突变位点为检测对象而设计的延伸引物分别如SEQ IDNo.15～SEQ ID No.31所示，延伸引物的终浓度分别为0.1μM、0.16μM、0.4μM、1.6μM、0.8μM、1.3μM、0.8μM、0.4μM、0.1μM、0.2μM、0.65μM、1.3μM、1.1μM、2.6μM、2.1μM、2.6μM、1.3μM。

本发明的又一目的在于提供一种先天性肾上腺皮质增生症基因突变筛查方法，其包括：

(1)以所述PCR扩增引物对先天性肾上腺皮质增生症基因进行多重巢式PCR扩增，并对扩增产物进行纯化；

(2)以所述延伸引物针对步骤(1)所获纯化产物进行延伸标记反应和二次纯化；

(3)对步骤(2)所获二次纯化产物进行毛细管电泳，并对毛细管电泳结果进行数据采集和分析，获得筛查结果。

本发明的另一目的在于提供前述任一项中国人群先天性肾上腺皮质增生症基因筛查试剂盒在先天性肾上腺皮质增生症突变筛查中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种检测系统，其包含本发明所述试剂盒。

本发明的有益效果是:

本案发明人经大量研究和实践，通过Google数据库、PubMed数据库及HGMD数据库检索对中国人群先天性肾上腺皮质增生症基因的突变位点进行了筛选和组合，并构建了本发明的试剂盒，利用该试剂盒，可针对多达17个特异性先天性肾上腺皮质增生症基因突变位点同时进行多重巢式PCR扩增和标记延伸，继而再通过简单的毛细管电泳分析等，一次获得多达17个位点的基因型，弥补目前现有突变筛查方法的不足，其操作简便，成本低，且检测通量和检测结果的准确性等较之CN 103421908B所提供的试剂盒均有大幅提升，并优化了部分PCR引物和延伸引物，增加了准确性，降低了假阴性率，例如，新增10个位点，修订了已有的3个延伸引物，检测通量从7个位点提高到17个位点，检测结果的准确度可达到近100％，具有较高的规模化临床应用价值。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明一典型实施方案中利用该中国人群先天性肾上腺皮质增生症基因筛查试剂盒进行基因筛查的工艺流程图；

图2是CYP21A2基因位置、邻近结构及本发明突变热点与表型的关系图；

图3是本发明一典型实施方案中的毛细管电泳结果及验证图。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。

一种先天性肾上腺皮质增生症基因筛查试剂盒、筛查方法及其应用，它能针对目前中国人群先天性肾上腺皮质增生症基因突变的特点，选择覆盖范围广泛的17个突变热点作为筛查目标，弥补目前现有突变筛查方法的不足，提供一种简单、高通量、高效能、低成本的适合中国人群的先天性肾上腺皮质增生症基因突变筛查方法。具体而言，本发明一实施方案提供的一种先天性肾上腺皮质增生症基因突变筛查试剂盒，其包括：

(1)PCR扩增引物混合液、延伸引物混合液、dNTP、10×PCR缓冲液、25mM Mg²⁺离子、去离子水、FastTaq酶、SNaPshot>

(2)按一定比例混合的PCR扩增的正向引物和反向引物；各PCR扩增引物的浓度见表2；

(3)按一定比例混合的的延伸引物；各延伸引物的终浓度参见下表2，其为推荐的使用浓度配比，具体在使用时，如果某个电泳峰的峰高过低，可适当增加引物加入量，如果峰过高，可以适当减少引物用量，以达到最佳检测效果，各延伸引物的浓度见表3。

(4)纯化用SAP酶、Exon I酶及其配套的缓冲液；

(5)单个位点纯合、杂合突变的阳性和阴性对照DNA；

(6)使用说明书。

表2 CYP21A2基因17个突变点PCR扩增引物情况

基于该试剂盒的检测方法为：通过多重巢式PCR扩增，使被检测样本的5个目的片段得到扩增富集；然后进行扩增产物的酶反应纯化，去除多余的引物及dNTP“杂质”；再利用针对突变位点设计的17条延伸引物，对17个富集的片段进行单碱基的延伸反应，仅对突变位点的单个碱基进行荧光标记扩增，突变位点匹配上一个荧光标记的双脱氧核苷酸后终止延伸；然后再进行一次扩增产物的酶反应纯化；最后经毛细管电泳进行扩增片段分析，相当于单个位点的微测序，这样可以检测单核苷酸的突变，延伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色，延伸引物的片段长度决定峰的位置，延伸引物的浓度影响电泳检测的峰高。

所述试剂盒可以使用Primer Premier5引物设计程序(加拿大PREMIER生物软件公司)和Gene Runner V3.05软件(Hasting软件公司)协助设计引物，通过多重巢式PCR扩增，使被检测样本的各个目的位点得到扩增富集。PCR扩增引物设计时选择目的区域上下游100-400bp的距离引物设计的起始部位，引物与序列匹配的特异性要好，引物间的退火温度要尽量一致，且保持在55℃左右。使在一个多重PCR反应中的各个扩增引物的扩增效率相当。

表3 CYP21A2基因17个突变点PCR延伸引物情况

所述试剂盒包含检测以CYP21A2基因的92C→T位点，IVS2-13A/C→G位点，332-339del8bp，518T→A位点，704 indel9bp，710T→A位点，713T→A位点，719A→T位点，844G→T位点，923-924 insT位点，955C→T位点，968A→G位点，1069C→T位点，1294G→A位点，1360C→T位点，1447C→T位点，1450C→T位点等17个突变位点的扩增引物和延伸引物。

所述PCR扩增引物和延伸引物浓度的优化配置，使其能够在延伸反应时兼顾各个位点的产量，利于后续检测中各个位点突变情况的判断识别，对于各突变位点的扩增片段长度和具体的引物序列，可以参考表3。而在扩增结束后可采用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行扩增片段检测，并发现了相应的扩增条带。

所述PCR扩增引物及延伸引物用于针对人类基因组中目的区域DNA的扩增以及目的位点的微测序，进而达到基因分型的目的，以实现特定核苷酸变异的检测。

本实施例中17个突变位点的延伸引物在设计时的指导思想是：根据不同序列情况，在突变点的上游或下游选取正向或反向与突变位点5’端或3’端序列互补结合的17-25bp的序列；避免序列中有难以解链的二级结构；确保延伸的单个碱基不在序列上，并保证缺失型突变下一个碱基与缺失的碱基为不同碱基；各个延伸引物片段全长应该有一定的差异，通过在片段的5’端加上若干个T，使得延伸引物长度均匀分布在18-60bp之间(参见表5)，以便于通过毛细管电泳分离检测(其序列参见表3)。这样经过PCR扩增后，带有不同荧光的不同长度的片段经毛细管电泳后就能够分析出相应片段所携带的碱基类型，进而可以判断是否存在该碱基的突变，并区分属于野生型、纯合突变还是杂合突变，使上述17个位点一次性得到精确的基因分型。

这样，经过对突变位点的单个碱基进行荧光标记单碱基延伸扩增后，再进行一次扩增产物的酶法纯化，带有不同荧光的不同长度的片段经毛细管电泳后就能够分析出相应片段所携带的碱基类型，延伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色，延伸引物的片段长度决定峰的位置，延伸引物的浓度影响电泳检测的峰高。峰的颜色为绿色代表A碱基，蓝色为G碱基，红色为T碱基，黑色为C碱基，如表4所示。

表4 荧光标记色

根据峰的颜色可以清楚方便的判断为野生型(正常)还是突变型，如表5所示。前述CYP21A2基因的1447C→T、955C→T、92 C→T、713A→T、719A→T、IVS2-13A/C→G、704indel9bp、1360C→T、1069C→T、844G→T、923-924insT、332-339del8bp、968A→G、710A→T、1450C→T、518T→A、1294G→A位点的延伸引物片段在经过毛细管电泳后的理论长度可如表5所示，在实际电泳过程存在位置飘移现象，尤其是对于发生了突变的位点而言，其峰漂移更多，即与毛细管电泳分子量marker-LIZ所测片段大小有差距，但不会影响整体结果判读。

表5 CYP21A2基因突变热点野生型与突变型颜色标记

*所示设计为反向测序反应，因此在毛细管电泳结果中野生型与突变型均要按反向测序去判断。CYP21A2基因的92位点，正向测序突变类型为C→T，反向测序即为G→A；518位点正向测序突变类型为T→A，反向测序即为A→T；710位点正向测序突变类型为T→A，反向测序即为A→T；713位点正向测序突变类型为T→A，反向测序即为A→T；719位点正向测序突变类型为T→A，反向测序即为A→T；1450位点正向测序突变类型为C→T，反向测序即为G→A。

本实施例中设计的PCR扩增引物和延伸引物序列是通过核酸合成仪人工合成，并与PCR扩增反应试剂，包括：dNTP、5×和10×PCR缓冲液、Mg²⁺离子、去离子水、FastTaq酶、SNaPshot>

参图1所示，本实施例中的具体操作包括：

(1)针对CYP21A2基因2个区段进行巢式多重PCR扩增反应。反应体系总体积10μL，10×PCR缓冲液1.0μL、MgCl₂(25mM)1.0μL、dNTP(2mM)1.5μL、Primer>

(2)PCR产物纯化：反应体系总体积6μL，ddH2O 2.8μL、SAP酶(1.0U/μL)1.8μL、ExonI酶(5.0U/μL)0.4μL、上述PCR产物1.0μL；应程序：37℃反应80min，80℃终止反应15min，4℃保存。

(3)标记延伸：反应体系总体积6.0μL，ddH₂O>

(4)二次纯化：反应总体积6.7μL，反应结束后每反应产物中加入SAP酶(1.0U/μL)0.7μL；反应程序：37℃反应60min，75℃灭活反应15min，4℃保存。

(5)毛细管电泳：反应体系总体积10.2μL，Hi-Di甲酰胺(ABI公司)9μL，内标LIZ-120(ABI公司)0.2μL，第二次纯化产物1μL；反应程序：95℃变性5min，立即置冰上5min。在ABI公司遗传分析仪进行毛细管电泳，应用GeneMapper系列软件进行数据的采集和分析。

(6)结果分析：根据峰颜色来区分野生型、杂合突变和纯合突变，得出其多态图谱，分析其基因型，参照图3所示，其中A所示为正常对照样本SNaPshot基因分型毛细管电泳峰图，其中，电泳顺序由左向右依次为：1294C→T、1447G→A、955C→T、92G→A、713A→T、719A→T、IVS2-13A/C→G、704indel9bp、1360G→A、1069C→T、844G→T、923-924insT、332-339del8bp、968T→C、710A→T、1450G→A、518A→T、(理论上的片段长度分别为22bp，21bp，24bp，24bp，23bp，26bp，30bp，25bp，46bp，34bp，36bp，36bp，40bp，39bp，40bp，47bp和42bp。实际电泳过程存在飘移现象，即与分子量标记所测片段大小有一定差距，如25bp的野生型704indel9bp片段会飘移到30bp的IVS2-13A/C→G片段右面，46bp的野生型1360C→T片段会飘移到34bp的1069C→T片段左面，24bp的突变型955C→T片段会飘移到30bp的IVS2-13A/C→G片段处，但不会影响整体结果判读)；B所示为患者12CH005-1的毛细管电泳峰图(表示突变位置)；C所示为患者12CH005-1的955C→T和位点纯合突变测序结果；D所示为患者12CH013-1的毛细管电泳峰图(表示突变位置)；E1所示为患者12CH013-1的IVS2-13A/C>G和1069C→T位点杂合突变测序结果。

(7)测序法可靠性的检测

通过突变检测金标准“基因测序”的方法对各突变热点同时进行测序，结果显示应用此技术检测的特异性和敏感性均达到了100％。

本具体实施方式具有高通量、高效能、低成本、简单适用，适合中国人群先天性肾上腺皮质增生症基因筛查检测。采用多重巢式PCR加上引物延伸微测序技术，在一个反应管中同时完成17个位点的基因分型。

以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

在本实施例中，提供了一种适用于新生儿足跟血片或疑似肾上腺皮质增生症检测DNA库的试剂盒(96人份)，其可在体外完成中国人群先天性肾上腺皮质增生症基因突变热点筛查。

1、检测样本

样本来源于苏州市立医院生殖与遗传中心常规新生儿遗传代谢性疾病筛查后剩余的干血片标本或疑似患者家属DNA文库，库中所有患者样本收集前均签署了知情同意书，并承诺配合后续的诊疗和随访。

2、检测方案

见具体实施方式的检测方法。

3、检测结果

根据野生型电泳峰型颜色和突变峰型颜色不同进行判断，均发现了5例阳性干血片的致病位点和7例疑似患者及其家属DNA的致病位点，以上均进行了验证，结果显示应用此技术检测的特异性和敏感性均达到了100％。

表6a 疑似高危样本CYP21A2基因检测结果a

SNaPshot结果纯合突变：●；SNaPshot结果杂合突变：○；测序结果纯合突变：◆；测序结果杂合突变：◇

表6b 疑似高危样本CYP21A2基因检测结果b

SNaPshot结果纯合突变：●；SNaPshot结果杂合突变：○；测序结果纯合突变：◆；测序结果杂合突变：◇

表6a、表6b中，5例阳性干血片标本患者和9例疑似患者及其家属DNA的SNaPshot结果有3例患者是复合杂合/纯合突变，其中2例是Q318X/R356W复合纯合突变，1例是IVS2-13A/C>G/R356W复合杂合突变；3例患者是单碱基IVS2A/C>G纯合突变，1例是单碱基I 172N纯合突变，1例单碱基IVS2A/C>G杂合突变，1例是单碱基R356W纯合突变，1例是单碱基R356W杂合突变。

本发明的筛查方法及试剂盒使用方便，操作简单，成本低，通量高，检测结果直接可靠，适合于中国人群先天性肾上腺皮质增生症基因的大规模筛查。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。