一株能分泌识别亚甲基蓝的单克隆抗体的单克隆细胞株C4及其应用

摘要

一株能分泌识别亚甲基蓝的单克隆抗体的单克隆细胞株C4及其应用，属于免疫化学技术领域。本发明提供的单克隆细胞株C4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 12026。此单克隆细胞株C4分泌的单克隆抗体能够特异性识别亚甲基蓝，特异性好，且灵敏度高，半数抑制浓度（IC50）为21.13 ng/mL；用此单克隆抗体能够用于建立亚甲基蓝的免疫检测技术。

说明书

技术领域

本发明涉及一株能分泌识别亚甲基蓝的单克隆抗体的单克隆细胞株C4及其应用，属于免疫化学技术领域。

背景技术

亚甲基蓝属于噻嗪类染料，自孔雀石绿被明令禁止用于水产养殖中后，其替代品亚甲基蓝的残留问题引起广泛关注和重视。亚甲基蓝最初开始用于尿道感染和疟疾的防治，随着研究不断地深入，有研究发现亚甲基蓝能杀死肿瘤细胞并对肿瘤细胞有较高的亲和性，因此亚甲基蓝经放射性同位素标记后用来诊断、定位和治疗多种肿瘤。亚甲基蓝同时具有氧化性和还原性，在临床上可作为解毒剂用于氰化物和亚硝酸盐等药物中毒。由于亚甲基蓝在水溶液中呈离子型状态，将与周边微生物的酶系统竞争氢离子，导致微生物酶失活致死。故亚甲基蓝还在兽医领域特别是水产养殖中用作消毒剂。有研究表明，亚甲基蓝还对一些鱼病如斜管虫病，小爪虫，水霉病等有较好的疗效。因此，当一些三苯甲烷类染料如孔雀石绿和结晶紫被明确禁止用于水产养殖后，亚甲基蓝作为替代品成为养殖户们亲睐的对象。除了消毒剂和鱼病预防外，亚甲基蓝还可在水产品运输过程中作为抗真菌剂使用以降低死亡率。亚甲基蓝的毒性低于孔雀石绿，然而在水产养殖过程中任何对亚甲基蓝的不合理使用，都可能造成亚甲基蓝的蓄积，另外随着染料的广泛运用，作为阳离子染料的亚甲基蓝随着废水大量进入周边水域，造成环境中亚甲基蓝浓度超标，当人或动物长期暴露在高浓度的亚甲基蓝环境中时，容易引起中毒现象，毒副作用有致突变，红细胞形态改变或贫血，坏死性脓肿等，严重时可致死。因此，包括美国，日本，欧盟在内的国家或组织不允许亚甲基蓝用于水产养殖中。在我国，亚甲基蓝由于其价格低廉，疗效明确，养殖户对其毒副作用了解较少，亚甲基蓝在水产养殖中作为消毒剂及孔雀石绿的替代品被广泛运用，因此其残留问题不容小觑，对其残留的检测技术研究对我国的食品安全及出口贸易具有重要意义。我国虽然还未出台相关法律法规，但是检测技术的研究是监督工作的先驱，面对国际贸易的技术壁垒，对亚甲基蓝及其代谢残留检测技术的研究，尤其是快速简便筛查技术的研究刻不容缓。

已发表的文献中对亚甲基蓝的检测技术仍停留在仪器方法上，如液相色谱技术，毛细管电泳技术和离子色谱法，检测器一般为质谱或光学检测器，前处理技术有液液萃取及固相萃取技术。目前，对亚甲基蓝的主流检测手段主要是高效液相色谱串联质谱法，只是在检测器以及样品前处理手段上如萃取，净化等步骤上略有不同。对水产品中亚甲基蓝的免疫分析技术研究基本处于空白阶段。

建立亚甲基蓝的免疫检测技术，首先要获得特异性识别亚甲基蓝的单克隆抗体。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种单克隆细胞株C4，其能够产生特异性识别亚甲基蓝的单克隆抗体，能够用于建立亚甲基蓝的免疫检测技术。

本发明的技术方案：一株能分泌识别亚甲基蓝的单克隆抗体的单克隆细胞株C4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 12026。

一种识别亚甲基蓝的特异性单克隆抗体，其由保藏编号为 CGMCC No.12026的单克隆细胞株C4分泌产生。

所述的识别亚甲基蓝的特异性单克隆抗体的应用，在制备检测亚甲基蓝的免疫工具中的应用。

所述的识别亚甲基蓝的特异性单克隆抗体的应用，在检测鱼肉中亚甲基蓝的应用。

本发明的有益效果：由单克隆细胞株C4产生的特异性单克隆抗体能够特异性识别亚甲基蓝；且灵敏度好，半数抑制浓度（IC₅₀）为21.13>

生物材料样品保藏：本发明提供的杂交瘤细胞株C4，分类命名为单克隆细胞株，该细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称 CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期 2016 年 1 月 20日，保藏编号为 CGMCC No.12026。

附图说明

图1 亚甲基蓝单抗的标准曲线。

图2 完全抗原的紫外鉴定结果。

具体实施方式

本发明提供了单克隆细胞株C4及其分泌的抗亚甲基蓝的特异性单克隆抗体。下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明，实施例中如无特殊说明均为常规方法。

实施例1 单克隆细胞株C4 的制备

1、小鼠免疫和抗血清筛选

选择半抗原（MB-HS）通过活化酯法分别与血蓝蛋白（KLH）和卵清蛋白（OVA）偶联，形成免疫原（MB-HS-KLH）和包被原（MB-HS-OVA）。

首免采用完全佐剂和免疫原1︰1体积混合，以皮下免疫方式免疫BALB/c小鼠，免疫间隔时间4周，六免后 7-10d，以包被原包被酶标板，采用间接竞争酶联免疫法测定血清的效价和抑制，选择效价高并抑制好的小鼠进行融合。

其中，半抗原为亚甲基蓝衍生物，半抗原的结构为：

2、细胞融合

小鼠抗血清评价后第21天，选择符合要求的小鼠进行腹腔冲刺免疫。具体过程如下：将免疫原用生理盐水稀释至200 μL体积，冲免剂量为最后一次加强免疫的剂量的一半，将稀释好的免疫原注入1 mL注射器，从小鼠左侧腹腔缓慢注入小鼠体内。

小鼠冲免3天后，采用断颈的方式处死小鼠，并迅速放入100 mL 75%酒精中, 小鼠在酒精中浸泡5-10 min后转移到超净工作台取出脾脏，放置在200目不锈钢筛网上，用5 mL注射器内芯轻轻研磨，并不断用RPMI1640培养基进行冲洗，将脾细胞悬浮液收集到50 mL离心管中，1200 r/min离心8 min，弃上清，轻轻吹打离心管底部以分散细胞，加入RPMI1640培养基重悬脾细胞，并转移到新的50mL离心管中。重复离心三次后加入10 mL RPMI1640培养基，混匀，取出其中的100 μL稀释1000倍进行计数，余下的备用。脾细胞收集好后，开始收集处于对数生长期的瘤细胞。瘤细胞与脾细胞按计数比1︰2-10比例混合均匀，1200 r/min离心8 min，弃上清，用食指轻轻弹打离心管底部使细胞分散均匀，准备融合：第1 min内，将预热的1 mL PEG缓慢贴壁匀速滴加到混合细胞中，边加边轻轻摇动离心管；第2 min内，将离心管握在手中，静置；第3-4 min，以1 mL/min的速度缓慢滴加2 mL的RPMI 1640，边加边摇动离心管；第5-6 min内，以1 mL/30s的速度缓慢滴加4 mL的RPMI 1640，边加边摇；第7 min内，以1 mL/10s的速度加入RPMI 1640。最后加入RPMI 1640至20 mL, 将离心管用封口膜封好放到培养箱中静置5 min，800 r/min离心8 min，弃上清，用食指轻轻弹打离心管底部使细胞分散开来，缓慢加入HAT选择培养基，轻轻混匀后按200 μL/孔转移到96孔细胞板中（铺板数量根据细胞数量而定），放在CO₂培养箱中培养。

细胞融合后第3天进行HAT选择培养基半换液，第6天进行HAT培养基全换液，第7天取细胞上清进行细胞筛选。

融合后第7天，根据小鼠抗血清的效价和抑制测定结果，确定细胞筛选所需的包被浓度，进行包板封闭。首先进行细胞阳性的测定，再取出阳性孔的细胞上清，进行抑制测定，抑制测定时需进行适当的稀释使所有孔的OD值尽量都在1.5左右，在96孔板中分别加入一定浓度的亚甲基蓝标准品和标准品稀释液，50 μL/孔，按50 μL/孔加入稀释好的细胞上清，37℃烘箱温育30min，再按常规ELISA操作方法洗板加入二抗等直至测定吸光值。根据检测结果，挑选抑制较好阳性较高的4-6个孔进行第一次亚克隆。经三次亚克隆后，挑选效果好的单团细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基进行扩大培养。待细胞铺满培养瓶底部且细胞处于对数生长期时，收集细胞进行冻存和制备腹水。

实施例2 特异性单克隆抗体的制备、纯化

1、单克隆抗体的制备

采用体内诱生腹水瘤法制备腹水。将石蜡油灭菌好待用。选状态好的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射进0.5 mL无菌石蜡油，进行预刺激。注射石蜡油是因为石蜡油能够降低小鼠免疫力，减弱小鼠对注射的杂交瘤细胞的排斥反应，也可以刺激小鼠产生白细胞介素，为注射的杂交瘤细胞提供良好的生长环境，有利于腹水的产生。7-10天后，收集扩大培养的杂交瘤细胞，经RPMI 1640培养基洗三次后按0.5 mL/管注射进小鼠腹腔。7-10天后小鼠开始会产生腹水瘤，随时观察小鼠的状态，待其腹腔肿胀后，用5 mL注射器从小鼠腹腔里抽取腹水，分装到1.5 mL离心管中，8000 r/min离心10min，吸取上清，分装进1.5 mL无菌管中，-20℃保存备用。

2、单克隆抗体纯化

采用辛酸 - 硫酸铵沉淀法纯化腹水。取1 mL腹水在离心管中，加入等体积的乙酸钠溶液（0.01 M，pH 4.0），混匀后边振荡边缓慢加入33 μL正辛酸，封口膜封好，放置摇床上常温振荡30 min。随后8000 r/min离心10 min，取上清至新的1.5 mL离心管中，加入等体积的饱和硫酸铵溶液。在4℃冰箱中静置过夜，充分沉淀之后，8000 r/min离心15 min，弃上清。沉淀用1 mL的含钾盐PBS（0.01 M，pH 7.4）复溶，装进水煮灭过菌的透析袋中，在0.01 M PBS透析液中透析3天，每隔12h更换透析液。结束后，分装于1.5 mL的无菌管中，并于-20℃保存备用。

实施例3 抗体性能评价

1、亚型测定

采用购买的亚型鉴定试剂盒检测制备的单克隆抗体的亚型。具体过程如下：在已包被0.1 μg/mL包被原的酶标板中加入稀释好的0.2 μg/mL的抗体，50 μL/孔，37℃烘箱内温育30 min，洗板拍干后，分别加入IgM，IgG1，IgG2a ，IgG2b，IgG3，IgA等酶标二抗类型，100 μL/孔，37℃烘箱内温育30 min，洗板拍干后显色终止，其中显色孔所对应的酶标二抗类型即为所鉴定的抗体的亚型。

2、交叉反应（CR）

分别添加浓度为10 μg/mL的天青A，天青B，天青C，孔雀石绿和结晶紫对C4分泌抗体进行交叉反应测试，结果如下表所示，C4分泌抗体对其他结构类似物无交叉反应，具有高度特异性。

表1 抗亚甲基蓝单抗的交叉反应

化合物IC₅₀（ng/mL）CR(%)化合物IC₅₀（ng/mL）CR(%)MB21.13100天青C>10000<0/01天青A>10000<0/01孔雀石绿>10000<0/01天青B>10000<0/01结晶紫>10000<0/01

3、灵敏度测定

用半数抑制浓度（IC₅₀）表示抗体的灵敏度。IC₂₀-IC₈₀表示方法的线性范围

偶联物（MB-HS-KLH）以及偶联物（MB-HS-OVA）均可通过活化酯法得到。

本发明用连二亚硫酸钠还原合成了亚甲基蓝-琥珀酸酐半抗原，再通过活化酯法和血蓝蛋白偶联用作免疫原，从而得到特异性识别亚甲基蓝的单克隆抗体。

包被原浓度为 0.1μg/mL，抗体的蛋白浓度为 0.3μg/mL，利用origin软件对数据进行拟合得到亚甲基蓝单克隆抗体的标准曲线，如图1所示， IC₅₀为21.13>20-IC₈₀）为4.26-104.83>