稳定分泌抗猪细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步应用

摘要

本研究将镍离子金属螯合亲和层析法纯化的猪细小病毒VP2蛋白加入等体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，分别制成完全佐剂抗原和不完全佐剂抗原，免疫6-8周龄BALB/c雌鼠，五免过后，ELISA效价达到1:51200以上的小鼠腹腔超强免疫一次，三天后取小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。
　　 用蔗糖包埋、差速离心法制备的猪细小病毒全病毒作为包被抗原建立间接ELISA方法进行筛选，筛选抗猪细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株。采用有限稀释法，经过5-6次克隆，最终获得4株稳定分泌抗猪细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为：2C5、485、1A11、5C6。经测定485和12C5仅与全病毒发生反应，1A11和5C6为针对VP2蛋白的单克隆抗体，亚类鉴定结果显示，485是IgG1亚类，2C5是IgM亚类。对杂交瘤细胞进行染色体分析，试验结果所得平均染色体数目在92～108之间，符合SP2/0细胞的染色体数目与正常小鼠脾细胞的染色体数目之和，表明所获的抗体分泌细胞为杂交瘤细胞。对4株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的特异性检测，结果显示其仅与灭活的猪细小病毒抗原发生反应，呈阳性，而不与猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪2型圆环病毒(PCV2)抗原反应。经测定，所得4株抗猪细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清ELISA效价为1:800-1:8000，小鼠腹水单克隆抗体ELISA效价为1:8000-1:1024000。稳定性实验表明，经过连续传代10代、25代和两次冻存复苏后，杂交瘤细胞分泌抗体的能力基本不变，仍能稳定分泌特异性抗体，说明所获得的杂交瘤细胞株分泌抗体的能力稳定。
　　 利用所建立的单克隆抗体细胞株，建立了一种检测猪细小病毒抗原的免疫捕获PCR方法，该检测方法具有较好的特异性和敏感性。用该方法对临床采集的13份病料进行检测，其阳性率高于常规PCR。