含氟邻苯二酚结构化合物作为结核分枝杆菌抑制剂的应用

摘要

本发明公开了一种含氟邻苯二酚结构化合物作为结核分枝杆菌抑制剂的应用。本发明所提供的应用具体为具有含氟邻苯二酚结构的化合物在制备治疗和/或预防因结核分枝杆菌感染引起的疾病的药物中的应用。实验证明，具有含氟邻苯二酚结构的化合物(如3-氟邻苯二酚)对结核分枝杆菌的生长具有直接的抑制作用，能够抑制巨噬细胞内结核分枝杆菌的增殖，能够提高结核杆菌感染巨噬细胞内一氧化氮的表达水平。另外，细胞毒性试验还表明，具有含氟邻苯二酚结构的化合物(如3-氟邻苯二酚)未见明显毒副作用，细胞药效学试验中，在有效剂量范围内，细胞未出现明显的毒性变化。因此，本发明将对于研发新的抗结核药物具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药及化学领域，涉及一种含氟邻苯二酚结构化合物作为结核分枝杆菌抑制剂的应用。

背景技术

肺结核疾病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis(MTB)引起的呼吸道传染性疾病。我国现在是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数居世界第二位。

多药耐药和广泛药耐药是制约抗菌药物临床使用的关键因素。抗结核药物也同样存在这些现象。最新的流行病学调查显示，在肺结核感染病例中有超过40％的结核菌对至少一种二线药物耐药。耐药结核病的治疗所需治疗周期长于普通患者，治疗费用是普通患者的100倍。因此，发现并研发新的抗结核药物对患者及其家庭、社会都有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种含氟邻苯二酚结构化合物作为结核分枝杆菌抑制剂的应用。

具有含氟邻苯二酚结构的化合物在制备治疗和/或预防因结核分枝杆菌感染引起的疾病(如肺结核)的药物中的应用属于本发明的保护范围。

具有含氟邻苯二酚结构的化合物在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(a)制备能抑制结核分枝杆菌生长的制剂；

(b)制备能抑制哺乳动物细胞内结核分枝杆菌增殖的制剂；

(c)制备能提高结核分枝杆菌感染的哺乳动物细胞内一氧化氮诱导率的制剂。

在本发明的实施例中，所述具有含氟邻苯二酚结构的化合物具体可为3-氟邻苯二酚或其可药用盐。

本发明还请求保护一种治疗和/或预防因结核分枝杆菌感染引起的疾病的药物。

所述治疗和/或预防因结核分枝杆菌感染引起的疾病(如肺结核)的药物的有效成分具体为具有含氟邻苯二酚结构的化合物(如3-氟邻苯二酚或其可药用盐)。

本发明还请求保护具有如下功能中的至少一种的制剂；

(1)能抑制结核分枝杆菌生长；

(2)能抑制哺乳动物细胞内结核分枝杆菌增殖；

(3)能提高结核分枝杆菌感染的哺乳动物细胞内一氧化氮诱导率的制剂。

所述制剂的有效成分具体为具有含氟邻苯二酚结构的化合物。

在本发明的实施例中，所述具有含氟邻苯二酚结构的化合物具体可为3-氟邻苯二酚或其可药用盐。

在本发明中，所述结核分枝杆菌为牛型结核分枝杆菌，具体为牛型结核分枝杆菌BCG 1173P2。

在本发明中，所述药物或所述制剂的剂型可为乳剂、油剂、粉剂、水剂、悬浮剂、片剂、颗粒剂或胶囊剂。

在本发明中，所述哺乳动物细胞为巨噬细胞，具体为THP-1细胞来源的巨噬细胞。

在本发明中，所述能抑制结核分枝杆菌生长具体体现为：所述具有含氟邻苯二酚结构的化合物的浓度大于312.256μM(如312.256～624.512μM)时能抑制1.5×10⁵CFU/mL的所述结核分枝杆菌的生长。

在本发明中，所述能抑制巨噬细胞内结核分枝杆菌增殖具体体现为：所述具有含氟邻苯二酚结构的化合物的浓度大于4.879μM时能抑制所述巨噬细胞内所述结核分枝杆菌的增殖。

在本发明中，所述提高结核分枝杆菌感染的巨噬细胞内一氧化氮诱导率具体体现为：所述具有含氟邻苯二酚结构的化合物的浓度大于5.0μM(如5.0-312μM)时能提高被所述结核分枝杆菌感染的所述巨噬细胞内一氧化氮的诱导率。

药理试验表明，本发明所提供的具有含氟邻苯二酚结构的化合物——3-氟邻苯二酚具有以下药效：对结核分枝杆菌的生长具有直接的抑制作用；能够抑制巨噬细胞内结核分枝杆菌的增殖；能够提高结核杆菌感染巨噬细胞内一氧化氮的表达水平。另外，细胞毒性试验还表明，本发明所提供的具有含氟邻苯二酚结构的化合物——3-氟邻苯二酚未见明显毒副作用，细胞药效学试验中，在有效剂量范围内，细胞未出现明显的毒性变化。因此，本发明将对于研发新的抗结核药物具有重要意义。

附图说明

图1为供试药对结核分枝杆菌的直接抑制作用。其中，1-12依次表示浓度为624.512μM、312.256μM、156.128μM、78.064μM、39.032μM、19.516μM、9.758μM、4.879μM、2.440μM、1.220μM、0.610μM、0.305μM的化合物作用于牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG 1173P2。图中每个孔上的数值表示的是荧光值。

图2为供试药对巨噬细胞内结核分枝杆菌的抑制作用。

图3为供试药对结核分枝杆菌感染的巨噬细胞胞内一氧化氮诱导效应的测试结果。3-FC表示3-氟邻苯二酚。

图4为供试药对巨噬细胞的细胞毒性测试结果。3-FC表示3-氟邻苯二酚。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG 1173P2：由哈佛医学院Deborah Tan Hung馈赠，BCG 1173P2菌株中携带有pUV3583c-gfp质粒，能够表达绿色荧光蛋白(GFP)(参考文献：Abdel-Mageed WM,Ren B,et al.Endophytic Streptomyces sp.Y3111from traditional Chinese medicine produced antitubercular pluramycins.Appl Microbiol Biotechnol,2014,98:1077-85.)。

THP-1细胞：ATCC编号为TIB-202。

改良型1640培养基(Hyclone公司)。胎牛血清(Sera Pro，USA)。Middlebrook 7H9Broth(Becton,Dickinson and Company)。佛波酯(phorbol-12-myristate acetate，PMA，碧云天生物技术研究所)。MTT(Sigma-Aldrich，USA)。DMSO(Amersico公司)。3-氟邻苯二酚(纯度>99％，Sigma-Aldrich，USA)。DAF-FM DA(NO荧光探针，碧云天生物技术研究所)。Multilabel Reader(PerkinElmer，USA)。Multi-mode detection platform(SpectraMax Paradigm，Molecular Devices，USA)。

实施例1、供试药对结核分枝杆菌的直接抑制作用

供试药：3-氟邻苯二酚，Sigma-Aldrich产品，货号344656。

将牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG 1173P2调整菌液浓度至OD₆₀₀的读值为0.05(对应为1.5×10⁷CFU/mL)，接种于96孔板，每孔99μL。每孔加入供试药的2倍浓度梯度稀释液1.0μL，37℃共孵育72h，系列孵育体系中供试药的终浓度由小到大依次为0.305μM、0.610μM、1.220μM、2.440μM、4.879μM、9.758μM、19.516μM、39.032μM、78.064μM、156.128μM、312.256μM、624.512μM；同时设置阳性对照利福平组(即孵育体系中有BCG>

结果如图1所示。从图中可以看出，阴性对照二甲基亚砜组和0.305～156.128μM不同剂量的供试药孔均具有明显绿色荧光；而阳性对照利福平组和321.256μM及624.512μM的供试药孔均未呈现显著的绿色荧光。可见，供试药对BCG 1173P2菌株在312.256～624.512μM范围有直接抑制作用，且三次重复实验结果一致。

实施例2、供试药对巨噬细胞内结核分枝杆菌的抑制作用

供试药：3-氟邻苯二酚，Sigma-Aldrich产品，货号344656。

将THP-1细胞以5×10⁵个/mL的浓度接种于96孔板，每孔100μL，以终浓度100 ng/mL佛波酯(PMA)分化24h后细胞贴壁，得到THP-1细胞来源的巨噬细胞。采用牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium>

抑制率％＝(1-供试药荧光强度/利福平荧光强度)×100％

同时设阳性对照利福平组(细胞+BCG+利福平，即以等量利福平替代供试药)、模型组(DMSO组)(细胞+BCG+DMSO，即以等量DMSO替代供试药)和空白对照组(THP-1细胞来源的巨噬细胞未感染BCG 1173P2菌株)。

以供试药浓度的对数(Log₁₀[μM])为横坐标，以抑制率为纵坐标，得到图2，可见供试药在所示剂量范围内具有良好的量效关系。可见，供试药的浓度大于4.879μM时能抑制所述巨噬细胞内所述结核分枝杆菌的增殖。

采用Graphpad Prism软件Sigmoidal dose-response分析计算，得EC₅₀＝8.526μM，R²＝0.9208。

实施例3、供试药对结核分枝杆菌感染的巨噬细胞胞内一氧化氮诱导效应的测试

供试药：3-氟邻苯二酚，Sigma-Aldrich产品，货号344656。

将THP-1细胞以5×10⁵个/mL的浓度接种于96孔板，每孔100μL，以100ng/mL佛波酯(PMA)分化24h贴壁后，得到THP-1细胞来源的巨噬细胞。采用牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium>

诱导率％＝(供试药荧光值/利福平荧光值-1)×100％

同时设阳性对照利福平组(细胞+BCG+利福平，即以等量利福平替代供试药)。

结果如图3所示，供试药作用于BCG 1173P2感染的THP-1细胞来源的巨噬细胞6h时，NO诱导率达到峰值，以20μM剂量组最为显著。阳性对照利福平于作用12h 时达到峰值，其对NO的诱导作用迟于供试药，且作用强度不及供试药。

实施例4、供试药对巨噬细胞的细胞毒性测试

供试药：3-氟邻苯二酚，Sigma-Aldrich产品，货号344656。

将THP-1细胞以5×10⁵个/mL的浓度接种于96孔板，每孔100μL，以100ng/mL佛波酯(PMA)分化24h贴壁后，得到THP-1细胞来源的巨噬细胞。加入不同浓度供试药(2.440μM、4.879μM、9.758μM、19.516μM、39.032μM、78.064μM、156.128μM、312.256μM、624.512μM，各浓度均为供试药在体系中的终浓度)，继续孵育44h。加入5mg/mL>

同时设模型组(DMSO组，以等体积DMSO替代供试药，其余操作同药物处理组)和空白对照组(以等体积培养基替代供试药，其余操作同药物处理组)。

结果如图4所示，OD570值与细胞活性呈正比，即OD570值越大，细胞活性越强。从图中可见，供试药在2.44～624.512μM剂量范围内对THP-1细胞来源的巨噬细胞没有显示细胞毒性。