纳米氧化石墨烯在促进小鼠胚胎干细胞培养和自我更新中的应用

摘要

本发明涉及纳米氧化石墨烯在促进小鼠胚胎干细胞培养和自我更新中的应用。利用氧化石墨烯能够在不添加白血病抑制因子（LIF）的培养条件下，促进胚胎干细胞的自我更新，抑制细胞分化。氧化石墨烯表面具有多种官能团，拥有良好的生物相容性，低细胞毒性等特点，成本低廉，材料合成便捷，作用效果佳，为胚胎干细胞研究带来广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种纳米氧化石墨烯在促进小鼠胚胎细胞培养和自我更新中的应用。

背景技术

纳米技术是现代科学中新兴并高速发展的一个领域。在过去几年中，纳米技术被高效运用于生物医学研究中，为细胞成像，基因或其他小分子的运载以及组织工程中生物支架的制备提供了新的方法。

胚胎干细胞（ESCs）是从胚胎的囊胚期内细胞团中分离出来的细胞，因其同时具有无限增值能力和多向分化潜能而被广泛应用于生物医学和再生医学研究中。到目前为止，ESCs逐渐应用于临床疾病的治疗，如脊髓损伤、帕金森综合种、心肌梗塞以及肺纤维化等。因此，对ESCs增殖或分化的精确调控是当前研究的关键。研究表明，纳米技术与干细胞的结合可能为干细胞的培养及调控带来重大突破，之前研究主要集中于干细胞的分离示踪、药物和基因的运载。如今研究范围逐渐扩展于纳米材料对干细胞自我更新、分化以及细胞命运的调控上。相关研究表明，纳米层状双氢氧化物（LDH）具有代替白血病抑制因子LIF，维持小鼠胚胎干细胞的自我更新、抑制分化的作用。纳米层状双氢氧化物是一种阴离子无机片层状材料，因其具有良好的生物相容性和低毒性，被广泛应用于生物医学研究中。

氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO）是一种片层状材料，具有导电性、良好的生物相容性以及表面可修饰性，被越来越多的应用于生物学研究中。相关研究表明，氧化石墨烯对多种干细胞的增殖、分化具有调控作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种纳米氧化石墨烯在促进小鼠胚胎细胞培养和自我更新中的应用。

本发明提出的纳米氧化石墨烯在促进小鼠胚胎细胞培养和自我更新中的应用，具体步骤如下：

(１）通过差速贴壁法将正常培养的小鼠胚胎干细胞去除饲养层细胞，将其按照20000个/孔接种在铺有1%明胶的六孔板上；

（２）将步骤（１）得到的产物采用完全培养基培养24小时后，去除LIF因子，在完全培养基中添加纳米氧化石墨烯，始纳米氧化石墨烯终浓度维持在10μg/mL-40μg/mL，继续培养小鼠胚胎干细胞，添加纳米氧化石墨烯后48小时后，即可从形态上显示其能够维持小鼠胚胎干细胞的自我更新能力；其中：完全培养基由高糖DMEM；15％胎牛血清；0．1mmol／L非必需氨基酸；2mmol／L谷氨酰胺；0．1mmol／Lβ-巯基乙醇；1000U／mL白血病抑制因子组成。

通过碱性磷酸酶染色、Western Blot、荧光定量PCR(rt-PCR)以及免疫荧光染色，表明氧化石墨烯具有维持小鼠胚胎干细胞的自我更新力并抑制其分化的能力。

本发明的有益效果在于；本发明提出了纳米氧化石墨烯（GO）用于干细胞培养领域的新用途，在去掉饲养层细胞及无白血病抑制因子（LIF）存在的情况下，能够维持小鼠胚胎干细胞的自我更新能力。胚胎干细胞在长期培养过程中易发生分化，为了维持胚胎干细胞的自我更新能力，传统胚胎干细胞的培养需要依赖于饲养层细胞以及白细胞抑制因子，这使得胚胎干细胞的培养成本高昂，培养过程繁琐，本发明能够简化胚胎干细胞的培养流程，降低胚胎干细胞的培养成本。

附图说明

图1为氧化石墨烯的透射电镜图。

图2为不同浓度的氧化石墨烯分别处理胚胎干细胞24小时、48小时后对细胞产生毒性的MTT检测结果。其中：(ａ)为24小时，(ｂ)为48小时。

图3为不同浓度氧化石墨烯处理4天后的小鼠胚胎干细胞碱性磷酸酶染色。其中：(ａ)为培养液中加入LIF因子和（b）去除LIF因子作为对照组。氧化石墨稀加入后终浓度分别为(ｃ)4mg/mL 、(ｄ)8mg/mL 、(ｅ)16mg/mL、(ｆ)32mg/mL、(ｇ)40mg/mL。

图4为Western Blot检测小鼠胚胎干细胞多潜能性和自我更新相关蛋白的表达情况。

图5为免疫荧光染色检测多潜能基因的表达。其中：（a）、（b）、（c）、（d）图分别为不添加lif因子的条件下培养4天后的小鼠胚胎干细胞自我更新标记基因Nanog, Oct4, Sox2和 SSEA-1的表达情况，（e）、（f）、（g）、（h）图分别为去掉lif因子的条件下添加氧化石墨烯培养4天后的小鼠胚胎干细胞自我更新标记基因Nanog, Oct4, Sox2和 SSEA-1的表达情况。

具体实施方式

下面通过实施例结合附图进一步说明本发明。

实施例1：小鼠胚胎干细胞的培养及氧化石墨烯的作用流程操作

原代获取小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），培养至3-5代，经80kV的γ-射线处理30min后作为饲养层细胞，1周内使用。小鼠胚胎干细胞采用完全培养基：高糖DMEM，15%胎牛血清， 0.1mmol/L非必需氨基酸，2 mmol/L谷氨酰胺，0.1 mmol/Lβ-巯基乙醇，1000U/ml0.1白血病抑制因子，正常培养2-3天后，加胰蛋白酶（0.25%）-EDTA（0.02%）消化细胞，培养液中和胰酶后将细胞置于包被0.1%的培养皿上，静置培养30分钟。吸取未贴壁的mESC计数后，按照2×10⁴个/孔接种在铺1%明胶包被的六孔板上。

培养24小时后，去掉LIF因子，在培养液中加入粒径大小为200nm的氧化石墨烯溶液，使其终浓度在10-40μg/mL，每天更换具有相同浓度的氧化石墨烯的培养液，连续处理4天后，进行小鼠胚胎干细胞自我更新能力相关指标的检测。

实施例2：MTT法检测细胞存活率

mESCs经消化、吹打成单细胞，经差速贴壁法去除饲养层细胞后，按照2×10³个/孔的密度接种于包被明胶的96孔板上，每孔200>

实施例3：氧化石墨烯对小鼠胚胎干细胞自我更新的影响

（1）碱性磷酸酶（ALP）活性检测。未分化的胚胎干细胞的一个重要生物学特征是能够表达高浓度的碱性磷酸酶(AP)，通过碱性磷酸酶可以反应出胚胎干细胞的分化状态。对由实施1获得的mESC固定后进行碱性磷酸酶染色。如图2所示，从形态上，去除LIF因子的mESC已完全分化，加入氧化石墨烯的mESC维持未分化状态，且加入氧化石墨烯的mESC呈碱性磷酸酶强阳性；说明氧化石墨烯能够促进mESC的自我更新能力。

（2）Western Blot检测小鼠胚胎干细胞多潜能性和自我更新相关蛋白的表达。Nanog、Oct4、Sox2、Rex-1这些蛋白对ES细胞的自我更新具有重要的调控作用。WesternBlot能够检测这些蛋白的表达情况，反映细胞所处的状态。如图4所示，氧化石墨烯能够上调这四个基因的表达水平，促进了小鼠胚胎干细胞自我更新能力。

（3）免疫荧光在细胞水平上检测多潜能基因的表达。选用Rabbit anti-Nanog,Rabbit anti-Oct4, Rabbit anti-Sox2，Mouse anti-SSEA-1作为1抗，FluoresceinConjugated Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody和Fluorescein Conjugated GoatAnti- Mouse Secondary Antibody 作为2抗，DAPI进行细胞核染色，荧光显微镜观察染色情况。如图5所示，与对照组相比，氧化石墨烯能够促进Nanog、Oct4、Sox2和SSEA-1在细胞水平的表达。