一株对多主棒孢菌具备抑制作用的链霉菌及其应用

摘要

本发明公开了一株对多主棒孢菌具备抑制作用的链霉菌及其应用，所述的链霉菌为产褐黄色链霉菌（

说明书

技术领域

本发明属于农作物防治技术领域，具体涉及一株对多主棒孢菌具备抑制作用的链霉菌及其应用。

背景技术

多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)，隶属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、暗色菌科、棒孢属，是一种寄主范围广泛的世界性分布的植物病原真菌，是该属内发现最早、寄主范围最广的种。能侵染热带及亚热带地区近380个属内的530种植物，包括黄瓜、番茄、棉花、豇豆、大豆、木瓜、烟草和橡胶等(Smith,2008)。该病菌主要危害植物的叶片，形成典型具黄色晕圈的坏死斑，也可侵染根、茎、花和果实，严重时造成落叶、落果等现象。

1958年在印度首次报道了由多主棒孢菌引起的橡胶树棒孢霉落叶病(Ramakrishnan an d Pilla，1961)，20世纪50-80年代该病害在亚太和非洲的主要产胶地区相继发生，但是由于该病害的发生仅限于苗圃和幼小的植株上且为害不大，一直作为一种次要病害而未引起人们的关注。但是近年来病害调查发现，由多主棒孢菌引起的植物病害已经对世界上多类经济作物生产造成了严重影响，并造成巨大经济损失，如在南美地区多主棒孢菌引起口红花、一串红、一品红、水黄杨和黄瓜、番茄、辣椒等园艺作物的棒孢叶斑病；在美国中西部地区，主要引起大豆、豇豆和芝麻等作物的棒孢叶斑病，番茄种植地损失达11800千克/公顷(Pernez ny et al.，1996)，据估计，一旦发生严重的棒孢霉落叶病的为害，橡胶树产量损失将近20％；另外，在巴西、菲律宾、尼日利亚、印度以及韩国和日本等亚洲国家也有棒孢叶斑病的报道(Chee，1990)。

在我国，魏景超最早于1950年在黄河下游地区发现豇豆棒孢叶斑病，但由于豇豆种植面积有限，并未引起重视。20世纪90年代初，我国河南、辽宁等地黄瓜、茄子蔬菜栽培地受到多主棒孢的普遍侵染，造成了一定的经济损失。1994年的调查发现，黄瓜棒孢叶斑病在辽宁省沈阳、瓦房店和丹东等地普遍发生，但未扩展蔓延。但近几年，该病的危害呈明显的上升趋势，2005年至今，该病在山东、河北、北京、辽宁、吉林、河南、云南、海南等19个省市区大暴发，主要危害黄瓜、番茄、茄子、菜豆等蔬菜，每年发生面积超过1000万亩，损失超过50亿。而以保护地黄瓜危害最为严重，一般病田叶发病率为10％-25％，严重时可达60％-70％，甚至100％，由于棒孢叶斑病在我国蔬菜和橡胶种植区危害严重，并已经造成了重大经济损失，严重制约了我国蔬菜和橡胶产业的发展。如果该病不能得到有效的控制，将对我国黄瓜、番茄和茄子等重要蔬菜和橡胶产业造成毁灭性的打击。

目前，化学防治仍然是防治该病害的主要手段，其具有使用范围广、见效快、使用方便，能及时有效的控制如作物棒孢叶斑病这种突发性的病害。国外早先已经开展了防治橡胶棒孢叶斑病杀菌剂的筛选与应用研究，推荐较好的药剂有多菌灵、甲基硫菌灵和代森锰锌。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂在日本已经应用于蔬菜棒孢叶斑病的防治，2006年日本就将啶酰菌胺登记为防治黄瓜棒孢叶斑病的药剂，并取得了良好的防治效果(Miyamoto et al.，2009)。

虽然化学药剂在作物棒孢叶斑病的防治中起到了重要的作用，但是由于其频繁的使用，也产生了抗药性的问题，早在1979年，日本西部大分县黄瓜棒孢叶斑病已经成为当地黄瓜生产的重要病害，最初使用苯并咪唑类杀菌剂进行防治取得了良好的效果，但是由于抗药性的产生防效开始下降(Hasama，1991)。2006年7月，啶酰菌胺在日本作为日本防治黄瓜棒孢叶斑病的登记药剂，随后对其敏感性进行了监测，在对438个黄瓜棒孢叶斑病的菌株抗药性的检测中发现，214株对啶酰菌胺产生抗药性，抗性频率高达49％(MIC>30μg/ml)，其中189个菌株为中抗菌株(EC₅₀1.1-6.3μg/ml)，25个菌株为超高抗菌株(EC₅₀>24.8μg/ml)(M>

针对我国作物棒孢叶斑病对微管蛋白抑制剂多菌灵和乙霉威抗药性也有相关进的系统研究。研究表明我国多主棒孢菌对多菌灵抗性频率极高，而对多菌灵和乙霉威双抗频率较低。对采自我国12个地区，18个寄主的163株多主棒孢菌对多菌灵和乙霉威的敏感性进行分析，145个菌株对多菌灵具有抗药性，抗性频率高达89.0％。仅18个菌株对多菌灵敏感，占供试菌株的11.0％。24个菌株对多菌灵和乙霉威具有双重抗药性，双抗频率为14.7％(Huang et al.，2013)。从研究中可知，尽管多菌灵没有作为棒孢叶斑病的登记药剂，但实际上已经产生非常严重的抗药性。

放线菌(Actinomycetes)是自然界一种非常重要的微生物类群，属于原核生物的一个类群。放线菌目(Actinomyeetales)。其在自然界中非常丰富，在作物病害防治方面具有巨大的使用价值和经济价值，其产生的代谢产物(尤其是抗生素)在作物病害防治中发挥了重大作用，抗生素具有高效、低毒、易降解、无残留、对环境友好等特点，这是化学农药没有的，近年来，国内外均不断发现新的抗生素种类，如井冈霉素、春雷霉素、宁南霉素、武夷霉素和中生菌素等。但目前分离到的放线菌仅为实际种类的0.1-1％，因此其具有很大的应用和开发空间，目前还没有放线菌活菌制剂及其产生的抗生素防治棒孢叶斑病的报道。开发出防治作物棒孢叶斑病的新型杀菌剂具有重大的实践意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对多主棒孢菌具备抑制作用的链霉菌，所述的链霉菌为产褐黄色链霉菌(Streptomyces phaeoluteichromatogenes)HEBRC-45958，保藏编号为：CCTCC NO：M2015768。该菌株对多主棒孢菌具备抑制作用，可用于植物棒孢叶斑病的防治。

本发明的另一个目的在于提供了链霉菌HEBRC-45958的制备方法，方法简单，易行，利用该方法制得的发酵液，有效物质含量高，具备良好的生产前景。

本发明的最后一个目的在于提供了链霉菌HEBRC-45958在制备防治植物棒孢叶斑病药物中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案来实现。

一株对多主棒孢菌具有良好抑制作用链霉菌，从武汉东湖磨山采集的土壤中分离，经16s rDNA鉴定后属于产褐黄色链霉菌(Streptomyces phaeoluteichromatogenes)，已于2015年12月23日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：产褐黄色链霉菌(Strept omyces phaeoluteichromatogenes)HEBRC-45958；保藏编号为CCTCC NO：M2015768；地点：中国，武汉，武汉大学。

产褐黄色链霉菌(Streptomyces phaeoluteichromatogenes)HEBRC-45958在ISP-2培养基上生长良好，菌落褐黄色，孢子表面光滑。

产褐黄色链霉菌HEBRC-45958的制备方法，包括：

将产褐黄色链霉菌HEBRC-45958种子液按3-10％(V/V)的接种量转入发酵培养基中。温度为28℃，发酵罐的搅拌速度200-500转/分，发酵培养基的装量为罐体容积的60％-80％；发酵4-6天即可；

所述的发酵培养基的配方包括：甘露醇1-3％、大豆蛋白胨1-3％、酵母粉0.3-0.5％、碳酸钙0.3-0.5％、氯化钠0.3-0.8％；pH值6.5-7.5，其余为水，以上均是质量比。

优选的，所述的链霉菌HEBRC-45958种子液的制备方法包括:

将斜面保存菌种在ISP-2平板活化，挑取接种至100毫升种子培养基中，在28℃，130-160转/分的摇床上培养3-4天；既得种子液。

所述的种子培养基的配方与发酵培养基相同。

产褐黄色链霉菌HEBRC-45958在制备防治植物棒孢叶斑病药物中的应用，包括将该菌株的发酵液或是发酵液稀释后直接喷洒于植物叶部和/或茎部，或是与其他有效成分制成复合制剂以防治多种植物病害，优选的，发酵液与水按1：20-1:100(体积比)稀释。

只要是由多主棒孢菌引起的棒孢叶斑病均可用本发明提供的产褐黄色链霉菌HEBRC-45958制备的制剂进行防治。

所述的植物包括但不限于黄瓜、番茄，茄子和橡胶树。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)首次报道链霉菌应用于防治植物棒孢子叶斑病，其与现有杀菌剂无交互抗药性。

(2)与目前使用化学合成杀菌剂防治相比，由于其来自于自然环境，具有高效、低毒、不污染环境和不易产生抗药性等优点。

附图说明

图1为HEBRC-45958菌株在ISP-2培养基上的孢子及菌落形态。

左图为菌株HEBRC-45958显微镜(1000X)观察照片，右图为菌株HEBRC-45958的平板菌落形态。

图2为HEBRC-45958与多主棒孢菌(C.cassiicola)对峙培养。

图3为显微镜下对照和处理菌丝形态。

图4为HEBRC-45958发酵液对番茄棒孢叶斑病防治效果。

图5为HEBRC-45958发酵液对茄子棒孢叶斑病防治效果。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

一株对多主棒孢菌具有良好抑制作用链霉菌，从武汉东湖磨山采集的土壤中分离，经16s rDNA鉴定后属于产褐黄色链霉菌(Streptomyces phaeoluteichromatogenes)，已于2015年12月23日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：产褐黄色链霉菌(Streptomy ces phaeoluteichromatogenes)HEBRC-45958；保藏编号为CCTCC NO：M2015768；地点：中国，武汉，武汉大学。在本发明中，产褐黄色链霉菌(Streptomyces phaeoluteichromatoge nes)HEBRC-45958或被称为HEBRC-45958。

形态特征：在ISP-2培养基上生长良好，菌落褐黄色，孢子表面光滑(图1)。

菌株生理生化特性：

表1 HEBRC-45958菌株碳源利用

+：阳性，-：阴性

实施例2：

产褐黄色链霉菌HEBRC-45958的制备方法，包括：

将斜面保存菌种在ISP-2平板活化，挑取接种至100毫升种子培养基中，在28℃，160转/分的摇床上培养4天；既得种子液。

所述的种子培养基的配方与发酵培养基相同。

将链霉菌HEBRC-45958种子液按5％(V/V)的接种量转入发酵培养基中。温度为28℃，发酵罐的搅拌速度300转/分，发酵培养基的装量为20L罐体容积的80％；发酵6天即可；制得的发酵液用于实施例4。

所述的发酵培养基的配方包括：：甘露醇2％、大豆蛋白胨1.5％、酵母粉0.3％、碳酸钙0.5％、氯化钠0.5％；pH值7，以上均为质量比，其余为水。

实施例3：

产褐黄色链霉菌(S.phaeoluteichromatogenes)HEBRC-45958对多主棒孢菌(C.cassii cola)离体抑制效果：

将斜面保存HEBRC-45958菌株在ISP-2平板活化，28℃培养4d，用打孔器打取4mm大小菌碟，放置于PDA平板中央。将斜面保存多主棒孢菌(C.cassiicola)在PDA培养基活化5d，打取4mm菌碟在距HEBRC-45958菌碟四周25mm处放置四个，对峙培养7d后观察抑菌带。挑取多主棒孢菌(C.cassiicola)与HEBRC-45958对峙边缘菌丝，在显微镜下处理与对照菌丝形态差别。

HEBRC-45958与多主棒孢菌(C.cassiicola)对峙产生明显的抑菌带，抑菌带宽度25mm(图2)，具有强烈的抑制作用，与对照菌丝相比，处理菌丝发生了扭曲、肿胀和变形(图3)。

实施例4：

产褐黄色链霉菌(S.phaeoluteichromatogenes)HEBRC-45958防治作物棒孢叶斑病效果：

将番茄和茄子种子催芽，分别播种于32孔和72孔穴盘，温室常规管理，生长20d后用于盆栽试验。供试病原菌分离自田间发生棒孢叶斑病的的番茄和茄子，并在4℃条件下保存于PDA斜面中。将其活化，在PDA培养基扩繁，28℃光照培养12d，加入无菌水用刷子刷取孢子，使用纱布过滤。血球计数板观察孢子数，使用无菌水将孢子浓度调节到1×10⁵/ml，加入终浓度为0.1％吐温80作为分散剂。

将实施例2制备的HEBRC-45958发酵液稀释50倍，喷洒于番茄和茄子叶部至滴水，24h后喷施番茄和茄子棒孢叶斑病菌孢子悬浮液至叶面饱和。以喷施50％啶酰菌胺水分散粒剂作为对照药剂，有效成分浓度为333.3μg/ml。喷施清水作为空白对照，每个处理三次重复。在人工气候箱28℃保湿培养。4d后统计对照和各处理病情指数，并计算防效。番茄和茄子棒孢叶斑病病情指数分级标准如下(Ishii et al.，2007)。

0级：无病害症状

0.1级：病斑小于叶面积1％

0.5级：病斑占叶面积1％-5％之间

1级：病斑占叶面积6％-10％之间

2级：病斑占叶面积11％-20％之间

3级：病斑占叶面积21％-30％之间

4级：病斑占叶面积31％-40％之间

5级：病斑占叶面积41％-50％之间

6级：病斑占叶面积51％-60％之间

7级：病斑占叶面积61％-70％之间

8级：病斑占叶面积71％-80％之间

9级：病斑占叶面积81％-90％之间

10级：病斑大于叶面积90％以上

根据表2和3可知，HEBRC-45958发酵液稀释50倍对番茄和茄子棒孢叶斑病具有良好的防治效果(图4，5)，防效分别达到88.53％和91.64％，与对照化学药剂啶酰菌胺防效相当。

表2 HEBRC-45958对番茄棒孢叶斑病防治效果

处理病情指数防效(％)HEBRC-4595811.1188.53啶酰菌胺12.3487.26清水对照96.88-

表3 HEBRC-45958对茄子棒孢叶斑病防治效果

处理病情指数防效(％)HEBRC-459587.3391.64啶酰菌胺9.4189.27清水对照87.67-