一种减少液体菌种培养过程操作污染的方法

摘要

本发明公布了一种减少液体菌种培养过程操作污染的方法，包括以下操作步骤：1）配制培养基，将培养基原料煮好后分装到培养管中；2）消毒灭菌，在温度120℃、压力0.12MPa下灭菌30—45分钟；3）接种，在无菌条件下，从培养管中选取菌种块置于培养瓶中，封口，同时将连接管插入培养瓶的管口内，封口，在18—20℃下培养，培养3—5天即可。本发明所述的蛹虫草菌丝体的培养方法，可应用于其他液体菌种的培养，培养过程中仅有一次开口，无其他开口，培养在无菌密闭环境下进行，有效解决培养过程中的操作污染问题。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物培养技术领域，具体涉及一种减少液体菌种培养过程操作污染的方法。

背景技术

液体菌种是指用液体培养基，在生物发酵罐中，经过深层培养技术生产的液体形态的食用菌菌种。

在蛹虫草菌丝体等液体菌种在培养过程中，容易引入操作污染，最终造成培养的蛹虫草菌丝体中含有较多杂菌，且现有培养过程中，操作污染不可控制，无法得到解决。

而引入操作污染的方法较多，工作人员在操作过程中无法做到一一排查，很难提高最终成品菌种的纯度。

基于此，研究并开发设计一种减少液体菌种培养过程操作污染的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有蛹虫草菌丝体等液体菌种培养过程中引入污染最终导致成品中含杂菌较多，影响产品纯度。本发明的目的在于提供一种减少液体菌种培养过程操作污染的方法，解决了培养过程中操作污染的技术问题。

本发明通过下述技术方案实现：

一种减少液体菌种培养过程操作污染的方法，包括以下操作步骤：

)配制培养基

将配制好的培养基分装到培养管中；

2)消毒灭菌

对培养管中的培养基灭菌30—45分钟；

3)接种

在无菌条件下，将第一连接管的两端分别插入至第一培养瓶、第二培养瓶中，从培养管中选取菌种块通过第一培养瓶的开口置于第一培养瓶的瓶内，封口，第一培养瓶内装有固体培养基，第二培养瓶为空瓶，第一培养瓶内接种后，第一培养瓶内固体培养基通过第一连接管移入第二培养瓶中，在18—20℃下培养，培养3—5天即可；

第三培养瓶中装入液体培养基，第二培养瓶与第三培养瓶通过第二连接管连接，待第一培养瓶、第二培养瓶内有菌落出现时，将第三培养瓶中的液体培养基分别反压至第一培养瓶、第二培养瓶内进行深层培养，然后将第一培养瓶、第二培养瓶内培养好的菌种通过密闭管道反压至发酵罐中培养。

在这个培养过程中，仅存在一次开口，即在将培养管中的菌种块置于第一培养瓶瓶内这一操作中，在后续处理操作中将第一培养瓶内的固体培养基通入第二培养瓶，第三培养瓶的液体培养基分别反压至第一培养瓶、第二培养瓶内，的操作均通过消毒灭菌处理的连接管完成，未对第一培养瓶、第二培养瓶、第三培养瓶进行开口操作过。同时，培养过程中应用到的容器、连接管均经过灭菌彻底处理，确保未引入污染。因此，整个操作过程中，有效避免了培养过程引入操作污染的问题，从根本上解决了液体菌种培养过程中操作污染引入的路径。

本发明技术方案中，第三培养瓶的类型还可为发酵罐，将接种后的第一培养瓶、第二培养瓶可直接压入发酵罐中进行菌落大规模培养，实现全程控制无污染大生产。整个操作过程中，涉及到的容器均经过消毒灭菌处理，未引入操作污染，从而避免其中操作污染问题。

在本技术方案中，第一培养瓶内接种的固体培养基，还可将其引入多个培养瓶内，进行接种，如第一培养瓶内的固体培养基通过消毒灭菌后的连接管分别通入至第一个培养瓶、第二个培养、第三个培养瓶、第四个培养瓶至第N个培养瓶，然后将装有液体培养基的培养瓶内的培养基通过灭菌消毒后的连接管分别通入至上述已经装有固体培养基的第一个培养瓶、第二个培养瓶、第三个培养瓶至第N个培养瓶进行深层培养，经深层培养后，再输送至发酵罐中进行扩大规模培养。

上述描述中涉及到深层培养方法为菌种接种到发酵容器内，使菌液细胞游离悬浮在液体培养基中，并进行生长培养的一种方法，该方法的具体操作步骤及其原理为所属领域的公知常识，不再详述。

优选，所述菌种块面积为4mmx5mm—6mmx6mm，在接种过程中，从培养管中选取的菌种块的面积，可根据需要进行调整，只要能满足接种的要求。

菌种块面积为4mmx5mm—6mmx6mm，接种到第一培养瓶内，选取的接种量不宜过大或过小，需满足将其接种到第一培养瓶内后，能够更好的萌发，促进菌种的生长。

优选，所述培养管中选取的培养基体积为每支培养管体积的1/5-1/4。

优选，所述步骤2)消毒灭菌的温度为121℃、压力为0.12MPa。对培养管中的培养基进行彻底消毒灭菌，避免在培养过程中引入污染。

优选，所述步骤2)中，培养管经消毒灭菌，培养管与水平线呈15—45°，在室温下，开始接种，在恒温振荡器中于23—24℃下静置培养。

优选，所述接种是在超净工作台上操作。超净工作台在进行操作前采用紫外灯消毒灭菌，从使用的容器上避免引入污染的路径。

优选，所述接种前对超净工作台紫外灯消毒20—30min。

优选，所述第一培养瓶、第二培养瓶、第三培养瓶、第二连接管、第二连接管、培养管均经过消毒灭菌处理。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

(1)本发明采用的液体菌种的培养方法，整个培养过程实现零污染，培养获得的蛹虫草菌丝体等液体菌种为纯度100％成品，无杂菌。

(2)本发明所述的液体菌种培养过程中减少操作污染的方法，可应用于大规模液体菌种的培养，且培养过程中仅有将培养管中的培养基接种到培养瓶中操作中的一次开口，其他操作中均不存在开口的操作，且其他相关操作均规范，有效避免在操作过程中引入操作污染的问题。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明中培养装置结构示意图；

附图中标记及相应的零部件名称：

1-第一培养瓶，2-第一连接管，3-第二培养瓶，4-第三培养瓶，5-第二连接管。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1：

一种减少液体菌种培养过程操作污染的方法，包括以下操作步骤：

以蛹虫草菌丝体培养方法为例：

1)配制培养基

1L培养基中原料：土豆100-200g、葡萄糖20—30g、琼脂20-30g，将培养基原料煮好后分装到培养管中；

培养基的原料还可为1L培养料中原料：土豆200g，麸皮15g，葡萄糖25g,琼脂15g，硫酸镁0.4g，将培养料煮好后分装到培养管中，培养管为规格为15x20cm试管。

2)消毒灭菌

在温度120℃、压力0.12MPa下灭菌30—45分钟；

3)接种

如图1所示，在无菌条件下，将第一连接管2的两端分别插入至第一培养瓶1、第二培养瓶3中，从培养管中选取菌种块通过第一培养瓶1的开口置于第一培养瓶1的瓶内，封口，第一培养瓶1内装有固体培养基，第二培养瓶3为空瓶，第一培养瓶1内接种后，第一培养瓶1内固体培养基通过第一连接管2通入第二培养瓶3中，在18—20℃下培养，培养3—5天即可；

第三培养瓶3中装入液体培养基，第二培养瓶3与第三培养瓶4通过第二连接管5连接，待第一培养瓶1、第二培养瓶3内有菌落出现时，将第三培养瓶4中的液体培养基分别反压至第一培养瓶1、第二培养瓶3内进行深层培养，然后将第一培养瓶1、第二培养瓶3内培养好的菌种通过密闭管道反压至发酵罐中培养；

其中，所述菌种块面积为4mmx5mm—6mmx6mm。

其中，所述步骤2)中消毒灭菌的温度为121℃、压力为0.12MPa。

其中，所述培养管中选取的培养基体积为每支培养管体积的1/5-1/4。

其中，所述步骤2)中，培养管经消毒灭菌后，培养管与水平线呈15—45°，即成斜面，在室温下，开始接种，然后在恒温振荡器中于23—24℃下静置培养。

其中，所述接种是在超净工作台上操作。

其中，所述第一培养瓶1、第二培养瓶3、第三培养瓶4、第二连接管2、第二连接管5、培养管均经过消毒灭菌处理。

其中，所述接种前对超净工作台紫外灯消毒25—30min。

其中，所述第一培养瓶1、第二培养瓶3、第三培养瓶4、第二连接管2、第二连接管5、培养管均经过消毒处理。

将培养的蛹虫草菌丝体采用常规方法检测，如根据蛹虫草菌丝体的形态特征在显微镜下观察，成品中是否含有其他杂质。

除了采用显微镜根据菌种的形态观察确定最终培养获得的产品是否有杂质外，还可通过根据具体培养的菌种的物理化学方法进行检测，确定其纯度，是否含有其他杂质。

采用上述方法检测结果：本实施例1所述的培养方法获得的菌种中未含有与菌种无关的杂菌。

将步骤3)进入发酵罐内进行接种培养获得的用蛹虫体菌丝体，与采用常规方法进行培养获得的蛹虫体菌丝体，进行污染率、出菌丝率等参数的比较。

其中现有常规方法培养具体操作过程：配制好培养基后，消毒灭菌，并分装到培养管中，冷却。然后采用接种钩从培养管中选取一团芝麻大小的菌丝团，接种到培养瓶内，接入到多个培养瓶时，均采取从培养管中选取菌丝团的方式，进行接种，在这个过程中均需要打开培养瓶的开口，进行接种培养。

常规操作方法与本实施例所述操作方法培养获得的蛹虫体菌丝体的检测参数如下表1所示，

菌种参数传统培养方法本发明所述培养方法出菌丝时间(h)2010接种量30—40g20—25g出菌丝温度(℃)16—2016—20菌丝培养时间(h)3015菌丝培养温度(℃)20—2523—24污染率(％)100

可知，采用本实施例所述的培养方法获得的蛹虫草菌丝体与传统常规操作方法培养获得的成品蛹虫草菌丝体相比，采用本实施例培养制备获得的菌丝体中无杂菌，整个培养过程零污染。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。