一种酶法制备脂肪酸单乙醇酰胺的方法

摘要

本发明公开了一种酶法制备脂肪酸单乙醇酰胺的方法，将脂肪酸或其衍生物和单乙醇胺按照一定比例，在无溶剂或有溶剂体系下混合充分，加入一定量的脂肪酶，在一定温度下搅拌反应一段时间，制备脂肪酸单乙醇酰胺。本发明采用脂肪酸或其衍生物作为酰胺化反应制备脂肪酸单乙醇酰胺的酰基供体，利用酶的专一高效的特性，一步合成脂肪酸单乙醇酰胺，具有反应条件温和，副产物少等诸多优点，其应用潜力巨大。

说明书

技术领域

本发明属于有机化学中的脂肪酸酰胺类化合物的制备技术领域，具体涉及一种酶法制备脂肪酸单乙醇酰胺的方法。

背景技术

脂肪酸乙醇酰胺是种类繁多的表面活性剂中应用十分广泛的一种非离子型表面活性剂。近来国内外研究结果表明日用液体洗涤剂中常见的二乙醇酰胺系列表面活性剂中含有的游离二乙醇胺有明显的致癌活性，故掀起了大力开发以脂肪酸单乙醇酰胺代替脂肪酸二乙醇酰胺的狂潮。在相同浓度下，脂肪酸单乙醇酰胺表现出与脂肪酸二乙醇酰胺相同或更优的性能。脂肪酸单乙醇酰胺与其他表面活性剂配伍使用，具有优良的起泡性、泡沫稳定性和增稠性、良好的湿润性、渗透性和抗硬水性及一定的防锈抗静电的作用，被广泛地应用于洗涤剂、化妆品、纺织和印染助剂、医药、橡胶工业等许多领域。

近年来，在动植物组织中发现并证明某些脂肪酸单乙醇酰胺作为一种内源性信号分子具有某些特定的生物学活性。最早受到关注的一种脂肪酸单乙醇酰胺是存在于大豆油、花生油和蛋黄中的棕榈酸单乙醇酰胺，其具有抗炎和减轻疼痛的作用(Kuehl et al.,J.Am.Oil Chem.Soc.1957,79,5577-5578；Calignano et al.,Nature 1998,394,277-281.)。硬脂酸单乙醇酰胺在促进细胞凋亡、抑制食欲及消炎方面发挥作用(Okamoto etal.,Chem.Biodivers.2007,4,1842-1857；Ezzili et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.2010,20,5959-5968.)。油酸单乙醇酰胺可通过调节脂质代谢来达到减轻体重的目的(Thabuiset al.,Lipids 2008,43:8878-94；Astarita et al.,J Pharmacol Exp Ther,2006:318-563.)。研究发现，作为一种内源性大麻素类似物的花生四烯酸单乙醇酰胺，其含量的改变在许多疾病中可能扮演了疾病前兆性指示物或疾病发生标志物的角色(Maccarrone etal.,Mol.Hum.Reprod.2002,8(2):188-95；Blfiher et al.,Diabetes.2006,11:3053-3060；De et al.,Lipids Health Dis.2003,2(2)：2942-2942；Koppel et al.,LipidsHealth Dis.2009；8:2.)。而二十碳五烯酸单乙醇酰胺也表现出抗癌、抑制增殖和抗炎活性(Rovito et al.,J.Cell.Physiol.2013,228(6)1314-1322；Brown et al.,Carcinogenesis,2010,31(9):1584-1591；Balvers et al.,Biochim.Biophys.Acta,2010,1801(10):1107-1114.)。

脂肪酸单乙醇酰胺的制备方法分为化学法和酶法。近年来，酶作为催化剂在有机合成中的应用正日益受到广泛的关注。与传统的化学法相比，酶促反应条件更加温和，酶的选择性更好并能提高原子经济性，从而减少副产物的产生和提高产品的质量。而脂肪酶在有机溶剂中表现出良好的稳定性、完全的催化活性及广泛的适用范围，因而应用最为广泛。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有酶法制备脂肪酸单乙醇酰胺的方法中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种酶法制备脂肪酸单乙醇酰胺的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种酶法制备脂肪酸单乙醇酰胺的方法，其特征在于，包括，将游离脂肪酸或游离脂肪酸衍生物与单乙醇胺，按摩尔比为1:1～4在无溶剂或有溶剂体系下混合充分后，加入脂肪酶，在10～90℃搅拌反应，去除有机溶剂，得到脂肪酸单乙醇酰胺产物。

作为本发明所述酶法制备脂肪酸单乙醇酰胺的方法的一种优选方案，其中：所述脂肪酸衍生物为甘油一酯、甘油二酯、脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯或脂肪酸乙烯酯中的一种或几种。

作为本发明所述酶法制备脂肪酸单乙醇酰胺的方法的一种优选方案，其中：所述游离脂肪酸或脂肪酸衍生物，其中，所述脂肪酸包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸中的一种或几种；所述脂肪酸衍生物包括月桂酸衍生物、肉豆蔻酸衍生物、棕榈酸衍生物、硬脂酸衍生物、油酸衍生物、亚油酸衍生物、亚麻酸衍生物、花生四烯酸衍生物、二十碳五烯酸衍生物、二十二碳五烯酸衍生物或二十二碳六烯酸衍生物中的一种或几种。

作为本发明所述酶法制备脂肪酸单乙醇酰胺的方法的一种优选方案，其中：所述脂肪酶为Novozym 435、Lipozyme 435、Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM或NS40086中的一种或几种，其加入量占反应底物总质量的3％～20％。

作为本发明所述酶法制备脂肪酸单乙醇酰胺的方法的一种优选方案，其中：所述脂肪酶为Novozym 435或Lipozyme 435，其加入量占反应底物总质量的3％～20％。

作为本发明所述酶法制备脂肪酸单乙醇酰胺的方法的一种优选方案，其中：所述搅拌反应，其是在转速为200～700rpm的条件下，反应0.15～24h。

作为本发明所述酶法制备脂肪酸单乙醇酰胺的方法的一种优选方案，其中：所述有机溶剂包括正己烷、异辛烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、氯仿或二氯甲烷中的一种或几种，其添加量与混合液的体积比为1～10：1。

作为本发明所述酶法制备脂肪酸单乙醇酰胺的方法的一种优选方案，其中：所述去除有机溶剂，其是在40～50℃，真空度为0.098MPa条件下通过减压蒸发去除有机溶剂。

作为本发明所述酶法制备脂肪酸单乙醇酰胺的方法的一种优选方案，其中：所述游离脂肪酸衍生物为二十碳五烯酸乙酯，所述脂肪酶为Lipozyme 435，其中，所述二十碳五烯酸乙酯与单乙醇胺的摩尔比为2：3；所述Lipozyme 435，其添加量为底物总质量的10％；保持整个体系在45℃、700rpm的条件下，搅拌反应2h，减压抽滤去除脂肪酶。

作为本发明所述酶法制备脂肪酸单乙醇酰胺的方法的一种优选方案，其中：所述游离脂肪酸衍生物为硬脂酸乙烯酯，所述脂肪酶为Novozym 435，所述有机溶剂为正己烷，其中，所述硬脂酸乙烯酯与单乙醇胺的摩尔比为1：1；所述Novozym 435，其添加量为底物总质量的20％；保持整个体系在60℃、500rpm的条件下，搅拌反应5h，减压抽滤去除脂肪酶，正己烷于50℃，真空度为0.098MPa通过减压蒸发去除。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供了一种酶法制备脂肪酸单乙醇酰胺的方法，优选游离脂肪酸或脂肪酸衍生物为酰基供体制备脂肪酸单乙醇酰胺，通过利用底物物质特性，使得合成工艺简单，反应效率很高，脂肪酸单乙醇酰胺的含量最高可达92.18％。

(2)本发明提供了一种酶法制备脂肪酸单乙醇酰胺的方法，与化学法相比，酶法制备方法具有反应条件更加温和，选择性更好，催化效率更高，催化剂容易移除，副产物更少，产品质量更好等优点。

(3)本发明提供了一种酶法制备脂肪酸单乙醇酰胺的方法，进一步优选了脂肪酶催化剂Novozym 435和Lipozyme 435，这两种酶相较于Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM或NS40086在本反应合成脂肪酸单乙醇酰胺中表现出更好的性能，这主要取决于反应底物如单乙醇胺和所采用溶剂体系的极性大小对上述几种脂肪酶的催化活性和稳定性的影响。

(4)采用不同酰基供体作为底物来酶法合成脂肪酸单乙醇酰胺的创新性在于：不像甘油三酯，使用甘油一酯和甘油二酯作为酰基供体是因为它们与乙醇胺具有很好的互溶性，在反应的过程中，呈均相反应，反应效率高。而当使用甘油三酯作为酰基供体的时候，乙醇胺和甘油三酯不溶，反应过程中呈现两相反应，底物接触效果差，反应效率低。另外，使用乙烯酯作为酰基供体的时候，由于反应后，生成甲醛，甲醛的沸点低(19.8℃)，在室温下就会挥发，使得酰胺化反应不断的向正反应方向进行，所以乙烯酯作为反应酰基供体，酶法酰胺化反应是不可逆的，反应效率特别高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为实施例1中花生四烯酸(ARA)与单乙醇胺酰胺化产物花生四烯酸单乙醇酰胺(AEA)的正相液相色谱示意图。

图2为实施例2中棕榈酸单甘酯(P-MAG)与单乙醇胺酰胺化产物棕榈酸单乙醇酰胺(PEA)的正相液相色谱示意图。

图3为实施例2中棕榈酸单甘酯(P-MAG)与单乙醇胺酰胺化产物棕榈酸单乙醇酰胺(PEA)的核磁共振氢谱图。

图4为实施例3中二十碳五烯酸乙酯(EPA-EE)与单乙醇胺酰胺化产物二十二碳五烯酸单乙醇酰胺(EPEA)的正相液相色谱示意图。

图5为实施例3中二十碳五烯酸乙酯(EPA-EE)与单乙醇胺酰胺化产物二十二碳五烯酸单乙醇酰胺(EPEA)的核磁共振氢谱图。

图6为实施例4中硬脂酸乙烯酯与单乙醇胺酰胺化产物硬脂酸单乙醇酰胺的气相色谱示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

1、反应温度

反应中温度的控制非常重要，由于酶促催化反应是一个热动力学过程，影响着酶的催化活性、底物的溶解状态及粘度、底物和产物的传质速度等。温度太低，不利于达到反应所需的活化能，脂肪酶不能与底物有效结合，反应速率较低，反应时间延长，产物中脂肪酸单乙醇胺较少；温度太高，则会导致脂肪酶变性，降低酶活。

2、反应时间

酯交换反应包括催化剂接入、形成中间体、另一脂肪酸的接入以及催化剂的断开四个阶段，整个过程需要一定的时间。时间不足，则这一反应过程还无法达到平衡，时间过长，则不但无益于脂肪酸单乙醇胺含量的增加，反而还会增加副反应的程度，不利于产品的质量。

3、脂肪酶添加量

加酶量的大小和反应速度直接相关，如果底物的量能够保持足够大，且反应速度与酶量也符合动力学关系，当酶量增加时，反应速度亦随之增大。脂肪酶添加量太少，则降低反应速率。脂肪酶添加量过多，也就是底物含量相对较低时，虽然这时反应速度也随着增大，但底物和产物的传质阻力的影响已开始大于酶反应催化速度的影响，其反应速度的增量减少，酶的催化效率降低。

4、搅拌速率

发明人研究发现，随着反应的进行，一定速率的搅拌对酶法合成反应的形成具有促进作用，但过搅拌速率过高却反而不利于目标产物的生成。不同搅拌速率下，样品的硬度等存在差异可能与其微观交联度有关。同时交联结构的强度和数量也直接影响到体系的粘弹性能。借助于其相同条件下粘弹性能的变化，能进一步阐明搅拌剪切对脂肪酸单乙醇胺质构的影响。

实施例1

在反应釜中加入1mmol花生四烯酸、1.5mmol单乙醇胺和4mL异辛烷，在500rpm转速搅拌下加入占混合物质量百分比为8％的Lipozyme TL IM，50℃温度下反应24h。减压抽滤去除反应体系中的脂肪酶。体系中的异辛烷于50℃，真空度为0.098MPa下通过减压蒸发去除。用混合溶剂(正己烷:异丙醇＝1：1,v/v)将反应产物溶解并稀释至合适浓度，经HPLC-ELSD分析，花生四烯酸单乙醇酰胺的产率为92.18％。

实施例2

在反应釜中加入1mmol棕榈酸单甘酯、2.5mmol单乙醇胺和6mL石油醚和正己烷的混合溶剂(1：1，v/v)，在300rpm转速搅拌下加入占混合物质量百分比为15％的Lipozyme RMIM，70℃温度下反应12h。减压抽滤去除反应体系中的脂肪酶，混合溶剂于50℃，真空度为0.098MPa下通过减压蒸发去除。用混合溶剂(正己烷:异丙醇＝1：1,v/v)将反应产物溶解并稀释至合适浓度，经HPLC-ELSD分析，棕榈酸单乙醇酰胺的产率为57.63％。

实施例3

在反应釜中加入1mmol二十碳五烯酸乙酯、1.5mmol单乙醇胺，在700rpm转速搅拌下加入占混合物质量百分比为10％的Lipozyme 435,45℃温度下反应2h。减压抽滤去除反应体系中的脂肪酶。用混合溶剂(正己烷:异丙醇＝1：1,v/v)将反应产物溶解并稀释至合适浓度，经HPLC-ELSD分析，二十碳五烯酸单乙醇酰胺的产率为77.61％。

实施例4

在反应釜中加入1mmol硬脂酸乙烯酯、1mmol单乙醇胺和4mL正己烷，在500rpm转速搅拌下加入占混合物质量百分比为20％的Novozym 435,60℃温度下反应5h。减压抽滤去除反应体系中的脂肪酶，正己烷于50℃，真空度为0.098MPa通过减压蒸发去除。用混合溶剂(正己烷:异丙醇＝1：1,v/v)将反应产物溶解并稀释至合适浓度，经HPLC-ELSD分析，硬脂酸单乙醇酰胺的产率为98.87％。

由此可见，本发明提供的一种酶法制备脂肪酸单乙醇酰胺的方法，通过利用底物物质特性，使得合成工艺简单，反应效率很高，脂肪酸单乙醇酰胺的含量最高可达98.87％；本发明利用脂肪酶的专一性和高效性，酰胺化反应制备脂肪酸单乙醇酰胺，经过进一步优选优化脂肪酶的种类及含量，使得该方法制备脂肪酸单乙醇酰胺具有条件更加温和，选择性更好，催化效率更高，催化剂容易移除，副产物更少，产品质量更好等优点。可见，本发明提供的一种酶法脂肪酸单乙醇酰胺的制备方法实用性极强，有利于大规模工业化推广，其应用前景十分广阔。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。