一株海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010及其发酵液活性提取物的制备方法和应用

摘要

本发明公开了一株海洋真菌黑甲肉座菌（Hypocrea lixii）DLEN2008010及其发酵液活性提取物的制备方法和应用。所述海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010于2016年8月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No. 12868。本发明对海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010的静置发酵液进行了活性物质的提取纯化，该菌株的发酵液总提取物能很好的抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶的活性，该菌株发酵液经过提纯后的活性提取物能很好的抑制乙酰胆碱酯酶活性，在制备抗老年痴呆药物方面，以及在制备抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地，涉及一株海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010及其发酵液活性提取物的制备方法和应用。

背景技术

随着世界人口老龄化的加剧和老年痴呆（Alzheimer’s Disease, AD）发病率的不断增加，寻找抗老年痴呆的新药已迫在眉睫。

目前，被广泛接受的老年痴呆病理理论是胆碱能神经损伤假说。因为β-淀粉样蛋白沉积和t-蛋白聚集造成的神经纤维缠结，患者大脑中胆碱能神经元大量死亡。乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）作为重要的分子伴侣之一参与β淀粉样蛋白的聚集与沉积过程。而且，在残存胆碱能神经元的突触间隙乙酰胆碱酯酶活性过高，使得神经递质乙酰胆碱被降解，不能在神经元之间起到信号传导的作用，患者的记忆认知能力下降。迄今为止，乙酰胆碱酯酶抑制剂是目前应用最广的抗老年痴呆药物，因此筛选具有抑制AChE活性的药物具有重要意义。另外，氧化应激造成的神经损伤在老年痴呆发病机制中也起到重要作用，因此筛选具有抗氧化活性的药物对于老年痴呆的防治也具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有老年痴呆治疗药物的不足，提供一种海洋真菌黑甲肉座菌（Hypocrea>）DLEN2008010的发酵液活性提取物及其制备方法和应用，该菌株发酵液的活性提取物具有较好抑制乙酰胆碱酯酶活性，在制备抗老年痴呆药物方面具有很好的应用前景。

本发明的目的是提供一株海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010及其应用。

本发明的另一目的是提供上述海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010的发酵液活性提取物及其制备方法和应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的。

一株海洋真菌黑甲肉座菌（Hypocrea>）DLEN2008010，所述菌株于2016年8月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（其简称为CGMCC），保藏编号为：CGMCC No. 12868，分类命名号为：Hypocrea>DLEN2008010；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。

所述海洋真菌黑甲肉座菌（Hypocrea>）DLEN2008010是从中国大连海域的潮间带繁茂膜海绵组织内分离获得，具有抑制乙酰胆碱酯酶作用，依据《真菌鉴定手册》（魏景超，1979）鉴定为Hypocrea>菌株。

通过进一步的分子生物学鉴定，确认该菌株为黑甲肉座菌。

该菌株具有下述性质：接种到海水马铃薯蔗糖培养基（海水PSA）平板上，28℃培养，菌落开始时为白色，致密丝状，圆形，向四周扩展，后从菌落中央产生绿色孢子，中央变成绿色，菌落周围有白色菌丝的生长带，最后整个菌落全部变成绿色。菌丝生长迅速，在海水PSA培养基上30℃培养2天菌落直径达2.8 cm。显微镜下，菌丝纤细无色，具分隔，多分枝。产生分生孢子，分生孢子梗垂直对称分歧，分生孢子单生，圆形，绿色。

该菌株的最佳生长温度范围为26～30℃，最佳生长pH为6.0～7.0，可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖等碳源；该菌株的生长盐浓度范围为2.0%～5.0%，在海水马铃薯蔗糖液体培养基中静置发酵可产生抗氧化和乙酰胆碱酯酶抑制剂活性物质。

一种具有抗氧化或/和抑制乙酰胆碱酯酶活性的海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010的发酵液活性提取物，是由上述海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010的发酵液经过提取纯化得到。

具体地，所述海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010的发酵液活性提取物的活性特征成分的精确分子量为m/z 252.1030 ([M+H]⁺)，分子式为C₁₆H₁₃NO₂。

更具体地，所述海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010的发酵液活性提取物的活性特征成分的主要色谱峰保留时间为11.6 min；色谱柱为Luna 5u C18(2) 100A，150×4.60mm，填料粒径5 µm；流动相为0～20 min 15%～100%甲醇，20～30 min 100%甲醇；进样量10µL，浓度1>

更具体地，所述海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010的发酵液活性提取物活性特征成分的薄层色谱的比移值及化学显色特征如下：层析展开剂为二氯甲烷：甲醇=20：1时，活性特征成分在GF254薄层硅胶板上R_f值为0.36～0.45，254nm紫外灯下具棕黑色～黑色吸收，茴香醛硫酸显色为浅灰色，碘化铋钾显色为棕红色，Ehrlich试剂显色为浅黄色，酸性FeCl₃试剂显色为灰蓝色。

优选地，所述海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010的发酵液提取纯化的具体方法如下：

S1. 培养发酵液：将海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010接种于灭菌的液体培养基中，自然光照25～30 ℃培养21～24天；

S2. 提取发酵产物：将步骤S1所得发酵液经乙酸乙酯杀菌，然后超声处理，将混合液抽滤后的滤液经等体积乙酸乙酯萃取，滤饼用甲醇浸泡后再超声处理，将得到的乙酸乙酯提取物和甲醇提取物分别减压浓缩后合并离心，再次减压蒸干，得到活性粗提物。

S3. 纯化粗提物：将步骤S2所得粗提物溶于甲醇，加入硅胶，混合研磨均匀至干燥，将干燥物上样于硅胶层析柱，逐步梯度洗脱，收集洗脱部分，采用薄层色谱生物活性自显影法追踪活性物质，将活性物质用薄层硅胶板继续分离，将得到的分离物研磨后用乙酸乙酯洗脱，最后将洗脱液浓缩干燥得到纯化的活性组分。

更具体地，步骤S1所述液体培养基的制备方法为：每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖和20.0g海盐，自然pH值；所述马铃薯煮汁为：取新鲜马铃薯去皮切成1cm³大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500mL煮沸20min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。

优选地，步骤S1所述培养发酵液的具体方法为：

（1）种子培养：将菌种从斜面上接种到无菌的种子固体培养基平板上，将培养皿平板置于恒温培养箱中28℃下倒置培养，培养时间为4～5天；

（2）扩大培养：按照每1000 mL液体培养基接种上述步骤（1）培养后的种子平板带菌培养基块40～80 cm²的比例接种，培养21～24天，得到发酵液。

更具体的，所述培养基配方如下：

种子固体培养基为：每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖、20.0g海盐和15.0g琼脂，自然pH值；

液体培养基为：每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖和20.0g海盐，自然pH值；

其中，马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm³大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500>

优选地，步骤S2所述提取发酵产物的具体方法为：

（1）提取：将步骤S1培养结束后得到的发酵液，用乙酸乙酯过夜杀菌，然后超声处理20～40min，加入硅藻土抽滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取2～5次，得到乙酸乙酯提取物；滤饼用甲醇浸泡12～24 h后，超声20～40 min，抽滤，得到甲醇提取物；如此重复2～3次；

（2）浓缩：将乙酸乙酯提取物和甲醇提取物分别减压浓缩，合并提取物并离心后，继续减压蒸干，得到干固体，即为总活性粗提取物。

优选地，步骤S3所述纯化粗提物的具体方法为：

（1）将发酵提取物溶于甲醇，加入到相当于其干重1～2倍重量的100～200目硅胶，混合并研磨均匀至干燥，上样于40～100倍样品干重的200～300目硅胶层析柱上，用洗脱剂逐步梯度洗脱，所用洗脱剂为体积比为10：1～0：1的石油醚和丙酮混合液，收集其中石油醚：丙酮=8：1和6：1的洗脱部分，并采用薄层色谱生物活性自显影法追踪活性物质；

（2）将有活性物质的组份样品采用制备薄层硅胶板继续分离，展开剂为氯仿：甲醇=50:1，硅胶为薄层层析硅胶GF254，薄层板尺寸为20 cm×20 cm，硅胶铺设厚度为0.5～1 mm，刮取比移值为0.3的条带，研磨后用乙酸乙酯洗脱，将洗脱液用旋转蒸发仪在45℃以下浓缩至干，得到纯化的活性组分。

另外，以下所述的应用均应在本发明的保护范围之内：

海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010或其发酵液活性提取物在制备抗老年痴呆药物方面的应用。

海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010或其发酵液活性提取物在制备抗氧化和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面的应用。

本发明所筛选得到的海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010通过静置发酵后，其发酵液的乙酸乙酯提取物与菌丝体甲醇提取物合并得到的总粗提物具有抑制乙酰胆碱酯酶活性的功能，将该粗提取物进一步经硅胶柱层析及制备薄层硅胶板分离后得到的有效活性组分，具有抑制乙酰胆碱酯酶的显著活性，在制备抗老年痴呆药物方面具有很好的应用前景。

本发明经过大量的研究和探索，筛选分离到海洋真菌菌株黑甲肉座菌（Hypocrea>lixii）DLEN2008010，该菌株可以利用常规的静置方法培养，培养基中可含有用于微生物培养的碳源、氮源及其它营养源，对光照无严格限制，以适宜于该菌株生长为准。

在本发明所提供的海洋真菌菌株黑甲肉座菌DLEN2008010的基础上，在以制备抑制乙酰胆碱酯酶活性产物为目的时，本领域技术人员可以根据常规的微生物培养方法进行调整，发酵培养应选择使培养物的活性提取物的收率最高的条件为好。由以上所得的培养物出发，通过一些适当的方法就能提取其中的活性组分，这些方法是常用于提取代谢物的方法，例如可利用活性提取物与其它杂质在溶解度、离子结合力、吸附亲和力及分子量等方面的差别进行提取，这些方法可以单独使用，也可以适当配合或反复使用。

具体地，本发明提供了一种优选的适合于海洋真菌菌株黑甲肉座菌DLEN2008010的培养方法和活性物质提取方法。培养海洋真菌菌株黑甲肉座菌DLEN2008010产生活性产物的最佳培养基、培养方法和提取方法如下：

（1）培养基：

种子固体培养基为：蔗糖20.0g，马铃薯煮汁500mL，海盐20.0g，琼脂15.0g，自然pH值。

液体培养基为：蔗糖20.0g，马铃薯煮汁500mL，海盐20.0g，自然pH值。

其中，马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm³大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500mL煮沸20min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。

（2）培养和提取方法：

A．种子培养：将菌种从斜面上接种到无菌的种子固体培养基平板上，将培养皿平板置于恒温培养箱中28℃下倒置培养，培养时间为4～5天；

B．扩大培养：将1L液体培养基灌装到3L三角瓶中，用透气封口膜封口后于高压灭菌锅中121℃、0.1 Mpa灭菌20min；冷却后按照每1000mL液体培养基接种上述步骤A培养后的种子平板带菌培养基块40～80cm²的比例接种，封口，置于恒温培养箱中培养，自然光照，培养时间为20～25天，得到发酵液；

C．提取：培养结束后得到的发酵液，用500mL乙酸乙酯过夜杀菌，然后超声处理30min，加入硅藻土抽滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯提取物；滤饼用200mL甲醇浸泡12～24h后，超声30min，抽滤，得到甲醇提取物；如此重复2次；

将乙酸乙酯提取物和甲醇提取物分别用旋转蒸发仪于45℃减压浓缩，最后合并提取物并离心后，继续用旋转蒸发仪于45℃减压蒸干，得到一份干固体，为总活性粗提物；

D．提纯：将发酵提取物溶于5～20mL甲醇，加入到相当于其干重1～2倍重量的100～200目硅胶，混合并研磨均匀至干燥，上样于40～100倍样品干重的200～300目硅胶层析柱上，用洗脱剂逐步梯度洗脱，所用洗脱剂为石油醚：丙酮=10：1～0：1（v/v），收集其中石油醚：丙酮=8：1和6：1洗脱部分，并采用薄层色谱生物活性自显影法追踪活性物质。将有活性物质的组份样品采用制备薄层硅胶板继续分离，展开剂为氯仿：甲醇=50:1，硅胶为薄层层析硅胶GF254，薄层板尺寸为20 cm×20 cm, 硅胶铺设厚度为0.5～1 mm，刮取比移值为0.3的条带，研磨后用乙酸乙酯洗脱，将洗脱液用旋转蒸发仪在45℃以下浓缩至干，得到活性组分，呈白色粉末状态。

另外，薄层分析显示：层析展开剂为二氯甲烷：甲醇=20：1时，活性物质在GF254薄层硅胶板（国家药典指定产品）上R_f值为0.36～0.45，254nm紫外灯下具棕黑色~黑色吸收，茴香醛硫酸显色为浅灰色，碘化铋钾显色为棕红色，Ehrlich试剂显色为浅黄色，酸性FeCl₃试剂显色为灰蓝色。

还对该组分进行了HPLC-TOF-HRMS分析，液相色谱型号为Agilent 1260，质谱型号为Bruker maXis。液相色谱条件为：色谱柱为Luna 5u C18(2) 100A，150*4.60 mm，填料粒径5 µm；流动相为0～20 min 15%～100%甲醇，20～30 min 100%甲醇；进样量10 µL，浓度1mg/mL。质谱条件为正离子模式ESI源，毛细管电压4500 V，喷雾干燥气流速度5.0 L/min，气化温度180 ℃，质量扫描范围（m/z）为100～2000。结果表明：活组分含有的抑制乙酰胆碱酯酶活性特征成分的主要色谱峰保留时间为11.6 min，精确分子量为m/z 252.1030 ([M+H]⁺)，分子式为C₁₆H₁₃NO₂。

本发明通过薄层色谱生物活性自显影显示该组分具有抑制乙酰胆碱酯酶活性，微孔板法测定其抑制乙酰胆碱酯酶的IC₅₀为0.097>

本发明的海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010发酵液及其活性提取物，以及其中的有效组分，可以用于制备抗老年痴呆的药物。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明筛选分离得到一株海洋真菌黑甲肉座菌（Hypocrea>）DLEN2008010，该菌株及其培养物具有抑制抗氧化和乙酰胆碱酯酶的活性，在制备抗老年痴呆药物方面，以及在抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面具有很好的应用前景。

同时，本发明还对海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010的发酵液进行了活性物质的提取纯化，得到的总提取物和其中的活性组分具有很好的抑制乙酰胆碱酯酶的活性，在制备抗老年痴呆药物方面，以及在制备抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面具有很好的应用前景。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010的分离与鉴定

1、菌株的分离方法

（1）样品：中国大连海域的潮间带繁茂膜海绵。

（2）分离方法

将上述新鲜海绵样品用121℃下20 min高压灭菌后的海水冲洗两遍，转移进200 mL三角烧瓶中加入用121℃下20 min高压灭菌后的玻璃珠及无菌海水50 mL，在60 rpm转速下振荡10 min，弃去上清液，再用无菌海水冲洗海绵2遍。

将经过上述处理的海绵用50mL 70%乙醇的水溶液浸泡10秒后取出，用50 mL无菌海水冲洗去表面残余乙醇，用无菌吸水纸吸干残余海水，用火焰灼烧灭菌后的刀片将海绵切为小块，并移植到平板固体培养基上28℃下培养3天。

再将初始呈白絮状扩展生长而后显灰绿色的菌落用无菌刀片切取菌丝尖端，转移到新的平板固体培养基上，继续在28℃下培养3天，如此重复三次，得到纯菌株。

另外，分离过程中所使用的平板固体培养基为海水马铃薯蔗糖培养基（海水PSA），其成分为：每升中含500 mL马铃薯煮汁，20g蔗糖，0.2g氯霉素，20g粗海盐，121℃下20 min高压灭菌后可用。

其中，马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm³大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500>

2、菌株鉴定

（1）形态学鉴定：将得到的纯菌株接种到海水PSA平板上，28℃培养，观察菌落形体特征，包括菌落中心及边缘部分的质地与颜色；并在菌落边缘斜插入无菌盖玻片，待菌丝生长延伸到盖玻片上时，用镊子取出带菌丝的盖玻片贴到载玻片上，于光学显微镜下观察菌丝、分生孢子梗、分生孢子的形态特征。参照魏景超编著的《真菌鉴定手册》对其进行形态学鉴定。

（2）鉴定到一株属于黑甲肉座菌的菌株，进一步对其进行分子生物学验证：

将菌株接种到海水PSA平板上28℃下培养7天后，用无菌刀片刮下菌丝，转移进无菌的研钵中，加入液氮研磨，然后使用北京Tiangen生物技术公司的植物基因组提取试剂盒DP305根据说明书步骤提取DNA，所得DNA样本溶解于50μL TE缓冲液中。

以该DNA样本为模板，使用真菌通用引物ITS1 （5’-TCCGTAGGTGAACCT

GCGG-3’）和ITS4 （5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）通过PCR反应扩增其核糖体基因内转录间隔区序列ITS1-5.8S-ITS2，PCR反应条件为：1）起始94℃变性5 min；2）94℃变性0.5min；3）55℃退火0.5 min；4）72℃延伸1 min；5）最终72℃延伸5 min。其中，步骤2）至步骤4）循环30次。

PCR反应产物使用琼脂糖电泳纯化，纯化产物用基因测序仪直接测序，测序结果与Genbank数据库中的序列进行BLAST比对，根据序列相似性，将该菌株鉴定为黑甲肉座菌。

3、经过上述分离鉴定，结果显示，筛选得到一株海洋真菌黑甲肉座菌。

该菌株接种到海水马铃薯蔗糖培养基（海水PSA）平板上，28℃培养，菌落开始时为白色丝状，致密丝状，圆形，向四周扩展，后从菌落中央产生绿色孢子，中央变成绿色，菌落周围有白色菌丝的生长带，最后整个菌落全部变成绿色. 菌丝生长迅速，在海水PSA培养基上30℃培养2天菌落直径达2.8 cm。

显微镜下，菌丝纤细无色，具分隔，多分枝。产生分生孢子，分生孢子梗垂直对称分歧，分生孢子单生，圆形，绿色。最佳生长温度范围26～30℃，最佳生长pH为6.0～7.0，可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖等碳源。

研究显示，该菌株在海水马铃薯蔗糖液体培养基中静置发酵可产生抑制乙酰胆碱酯酶活性的物质。

将该菌株命名为海洋真菌黑甲肉座菌（Hypocrea>）DLEN2008010，并于2016年8月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（其简称为CGMCC），保藏编号为：CGMCC No.12868；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。

实施例2海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010发酵总提取物活性测试

1、黑甲肉座菌DLEN2008010发酵总提取物的获得

（1）种子培养：将菌种从斜面上接种到无菌的种子固体培养基平板上，将培养皿平板置于恒温培养箱中28℃下倒置培养，培养时间为4～5天；

（2）扩大培养：将1L液体培养基灌装到3L三角瓶中，用透气封口膜封口后于高压灭菌锅中121℃、0.1 Mpa灭菌20min；冷却后按照每1000mL液体培养基接种上述步骤（1）培养后的种子平板带菌培养基块40～80cm²的比例接种，封口，置于恒温培养箱中培养，自然光照，培养时间为21～24天，得到发酵液。

其中，所用到的培养基如下：

种子固体培养基为：蔗糖20.0g，马铃薯煮汁500mL，海盐20.0g，琼脂15.0g，自然pH值。

液体培养基为：蔗糖20.0g，马铃薯煮汁500mL，海盐20.0g，自然pH值。

其中，马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm³大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500>

（3）提取：步骤（2）得到的发酵液用500mL乙酸乙酯过夜杀菌，然后超声处理30min，加入硅藻土抽滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯提取物；滤饼用200mL甲醇浸泡12～24 h后，超声30min，抽滤，得到甲醇提取物；如此重复2次；

将乙酸乙酯提取物和甲醇提取物分别用旋转蒸发仪于45℃减压浓缩，最后合并提取物并离心后，继续用旋转蒸发仪于45℃减压蒸干，得到一份干固体，为总活性粗提物；

2、黑甲肉座菌DLEN2008010发酵总提取物的活性测试

（1）测试方法

酶抑制活性测试：在96孔板中加入5 L梯度浓度的样品（在测试体系中最终质量浓度依次为1 mg/mL、0.5 mg/ mL、0.1 mg/ mL、0.05 mg/ mL），晾干后依次加入10 L 10%DMSO，40L 0.1 M的PBS（pH 7.4），10 L终浓度为0.02 U/mL AChE，20 L 5 mM DTNB，37 ℃孵育10min，加入20 L 10 mM ATCh，再37 ℃孵育10 min后加入30 L 1%SDS终止反应，用酶标仪在405 nm处检测OD值，其值为>样品。同时每个样品都设一对应的样品本底，用同体积PBS缓冲液代替ATCh，同上检测，设为>样品本底。空白对照用>空白；空白本底为用BSA代替酶液，其他反应条件同>空白，其它同上检测，设为OD>空白本底。所有试验重复3次并计算平均值和标准差。设>空白-OD_空白本底)-(OD>样品-OD>样品本底)]/(OD>空白-OD_空白本底)×100%。用origin软件做抑制率-浓度半对数曲线，用三次回归方程计算半抑制浓度（IC₅₀），阳性对照为他克林（Tacrine）。

抗氧化活性实验：取50 L梯度浓度的样品（在测试体系中最终质量浓度依次为5mg/mL、4 mg/ mL、2 mg/ mL、1 mg/ mL、0.1 mg/ mL、0.5 mg/ mL），挥发干溶剂后加入100 LDMSO溶解，加入100 L 0.16 mmol/L DPPH甲醇溶液，混匀，对照用甲醇代替样品溶液；空白组是在100 L DPPH中加入100 L DMSO混合，对照组用100 L甲醇溶液代替DPPH。室温暗处放置30 min，于517 nm处测定吸光度，分别记为A₁、A₂、A₃、A₄。清除率%>1-A₂)×100/(A₃-A₄)。式中，A₁为实验组的吸光值；A₂为实验对照组的吸光值；A₃为空白组的吸光值；A₄为空白对照组的吸光值。平行测定2次，计算平均值。用origin软件做清除率-浓度半对数曲线，用三次回归方程计算半清除浓度（EC₅₀），阳性对照为抗坏血酸（Vc）。

（2）结果

发酵总提取物对乙酰胆碱酯酶的半抑制浓度（IC₅₀）为0.38>50）为3.0>

上述结果显示，海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010的发酵总提取物具有很好的抑制乙酰胆碱酯酶和抗氧化活性。

实施例3海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010发酵液活性物质的提取

1、培养基

（1）种子固体培养基为：蔗糖20.0g，马铃薯煮汁500mL，海盐20.0g，琼脂15.0g，自然pH值。

（2）液体培养基为：蔗糖20.0g，马铃薯煮汁500mL，海盐20.0g，自然pH值。

其中，马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm³大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500>

2、提取方法

（1）种子培养：将菌种从斜面上接种到无菌的种子固体培养基平板上，将培养皿平板置于恒温培养箱中28℃下倒置培养，培养时间为4～5天；

（2）扩大培养：将1L液体培养基灌装到3L三角瓶中，用透气封口膜封口后于高压灭菌锅中121℃、0.1 Mpa灭菌20min；冷却后按照每1000mL液体培养基接种上述步骤（1）培养后的种子平板带菌培养基块40～80cm²的比例接种，封口，置于恒温培养箱中培养，自然光照，培养时间为20～25天，得到发酵液；

（3）提取：步骤（2）得到的发酵液用500mL乙酸乙酯过夜杀菌，然后超声处理30min，加入硅藻土抽滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯提取物；滤饼用200mL甲醇浸泡12～24 h后，超声30min，抽滤，得到甲醇提取物；如此重复2次；

将乙酸乙酯提取物和甲醇提取物分别用旋转蒸发仪于45℃减压浓缩，最后合并提取物并离心后，继续用旋转蒸发仪于45℃减压蒸干，得到一份干固体，为总活性粗提物；

（4）提纯：将发酵提取物溶于5～20mL甲醇，加入到相当于其干重1～2倍重量的100～200目硅胶，混合并研磨均匀至干燥，上样于40～100倍样品干重的200～300目硅胶层析柱上，用洗脱剂逐步梯度洗脱，所用洗脱剂为石油醚：丙酮=10：1～0：1（v/v），收集其中石油醚：丙酮=8：1和6：1洗脱部分，并采用薄层色谱生物活性自显影法追踪活性物质。将有活性物质的组份样品采用制备薄层硅胶板继续分离，展开剂为氯仿：甲醇=50:1，硅胶为薄层层析硅胶GF254，薄层板尺寸为20 cm×20 cm, 硅胶铺设厚度为0.5～1 mm，刮取比移值为0.3的条带，研磨后用乙酸乙酯洗脱，将洗脱液用旋转蒸发仪在45℃以下浓缩至干，得到活性组分，呈白色粉末状态。

3、薄层分析显示：层析展开剂为二氯甲烷：甲醇=20：1时，活性物质在GF254薄层硅胶板（国家药典指定产品）上R_f值为0.36～0.45，254nm紫外灯下具棕黑色~黑色吸收，茴香醛硫酸显色为浅灰色，碘化铋钾显色为棕红色，Ehrlich试剂显色为浅黄色，酸性FeCl₃试剂显色为灰蓝色。

4、对该组分进行了HPLC-TOF-HRMS分析，液相色谱型号为Agilent 1260，质谱型号为Bruker maXis。液相色谱条件为：色谱柱为Luna 5u C18(2) 100A，150×4.60 mm，填料粒径5 µm；流动相为0～20 min 15%～100%甲醇，20～30 min 100%甲醇；进样量10 µL，浓度1mg/mL。质谱条件为正离子模式ESI源，毛细管电压4500 V，喷雾干燥气流速度5.0 L/min，气化温度180 ℃，质量扫描范围（m/z）为100～2000。

5、结果表明：得到的活性特征成分的主要色谱峰保留时间为11.6 min，精确分子量为m/z 252.1030 ([M+H]⁺)，分子式为C₁₆H₁₃NO₂。

实施例4海洋真菌黑甲肉座菌DLEN2008010发酵液活性物质的活性测定

测试实施例3提取的发酵液活性组分的活性。

1、薄层色谱生物活性自显影实验：

（1）取GF254硅胶板，用干净的甲醇将其预展干净后晾干，用毛细管取10µL组分样品点样于层析板上，用二氯甲烷：甲醇=25：1展开。挥发干溶剂后，均匀喷上0.5 U/mL 乙酰胆碱酯酶(AChE)，晾干，使酶液固定，然后在37℃的恒温培养箱中保湿孵育20min，孵育结束后，将DTNB与ATCh以1：1混合，喷雾到板子上，再37℃孵育10min，观察实验现象。

（2）实验结果：薄层色谱生物活性自显影结果显示，该组分具有抑制乙酰胆碱酯酶活性，呈现明显的活性斑点。

2、酶标比色法实验：

（1）在96孔板中依次加入200µL、100µL、40µL、20µL、10µL质量浓度为5 mg/mL样品溶液，晾干后依次加入10µL 10%DMSO，40µL 0.1 M的PBS（pH 7.4），10µL终浓度为0.02 U/mLAChE，20µL 5 mM DTNB，37 ℃孵育10 min，加入20µL 10 mM ATCh，再37℃孵育10 min后加入30µL 1%SDS，用酶标仪在405 nm处检测OD值，其值为>样品。同时每个样品都设一对应的样品本底，同上检测，设为>样品本底。阴性对照用 10%DMSO代替样品，同上检测，设为>阴性；阴性本底为用BSA代替酶液，其他反应条件同>阴性，其它同上检测，设为OD_阴性本底。所有试验重复2次并计算平均值和标准差，阳性对照为他克林。设>[13]：I%=[(OD_阴性-OD_阴性本底)-(OD_样品-OD_样品本底)]/(OD_阴性-OD_阴性本底)×100%。

以抑制率—浓度做图，取对数趋势线，计算IC₅₀。

（2）实验结果：通过酶标比色法测定该组分的活性，发现其具有抗乙酰胆碱酯酶的活性，其抑制乙酰胆碱酯酶的IC₅₀为0.097>

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