一种筛选和研究线粒体疾病致病基因果蝇模型的构建方法及其应用

摘要

本发明提供了一种筛选和研究线粒体疾病致病基因果蝇模型的构建方法及其应用，本发明的方法中使果蝇模型翅膀神经细胞中的线粒体表达第一荧光蛋白；并且使果蝇模型翅膀神经细胞膜表达第二荧光蛋白，通过线粒体定位的第一荧光蛋白标记线粒体，通过神经细胞膜定位的第二荧光蛋白标记神经细胞，就可以实现体内条件下对神经系统内线粒体功能的研究。使用该方法构建的果蝇转基因模型能够简单、方便地用于筛选和研究线粒体致病基因，能够满足线粒体致病基因筛选所要求的高通量、经济性强和时间短的要求。

说明书

技术领域

本发明涉及一种筛选和研究致病基因的模型构建方法及其应用，尤其针对筛选和研究线粒体疾病致病基因的果蝇模型和相应的构建方法与应用。

背景技术

线粒体疾病是以线粒体功能异常为显著特征的一类重大疾病。线粒体疾病在美国新生儿中的患病比率为1/4000，我国目前尚缺乏完整的线粒体疾病流行病学资料，但根据多家医院的资料显示，线粒体疾病在某三甲医院的接诊病例每年可高达几百甚至上千例，提示该病在中国并不罕见。线粒体疾病是一种遗传性疾病，目前已知的线粒体疾病致病基因超过100个，包括线粒体自身编码的基因以及细胞核编码的线粒体基因，除此之外，可能还存在许多未知的线粒体疾病基因。线粒体疾病临床表现涉及到人类多个系统，包括视觉神经、听觉神经、外周感觉神经、骨骼肌、心肌、肝脏、肾脏和消化系统等，尤其以神经系统表现最为显著，与此同时，病人常常表现为多个系统病变叠加。目前尚无可靠的线粒体疾病治疗药物问世。

线粒体疾病临床表现复杂且往往存在多个系统病理叠加的现象，使得临床诊断困难重重。线粒体疾病致病基因众多，每个基因的致病机制可能大相径庭，导致确切的分子机制十分不清楚，给临床治疗带来了极大的障碍。造成以上困难的原因主要有：一是致病基因众多，难以开展系统的分子机制研究；二是缺乏高效的线粒体疾病致病基因筛选和研究的动物模型。目前针对线粒体疾病分子机制的研究主要是基于单个基因的生化模型和细胞模型进行，转基因动物模型主要使用大小鼠进行。虽然大小鼠在进化上与人类比较接近，但是其固有的长生命周期、高成本等不足，严重阻碍了转基因鼠模型在线粒体疾病研究中的应用。

因此，本领域技术人员致力于开发使用成本低，且容易制备的线粒体疾病动物模型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种筛选和研究线粒体疾病致病基因果蝇模型的构建方法及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种构建转基因果蝇模型的方法，所述方法包括步骤：

(1)使所述果蝇模型翅膀神经细胞中的线粒体表达第一荧光蛋白；和

(2)使所述果蝇模型翅膀神经细胞膜表达第二荧光蛋白；

从而构建出所述转基因果蝇模型；

其中，所述第二荧光蛋白的荧光与所述第一荧光蛋白的荧光不同。

在另一优选例中，所述第一荧光蛋白选自下组：绿色荧光蛋白(如eGFP、ZsGreen)、红色荧光蛋白(如tdTomato、DsRed、mCherry)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)等。

在另一优选例中，所述第二荧光蛋白选自下组：绿色荧光蛋白(如eGFP、ZsGreen)、红色荧光蛋白(如tdTomato、DsRed、mCherry)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)等。

在另一优选例中，所述第一荧光蛋白为绿色荧光蛋白；和/或所述第二荧光蛋白为红色荧光蛋白。

在另一优选例中，所述果蝇模型的基因型为dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Cyo；UAS-mCD8-mCherry/TM6B.Tb。

在另一优选例中，所述步骤(1)中包括步骤：

(1.1)将dpr-Gal4基因型果蝇与UAS-mitoGFP基因型的果蝇杂交，然后挑选出子代中同时含有这两个转基因的处女果蝇；

(1.2)将步骤(1.1)获得的处女果蝇与w¹¹¹⁸果蝇进行杂交，挑选杂交后子代中眼睛颜色最深的雄果蝇；

(1.3)将步骤(1.2)中获得的雄果蝇分别与Sco/Cyo基因型果蝇进行单独杂交；

(1.4)确定步骤(c)杂交成功以后，验证所述雄果蝇是否携带dpr-Gal4和UAS-mitoGFP基因，如果所述雄果蝇同时携带dpr-Gal4和UAS-mitoGFP两个转基因，便将该雄果蝇的子代收集起来；由此构建出绿色荧光蛋白标记神经细胞线粒体的dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Cyo基因型果蝇；

在另一优选例中，所述步骤(2)中包括步骤：

(2.1)将步骤(1.4)建立的dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Cyo基因型果蝇与w；Sco/Cyo；MKRS.Sb/TM6B.Tb基因型果蝇杂交，从子代中挑选dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Sco；+/TM6B.Tb基因型雄果蝇；

(2.2)与步骤(2.1)同时，将UAS-mCD8-mCherry基因型果蝇与w；Cyo/T(2；3),TM3.Sb基因型果蝇杂交,从子代中挑选+/Cyo；UAS-mCD8-mCherry/TM3.Sb基因型处女果蝇；

(2.3)将步骤(2.1)获得的dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Sco；+/TM6B.Tb基因型雄果蝇和步骤(2.2)获得的+/Cyo；UAS-mCD8-mCherry/TM3.Sb基因型处女果蝇杂交，从子代中挑dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Cyo；UAS-mCD8-mCherry/TM6B.Tb基因型果蝇,由此完成所述转基因果蝇模型的构建。

本发明的第二方面，提供了一种筛选和研究线粒体致病基因的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供携带RNAi基因的雄性果蝇；

(2)将dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Cyo；UAS-mCD8-mCherry/TM6B.Tb基因型雌性果蝇与携带RNAi基因的雄性果蝇杂交，挑选同时含有dpr-Gal4基因、UAS-mitoGFP基因、RNAi基因、和UAS-mCD8-mCherry基因的子代果蝇；观察所述子代果蝇的翅膀感觉神经元中线粒体形态和数量以及神经束的完整性。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了研究线粒体疾病的果蝇模型。

图2显示了基于果蝇模型的线粒体疾病致病基因快速筛选技术流程图。

图3显示了线粒体疾病致病基因筛选成果。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种构建转基因果蝇模型的方法，该方法中使果蝇模型翅膀神经细胞中的线粒体表达第一荧光蛋白；并且使果蝇模型翅膀神经细胞膜表达第二荧光蛋白，通过线粒体定位的第一荧光蛋白标记线粒体，通过神经细胞膜定位的第二荧光蛋白标记神经细胞，就可以实现体内条件下对神经系统内线粒体功能的研究。使用该方法构建的果蝇转基因模型能够简单、方便地用于筛选和研究线粒体致病基因，能够满足线粒体致病基因筛选所要求的高通量、经济性强和时间短的要求。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

转基因果蝇模型

果蝇的遗传背景清晰，生命周期短，每代只需要10天左右，饲养成本也较为低廉，十分适合线粒体致病基因筛选所要求的高通量、经济性强和时间短的要求。另外，果蝇拥有丰富的遗传品系库，并且获取十分方便。更为重要的是，果蝇和人在基因上高度保守，果蝇总共包含约13000个基因，其中60％的基因在人类存在同源基因。目前已知的287个人类致病基因中有大约178个在果蝇中有同源基因存在。

本发明人研究发现可以在果蝇中研究人类致病基因(如线粒体致病基因)的具体的分子机制，例如将人类中发生突变的线粒体疾病基因通过转基因技术表达在果蝇中，另外也可以通过RNAi的方法降低致病基因在果蝇中的表达，甚至可以利用基因编辑技术敲除某些致病基因。

果蝇翅膀为半透明结构，翅膀边缘分布有大量感觉神经元，这些神经元一方面通过树突感受环境信息，一方面通过神经轴突将环境信息传递到中枢神经。这一类型的神经细胞轴突中分布有大量的线粒体，为神经轴突正常功能提供能量支持。本发明中通过线粒体定位的绿色荧光蛋白标记线粒体，以及细胞膜定位的红色荧光蛋白标记神经细胞，就可以实现in vivo条件下对神经系统内线粒体功能的研究。

本发明的目的是提供用于线粒体疾病致病基因筛选和分子机制研究的转基因果蝇模型。

本发明的第一个目的提供了一种用于研究线粒体疾病的果蝇模型，它具有绿色荧光蛋白标记的线粒体和红色荧光蛋白标记的神经细胞。该模型利用了果蝇翅膀为半透明结构，方便用于显微成像，以及翅膀边缘分布有富含线粒体的神经细胞，便于研究线粒体功能以及其对于神经系统的影响。

本发明的第二个目的是提供一种构建线粒体疾病转基因果蝇模型的方法，所述方法包括步骤：

(1)将dpr-Gal4(II号染色体)与UAS-mitoGFP(II号染色体)两种基因型的果蝇进行杂交，然后挑选出子代中同时含有这两个转基因的处女果蝇，并且将这种处女果蝇与w¹¹¹⁸果蝇进行杂交，杂交以后将子代果蝇中眼睛颜色最深的雄果蝇挑选出来，然后将这些雄果蝇分别与Sco/Cyo(II号染色体)果蝇进行单独杂交，待确定杂交成功以后将雄果蝇用PCR分别验证dpr-Gal4以及UAS-mitoGFP的存在，如果同时存在上述两个转基因，便将该果蝇的子代收集起来，由此成功构建荧光蛋白标记神经细胞线粒体的新果蝇品系dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Cyo；

(2)将新建立的dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Cyo果蝇与w；Sco/Cyo；MKRS.Sb/TM6B.Tb果蝇杂交，从子代中挑选dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Sco；+/TM6B.Tb雄果蝇，与此同时将UAS-mCD8-mCherry(III号染色体)与w；Cyo/T(2；3),TM3.Sb进行杂交,从子代中挑选+/Cyo；UAS-mCD8-mCherry/TM3.Sb处女果蝇,然后将这两类果蝇进行杂交，最后从子代中挑选dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Cyo；UAS-mCD8-mCherry/TM6B.Tb,由此完成线粒体疾病果蝇模型构建。

本发明的第三个目的是提供一种高效的线粒体致病基因筛选方法，包括步骤：将不同的携带RNAi基因的果蝇(每个RNAi都分别降低一个线粒体基因的表达水平)分别与线粒体疾病模型果蝇dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Cyo；UAS-mCD8-mCherry/TM6B.Tbb进行杂交，在子代果蝇中挑选同时含有RNAi和dpr-Gal4,UAS-mitoGFP；UAS-mCD8-mCherry的雄果蝇,然后在一定时间以后将该果蝇的翅膀在解剖显微镜分离下来，直接用于荧光显微镜观察线粒体形态数量以及神经轴突完整性情况。因为野生型果蝇翅膀神经细胞中线粒体形态和数量十分明确，神经束完好，如果某一个RNAi果蝇的翅膀神经细胞中线粒体形态和数量相较于野生型果蝇出现明显变化，或者是神经束完整性下降，都提示该RNAi所影响的基因可能是一个在线粒体中发挥重要功能的基因，通过数据库信息比对，可以快速确认该基因的具体信息，以此鉴定出新的线粒体疾病致病基因。

dpr-Gal4基因型果蝇

dpr-gal4是一种特异表达在化学和机械类感觉神经元的转录激活因子，其准确的基因型是w[*]；P{w[+mW.hs]＝GawB}dpr1[PGaw],P{w[+*]＝UAS-GFP.U}2/CyO，该基因型果蝇(编号25083)购于美国布卢明顿果蝇品系中心。

UAS-mitoGFP基因型果蝇

UAS-mitoGFP是一种可以表达线粒体定位绿色荧光蛋白转基因果蝇，其准确的基因型是w[1118]；P{w[+mC]＝UAS-mito-HA-GFP.AP}2/CyO，该基因型果蝇(编号8442)购于美国布卢明顿果蝇品系中心。

w¹¹¹⁸基因型果蝇

w¹¹¹⁸是一种眼睛颜色为白色的突变体果蝇，其控制眼睛颜色的white基因发生了遗传突变，该基因型果蝇(编号5905)购于美国布卢明顿果蝇品系中心。

Sco/Cyo基因型果蝇

Sco/Cyo是一种类型的二号染色体平衡子果蝇，主要用于平衡致死基因以及抑制同源重组的发生，其显著特点是翅膀为卷翅，该基因型果蝇(编号2555)购于美国布卢明顿果蝇品系中心。

w；Sco/Cyo；MKRS.Sb/TM6B.Tb基因型果蝇

w；Sco/Cyo；MKRS.Sb/TM6B.Tb是一种同时含有二号和三号平衡子染色体的果蝇品系，其显著特点是翅膀为卷翅，同时背部刚毛粗短，该基因型果蝇(编号3703)购于美国布卢明顿果蝇品系中心。

UAS-mCD8-mCherry基因型果蝇

UAS-mCD8-mCherry是一种可以表达细胞膜定位红色荧光蛋白mCherry的转基因果蝇，该转基因果蝇(编号27392)购于美国布卢明顿果蝇品系中心。

w；Cyo/T(2；3),TM3.Sb基因型果蝇

w；Cyo/T(2；3),TM3.Sb是一种同时含有二号和三号平衡子染色体的果蝇品系，该果蝇显著特点是两条平衡子染色体连锁在一起遗传，该基因型果蝇(编号2475)购于美国布卢明顿果蝇品系中心。

本发明的主要优点在于：

(1)使用本发明方法构建的果蝇转基因模型能够简单、方便地用于筛选和研究线粒体致病基因。

(2)使用本发明的方法构建的转基因果蝇模型，能够满足线粒体致病基因筛选所要求的高通量、经济性强和时间短的要求。

(3)使用本发明的筛选和研究线粒体致病基因的方法，能够实现高通量筛选研究，且成本低，周期短。

(4)使用本发明构建的果蝇转基因模型可以研究线粒体的众多生物学过程，比如线粒体的分裂-融合，线粒体运动，线粒体更新等等。

(5)使用本发明构建的果蝇转基因模型可用于研究神经轴突的维持因素。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施实例1：线粒体疾病致病基因筛选和研究果蝇模型的建立

将dpr-Gal4(II号染色体)与UAS-mitoGFP(II号染色体)两种基因型的果蝇进行杂交，然后挑选出子代中同时含有这两个转基因的处女果蝇，并且将这种处女果蝇与w¹¹¹⁸果蝇进行杂交，杂交以后将子代果蝇中眼睛颜色最深的雄果蝇挑选出来，然后将这些雄果蝇分别与Sco/Cyo(II号染色体)果蝇进行单独杂交，待确定杂交成功以后将雄果蝇用PCR分别验证dpr-Gal4以及UAS-mitoGFP的存在，如果同时存在上述两个转基因，便将该果蝇的子代收集起来，由此成功构建荧光蛋白标记神经细胞线粒体的新果蝇品系dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Cyo；二是将新建立的dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Cyo果蝇与w；Sco/Cyo；MKRS.Sb/TM6B.Tb果蝇杂交，从子代中挑选dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Sco；+/TM6B.Tb雄果蝇，与此同时将UAS-mCD8-mCherry(III号染色体)与w；Cyo/T(2；3),TM3.Sb进行杂交,从子代中挑选+/Cyo；UAS-mCD8-mCherry/TM3.Sb处女果蝇,然后将这两类果蝇进行杂交，最后从子代中挑选dpr-Gal4,UAS-mitoGFP/Cyo；UAS-mCD8-mCherry/TM6B.Tb,由此完成线粒体疾病果蝇模型构建。该模型的成果展示于图1，A为果蝇翅膀神经元分布与投射模式图，B为果蝇翅膀在显微镜下的外观形态，C为模型的细节展示。该模型的特征是，果蝇翅膀感觉神经细胞和细胞中的线粒体分别被绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白同时标记，神经细胞中线粒体形态和数量十分明确，神经束完好，从而实现了同时观察动物体内线粒体和神经细胞健康状况。

实施实例2：运用线粒体疾病研究模型进行线粒体致病基因筛选

该筛选模型的特征是神经细胞中线粒体形态和数量十分明确，神经束完好。通过遗传筛选，找到可以破坏神经细胞线粒体正常形态数量或者神经束完整性的基因。其具体实施流程如图2所示。携带RNAi基因的对照组果蝇购于美国布卢明顿果蝇品系中心，携带RNAi基因的实验组果蝇购于清华大学果蝇品系中心。

具体成果展示于图3。A部分是神经细胞近端与远端线粒体在对照组和实验组中的形态，从图中可以看出实验组果蝇的线粒体相比于对照组果蝇变得更加细碎B部分是神经束在实验组和对照组中3天和15天时的形态结构，从图中可以看出实验组果蝇的神经束相比于对照组果蝇在15天是出现显著地碎片化。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。