一种基于CRISPR‑Cas9的基因调控装置及基因调控方法

摘要

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas9的基因调控装置及基因调控方法，该基因调控装置包括一核苷酸序列，其本身是一sgRNA或者经转录成为一sgRNA，该sgRNA在结构上包括两个部分：与失活Cas9蛋白结合的第一部分和连接在第一部分的3’端的第二部分，其中第一部分的5’端有一段反义序列，第二部分是适体序列部分，其包括配体结合部分和适体茎部；当不存在配体时，反义序列与适体茎部配对结合；当存在配体时，反义序列与适体茎部解离以与目标DNA配对结合。通过将结合特异生物信号的RNA核糖开关整合到sgRNA，建立细胞信号强度与基因表达强度的桥梁，能够在识别生物信号的基础上，激活或者沉默任何一个目标基因，在信号配体与细胞基因之间建立人工联系。

说明书

技术领域

本发明涉及基因技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR-Cas9的基因调控装置及基因调控方法。

背景技术

真核细胞具有复杂的生物学行为，如增殖、凋亡、迁移和分化，这些均被细胞信号通路和遗传网络所密切调控。而细胞信号通路改造的关键节点在于建立特异性输入信号与输出信号的密切联系。合成生物学家为了更好地理解不同信号通路实现复杂生物学反应的机制，已开始设计出各种具有新型信号通路的工程化细胞。近期已有相关研究对构建新型传感器和信号处理系统做出了很好的阐述及探究，但这类信号处理系统并不能理想地将特异性信号的检测与内源基因的表达建立联系。因此，通过目前的技术手段改造细胞原有网络的拓扑结构仍然是一项重要挑战。

CRISPR-Cas系统由规律性重复短回文序列簇(clusteredregularly interspacedshort palindromic repeats,CRISPR)及CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)组成，而CRISPR-Cas9技术源自于细菌Ⅱ型CRISPR系统。备受瞩目的CRISPR-Cas9是一种新兴的以RNA介导的基因组编辑及修饰技术，通过向导RNA(single guide RNA,sgRNA)导向DNA识别、编辑及修饰。最近，相关研究证实在大肠埃希氏大肠杆菌和人类细胞中重组的CRISPR-Cas9系统可以作为一种基因组调节工具。在这些文献中，通过将效应器与失活核酸内切酶Cas9(endonuclease-deficient Cas9)融合，达到基因转录抑制和激活。研究人员还设计出在蓝光照射下的条件下，激活内源性基因转录的光诱导CRISPR-Cas9系统。因为sgRNA设计的便利，CRISPR-Cas9系统必会被在基础生物学、合成生物学等多个领域广泛利用。然而，受限于复杂多样的生物学信号，CRISPR-Cas9技术未能理想地改造内源性基因网络。

发明内容

本发明提供一种基于CRISPR-Cas9的基因调控装置及基因调控方法。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种基于CRISPR-Cas9的基因调控装置，该基因调控装置包括一核苷酸序列，该核苷酸序列本身是一sgRNA或者经转录成为一sgRNA，该sgRNA在结构上包括两个部分：与失活Cas9蛋白结合的第一部分和连接在上述第一部分的3’端的第二部分，其中上述第一部分的5’端有一段反义序列，上述第二部分是适体序列部分，其包括配体结合部分和适体茎部；当不存在配体时，上述反义序列与上述适体茎部配对结合；当存在配体时，上述反义序列与上述适体茎部解离以与目标DNA配对结合。

进一步地，上述sgRNA相对应的DNA序列如SEQ ID NO:17～50中的任一序列所示。

进一步地，上述配体是外源性配体或内源性配体。

进一步地，上述外源性配体是茶碱或四环素，上述内源性配体是噬菌体衣壳蛋白MS2。

进一步地，上述适体是茶碱适体、四环素适体或噬菌体衣壳蛋白MS2适体。

进一步地，上述基因调控装置还包括一蛋白，上述蛋白至少包括失活Cas9蛋白部分，任选地包括与上述Cas9蛋白部分融合的转录激活因子。

进一步地，上述转录激活因子是VP64蛋白。

进一步地，上述蛋白是dCas9-VP64融合蛋白和/或dCas9蛋白。

进一步地，上述基因调控装置还包括一配体，上述配体与上述配体结合部分结合。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种基于CRISPR-Cas9的基因调控方法，该基因调控方法采用第一方面的基因调控装置，上述方法包括将上述基因调控装置导入细胞中，并在失活Cas9蛋白和配体分子的存在下，调控目标DNA的表达。

本发明的有益效果是：创造性地通过将结合特异生物信号的RNA核糖开关——适体序列部分整合到sgRNA，建立细胞信号强度与基因表达强度的“桥梁”，上述的重组CRISPR-Cas9系统能够在识别任何生物信号的基础上，激活或者沉默任何一个目标基因，在信号配体与细胞基因之间建立人工联系。

附图说明

图1是一种实施方式的基因表达调控方法的工作原理示意图，包括重组sgRNA沉默靶基因(a)或激活靶基因(b)的概述，sgRNA在结构上包括两个部分：与失活Cas9蛋白(dCas9)结合的第一部分(M)和连接在第一部分(M)的3’端的第二部分(N)，其中第一部分(M)的5’端有一段反义序列(M1)，第二部分(N)是适体序列部分，其包括配体结合部分(N1)和适体茎部(N2)。在没有信号A(或B)的情况下，即不存在配体时，sgRNA的反义序列(M1)与适体茎部(N2)配对结合，这时sgRNA处于“关闭”状态；在具有信号A(或B)的情况下，即存在配体时，重组sgRNA结构改变，状态“打开”，此时，sgRNA的反义序列(M1)与其目标DNA配对结合，通过dCas9-VP64融合蛋白或dCas9蛋白激活或沉默B(或A)信号的输出生产。

图2是显示外源性配体调节性转录激活与沉默的实验结果图，VEGF的mRNA相对表达水平采用qRT-PCR方法检测，VEGF蛋白水平测定采用ELISA方法测定。在HEK293细胞中当四环素(a和b)/茶碱(c和d)存在时依赖dCas9/dCas9-VP64的作用，VEGF mRNA和蛋白水的表达水平被降低/升高，该图根据三次独立实验结果，值取平均值加减标准差。

图3是显示内源性配体调节性转录激活与沉默的实验结果图，MALAT1和UCA1的mRNA相对表达水平采用qRT-PCR方法检测。在HEK293细胞中当MS2蛋白质存在时依赖dCas9/dCas9-VP64的作用，MALAT1(a和b)和UCA1(c和d)的mRNA相对表达水平被降低/升高，该图根据三次独立实验结果，值取平均值加减标准差。

图4是显示由重组CRISPR-Cas9所建立的β-catenin信号通路与NF-kB信号通路的人工联系的结果图，(a)重组输入信号与输出信号的联系有助于建立新表型；(b)β-catenin信号转导通路与NF-kB信号通路之间建立了人工联系；(c)β-catenin/NF-kB信号通路下游基因的mRNA相对表达水平采用qRT-PCR方法检测，通过检测DPAGT1和APCDD1的mRNA相对水平体现LTD4的刺激作用；通过检测BFL1和MET的mRNA相对水平体现LTD4在转染CRISPR-Cas9后的刺激作用；(d)β-catenin/NF-kB信号通路下游基因的mRNA相对表达水平采用qRT-PCR方法检测。通过检测BFL1和MET的mRNA相对水平体现TNF-a的刺激作用，通过检测DPAGT1和APCDD1的mRNA相对水平体现TNF-a在转染CRISPR-Cas9后的刺激作用；该图根据三次独立实验结果，值取平均值加减标准差。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

图1示出了一种实施方式的基因表达调控方法的工作原理示意图，包括重组sgRNA沉默靶基因(a)或激活靶基因(b)的概述，sgRNA在结构上包括两个部分：与失活Cas9蛋白(dCas9)结合的第一部分(M)和连接在第一部分(M)的3’端的第二部分(N)，其中第一部分(M)的5’端有一段反义序列(M1)，第二部分(N)是适体序列部分，其包括配体结合部分(N1)和适体茎部(N2)。在没有信号A(或B)的情况下，即不存在配体时，sgRNA的反义序列(M1)与适体茎部(N2)配对结合，这时sgRNA处于“关闭”状态；在具有信号A(或B)的情况下，即存在配体时，重组sgRNA结构改变，状态“打开”，此时，sgRNA的反义序列(M1)与其目标DNA配对结合，通过dCas9-VP64融合蛋白或dCas9蛋白激活或沉默B(或A)信号的输出生产。

在本发明中，配体可以是外源性配体或内源性配体。其中，外源性配体例如茶碱或四环素，内源性配体例如噬菌体衣壳蛋白MS2。相应地，适体可以是茶碱适体、四环素适体或噬菌体衣壳蛋白MS2适体。

需要说明的是，本发明所谓的“基因调控装置”，至少包括一核苷酸序列，该核苷酸序列本身是一sgRNA或者经转录成为一sgRNA，该sgRNA在结构上具有上述描述的特点。也就是说，在一些情况下，本发明的基因调控装置本身就是sgRNA，其是在CRISPR-Cas9系统的sgRNA的基础上，经改造得到的序列结构，这种sgRNA通过一定的基因转导策略(包括但不限于电转)导入细胞内，在dCas9蛋白或者与dCas9蛋白融合的融合蛋白(例如dCas9-VP64)以及相应的外源性配体或内源性配体的存在下，即可激活或沉默相应的目标基因表达。在另一些情况下，本发明的基因调控装置是通过转录可以得到具有上述结构特点的sgRNA的核苷酸序列，该核苷酸序列可以表现为重组质粒，该重组质粒转入细胞内，能够转录出具有上述结构特点的sgRNA，从而在dCas9蛋白或者与dCas9蛋白融合的融合蛋白(例如dCas9-VP64)以及相应的外源性配体或内源性配体的存在下，可激活或沉默相应的目标基因表达。

需要特别强调的是，本发明的基因调控装置只要具有上述描述的结构特征即可，对其具体序列并不做限制，也就是说任何一核苷酸序列，只要其是一具有上述结构特征的sgRNA或者经转录成为一具有上述结构特征的sgRNA，即可称为本发明的基因调控装置。

在本发明优选的实施方案中，基因调控装置还包括一蛋白，该蛋白至少包括失活Cas9蛋白部分，任选地包括与Cas9蛋白部分融合的转录激活因子(例如VP64蛋白)。

在本发明优选的实施方案中，基因调控装置还包括一配体，该配体与sgRNA的配体结合部分结合。

以下通过实施例详细说明本发明的技术方案和技术效果。应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。

I.技术与方法

1.基因调控元件的构建

通过分别转染质粒pcDNA-dCas9-HA(Plasmid#61355,Addgene)和质粒M-SPn-VP64(Plasmid#48674,Addgene)，令HEK293T细胞瞬时表达失活Cas9蛋白或Cas9-VP64融合蛋白。

sgRNA质粒的构建过程：设计相关cDNA，合成后插入到质粒pGPU6/GFP/Neo的BamHI/Bbs I位点。

pcDNA3-MS2的构建过程：将MS2基因的cDNA序列插入到质粒pcDNA3的BamHI/EcoRI。

2.细胞培养和转染

T24(膀胱癌细胞)，HEK293T(人胚肾脏细胞)购自美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，Manassas，USA)。细胞系用10％的胎牛血清(Invitrogen)和1％的双抗的DMEM培养基(Invitrogen,CA)培养，贴壁生长，37℃和5％CO₂条件下培养，0.05％胰酶消化传代。对于瞬时转染实验，根据Lipofectamine2000说明书，当细胞密度达到70-80％后，使用Lipofectamin2000试剂及质粒的混合液处理细胞。

3.RNA提取和实时定量PCR

总RNA提取按照TRIzol RNA提取试剂(Invitrogen,Grand Island,NY,USA)操作说明进行，Nanodrop测定总RNA的含量和浓度。总RNA按照RevertAidTM First Strand cDNASynthesis Kit(Fermentas,Hanover,MD)逆转录试剂盒操作说明逆转录成cDNA。实时定量PCR按照All-in-OneTM qPCR Mix试剂(GeneCopoiea Inc,Rockville,MD)操作说明利用ABIPRISM 7000荧光定量PCR系统(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)执行。PCR循环参数如以下所示：95℃保持15分钟,接着40个循环：94℃保持15秒，55℃保持30秒和72℃保持30秒。每次试验至少重复三次。内参对照基因为GAPDH基因，所有数据均参照GPADH的表达作归一化处理。PCR用到的引物序列如表1所示。

表1.实时荧光定量qPCR所用的引物

名称序列VEGF-FACAGACACCGCTCCTAGCCC(SEQ ID NO:1)VEGF-RCGAGAACAGCCCAGAAGTTGG(SEQ ID NO:2)MALAT1-FAAAGCAAGGTCTCCCCACAAG(SEQ ID NO:3)MALAT1-RGGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA(SEQ ID NO:4)UCA1-FACGCTAACTGGCACCTTGTT(SEQ ID NO:5)UCA1-RTGGGGATTACTGGGGTAGGG(SEQ ID NO:6)APCDD1-FGGATCATCTATCGGTCAGACG(SEQ ID NO:7)APCDD1-RTGGGTCACATCCTGCTGGATG(SEQ ID NO:8)MET-FGCAGAAACCCCCATCCAGAATGTC(SEQ ID NO:9)MET-RGGCCCCTGGTTTACTGACATACGC(SEQ ID NO:10)DPAGT1-FCAATGCCATCAATATCCTA(SEQ ID NO:11)DPAGT1-RAATCACCTTCCAACTCTA(SEQ ID NO:12)BFL1-FATAACACAGGAGAATGGAT(SEQ ID NO:13)BFL1-RAGTATTGCTTCAGGAGAG(SEQ ID NO:14)GAPDH-FCGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC(SEQ ID NO:15)GAPDH-RATCCGTTGACTCCGACCTTCAC(SEQ ID NO:16)

4.酶联免疫吸附测定VEGF蛋白浓度

VEGF蛋白浓度测定按照酶联免疫吸附测定操作说明进行。简单而言，收集并裂解10⁶个样本细胞，离心后收集细胞上的清液。酶标仪(Bio-Rad,Hercules,CA)通过检测比色反应和光密度(OD值)定量VEGF蛋白。然后OD值被转换为通过标准曲线的蛋白浓度。每次实验进行至少三次。

II.实验结果

1.信号转换基因调控质粒的构建

发明人基于CRISPR-Cas9及其衍生技术和核酸开关构建一个建立外源性配体与内源性基因人工联系的基因调控装置(如图1所示)，该装置整合了核酸开关(是指适体序列部分)和sgRNA，接受特异外源信号后，可通过dCas9和dCas9-VP64融合蛋白沉默或激活靶基因。当特异性信号A(或B)结合适体分子结构后可诱导sgRNA的反义链结构改变，使其可以与其对应的DNA序列靶向结合后干扰转录，最终引起另一信号B(或A)的改变。当缺乏特异性信号时，因sgRNA反义链被适体的反义链的茎部结合，对靶基因的转录不具有影响。这种方法将现有sgRNA改变为能够将信号输入与异种信号输出联系在一起的RNA元件。

2.外源性配体可调节性转录激活与沉默

为了进一步在人HEK293T细胞中验证这种调控方法，选择内源性VEGF基因作为靶基因。设计了四个靶向VEGF的sgRNA，同时在每个sgRNA的3'端插入修饰后的四环素适体(适配体)。四环素适体反义链的茎部按前述修饰后可与sgRNA的反义链结构域互补配对。qRT-PCR和ELISA的结果表明，只有在四环素存在的条件下，dCas9和重组sgRNA复合体才具有有效的沉默效果(如图2a所示)。当在HEK239T细胞内表达dCas9-VP64融合蛋白时，sgRNA同样能够在四环素刺激下激活基因表达。加入四环素后，所设计的四个sgRNA分别跟dCas9-VP64共同表达后均可显著提高VEGFA mRNA和蛋白表达水平(如图2b所示)。为了进一步验证这种模块化设计方法的有效性，通过用茶碱适体代替四环素适体来改造sgRNA。而改造后的sgRNA的茎部与先前设计的序列保持一致。当茶碱适体sgRNA与dCas9或dCas9-VP64共同表达时，且在茶碱刺激下得到与上述类似的效应(如图2c和2d所示)。

图2中，VEGF的mRNA相对表达水平采用qRT-PCR方法检测，VEGF蛋白水平测定采用ELISA方法测定。在HEK293T细胞中当四环素(图a和图b)/茶碱(图c和图d)存在时，依赖dCas9/dCas9-VP64的作用，VEGF mRNA和蛋白的表达水平被降低/升高。根据三次独立实验结果，值取平均值加减标准差。图a中，左图的纵坐标表示VEGF mRNA相对表达水平，坐标值由下至上分别是0.0、0.2、0.4～1.2；右图的纵坐标表示VEGA蛋白水平，坐标值由下至上分别是0、100、200～600，单位是pg/ml；空白柱表示Tetracycline(-)，即没有四环素刺激；实心柱表示Tetracycline(+)，即有四环素刺激；对于横坐标，从左至右分别是dCas9、dCas9+sgRNA1、dCas9+sgRNA2、dCas9+sgRNA3和dCas9+sgRNA4。图b中和图a的区别是，左图的纵坐标值由下到上是0、1、2～10，右图的纵坐标值由下至上是0、500、1000～2500，横坐标上，从左至右分别是dCas9-VP64、dCas9-VP64+sgRNA5、dCas9-VP64+sgRNA6、dCas9-VP64+sgRNA7和dCas9-VP64+sgRNA8。图c和图a的主要区别是横坐标分别是dCas9、dCas9+sgRNA9、dCas9+sgRNA10、dCas9+sgRNA11和dCas9+sgRNA12。图d和图b的主要区别是横坐标分别是dCas9-VP64、dCas9-VP64+sgRNA13、dCas9-VP64+sgRNA14、dCas9-VP64+sgRNA15和dCas9-VP64+sgRNA16。sgRNA1～16的DNA序列分别如表2中的SEQ ID NO:17～32所示。

3.内源性配体调节性转录激活与沉默。

为了进一步验证重组CRISPR-Cas9系统能否对内源性蛋白进行应答并调节相关基因表达，将噬菌体衣壳蛋白MS2适体整合到sgRNA的相应结构上并测试其相应的效应。选择长链非编码RNA MALAT1和UCA1作为靶基因。在HEK293T细胞测试中，表达MS2和重组CRISPR-Cas9系统与不表达MS2或不表达sgRNA的系统对比，MALAT1的表达具有差异性。其中表达dCas9可诱导沉默MALAT1表达(如图3a所示)，而表达dCas9-VP64可诱导激活MALAT1表达(如图3b所示)。当靶基因改为UCA1时，通过重组CRISPR-Cas9系统取得了同样的效果(如图3c和3d所示)。以上数据提示通过重组CRISPR-Cas9系统可建立出内源性蛋白与基因表达之间的人工联系。图3中，sgRNA17～32的DNA序列分别如表2中的SEQ ID NO:33～48所示。

4.β-catenin信号通路与NF-kB信号通路的人工联系

按以往经验，合成生物学家为了在细胞创造出新功能，常设计出可替代的基因网络。由于以上的实验结果均提示重组CRISPR-Cas9系统能够有效地在两个特异性信号建立全新的联系，因此发明人便尝试重塑细胞经典信号网络的拓扑结构(如图4a所示)。通过这种方法，在β-catenin信号通路和NF-kB信号通路之间建立两种类型的人工联系。在这次设计中，β-catenin信号的激活可以激活NF-kB信号通路，而NF-kB信号被激活时可抑制β-catenin信号通路(如图4b所示)。将β-catenin或NF-kB适体与sgRNA结合来识别NF-kB(p65)或β-catenin(CTNNB1)，并在膀胱癌细胞系T24中表达dCas9或dCas9-VP64。结果表明当在细胞中加入β-catenin激活剂LTD4时，β-catenin的下游基因(DPAGT1和APCDD1)表达水平提高。与阴性对照相比，仅在重组CRISPR-Cas9作用下LTD4可以明显提高NF-kB的下游基因(BFL1和MET)的mRNA表达水平(如图4c所示)。通过检测BFL1和MET的表达水平来检测TNF-a对NF-kB信号通路的刺激作用。在实验组和对照组中，在TNF-a刺激下以上两个基因表对均明显提高。与此同时，仅dCas9实验组中DPAGT1和APCDD1mRNA表达水平测明显下调(如图4d所示)。以上结果均证实该基因调控模式可以有效地重新改编细胞内源性的信号网络。图4中，sgRNA33～34的DNA序列分别如表2中的SEQ ID NO:49～50所示。

图4由重组CRISPR-Cas9所建立的β-catenin信号通路与NF-kB信号通路的人工联系。(a)重组输入信号与输出信号的联系有助于建立新表型。(b)β-catenin信号转导通路与NF-kB信号通路之间建立了人工联系。(c)β-catenin/NF-kB信号通路下游基因的mRNA相对表达水平采用qRT-PCR方法检测。通过检测DPAGT1和APCDD1的mRNA相对水平体现LTD4的刺激作用。通过检测BFL1和MET的mRNA相对水平体现LTD4在转染CRISPR-Cas9后的刺激作用。(d)β-catenin/NF-kB信号通路下游基因的mRNA相对表达水平采用qRT-PCR方法检测。通过检测BFL1和MET的mRNA相对水平体现TNF-a的刺激作用。通过检测DPAGT1和APCDD1的mRNA相对水平体现TNF-a在转染CRISPR-Cas9后的刺激作用。根据三次独立实验结果，值取平均值加减标准差。

表2 sgRNAs对应的DNA序列

注：本发明中，sgRNA对应的DNA序列以表2所记载的内容为准。

5.结论

在本次研究中，结果证实重组CRISPR-Cas9系统可创造出对自设信号进行特异性应答的细胞。通过这种方法将更好地理解自然基因网络的设计原则。受益于细胞信号编辑技术的进步，各种强大的应用将会呈现在基础生物学和应用生物学领域中。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。