法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-10-02
授权
授权
2017-02-08
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N30/02 申请日:20160914
实质审查的生效
2017-01-11
公开
公开
技术领域
本发明涉及凉茶植物饮料质量控制技术领域，特别是涉及一种王老吉凉茶中间品挥发性成分指纹图谱的构建方法及检测方法。
背景技术
岭南凉茶文化拥有悠久的历史积蕴和民俗内涵。古时岭南为百越之地，多瘴气，染者无有不死。岭南人民在与恶劣自然环境的不断抗争中，积累了调理保健、防病治病的宝贵经验。他们根据本地的气候、水土特性，以一些具有清热解毒、生津止渴、祛火除湿等功效的岭南特色中草药为基础，在中医养生理论指导下经过长期实践，创造出各种各样的″凉茶″，用于防病治病，形成了一条岭南文化的独特风景线。
王老吉凉茶是历史最早的广东凉茶，始创于1828年(清道光八年)，至今已有180多年历史，被公认为凉茶始祖，有″药茶王″之称。最近几十年，随着现代化生产设备和先进管理理念的引入，凉茶业发生了大变革，过去守着凉茶铺喝凉茶的局面被打破，凉茶被加工成饮用更方便的颗粒剂、袋泡茶、利乐包、罐装等多种规格。
王老吉凉茶以水、白砂糖、仙草、蛋花、菊花、夏枯草、甘草、金银花、布渣叶为原料，经提取、浓缩、配制、灭菌、包装等主要加工工艺制成，其口感清凉爽口，冷热饮用皆宜，受到消费者的喜爱。为全面的反映及监控该品种的内在质量，促进该品种的发展，应开展该品种的指纹图谱研究。
发明内容
本发明提供一种王老吉凉茶中间品挥发性成分指纹图谱的构建方法及检测方法，用以对王老吉凉茶中间品的质量进行检测和监控，实现全面保证王老吉凉茶质量的目的。
一种王老吉凉茶中间品挥发性成分指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1)内标溶液的配制：
精密称取棕榈酸，以乙酸乙酯溶解并定容，即得内标溶液；
(2)供试品溶液的制备：
精密量取王老吉凉茶中间品，以乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯上清液，即得供试品溶液；
(3)分别精密吸取上述内标溶液和供试品溶液，混合后注入气相色谱仪测定，得到具有共有特征峰的王老吉凉茶中间品挥发性成分指纹图谱。
上述王老吉凉茶中间品挥发性成分指纹图谱的构建方法，经过本发明人长久积累的经验以及大量实验后，选取了乙酸乙酯为提取溶剂，棕榈酸作为指纹图谱中的内参物，与其它共有特征峰相配合，能够较好的表征王老吉凉茶中间品中加入的各成分，并且具有稳定性好的特点。
在其中一个实施例中，步骤(3)中，气相色谱仪的测定条件如下：
色谱柱：聚乙二醇类聚合物为固定相的毛细管色谱柱；
升温程序：初始温度为50℃-70℃，以梯度升温的方式升温至220℃-240℃
检测器：FID检测器。
以聚乙二醇类聚合物为固定相的毛细管色谱柱作为固定相，再通过梯度升温的方式，能够将王老吉凉茶中的挥发性成分在气相色谱图中表征，建立能够较好表征王老吉凉茶中间品挥发性成分质量的指纹图谱。
在其中一个实施例中，步骤(3)中，气相色谱仪的测定条件还包括：
载气：氮气；
柱流量：2.8ml/min-3.2ml/min；
氢气流量：35ml/min-45ml/min；
空气流量：350ml/min-450ml/min；
进样口温度：210℃-240℃；
检测器温度：240℃-260℃。
选用上述检测条件，王老吉凉茶中间品中的挥发性成分能在指纹图谱上具有较好的分离效果。
在其中一个实施例中，所述梯度升温的方式为：初温为60℃，保持5min，以5℃/min升温至195℃，再以2℃/min升温至230℃，保持10min。
选用上述梯度升温条件，能够使王老吉凉茶中间品中的挥发性成分在气相色谱中分离，并具有较好峰型、分离度及分离效果，从而更好地以指纹图谱表征王老吉凉茶中间品中含有的中药化学成分群中各挥发性成分。
在其中一个实施例中，步骤(3)中，所述共有特征峰为13个，其与棕榈酸的相对保留时间分别为0.25-0.27，0.32-0.34，0.35-0.36，0.39-0.41，0.49-0.50，0.51-0.52，0.53-0.54，0.74-0.75，0.76，0.77-0.78，0.81-0.83，0.91—0.93，1.27-1.28。选用上述保留时间的色谱峰作为共有特征峰，既具有代表性，又具有重现性好的优点。
在其中一个实施例中，所述共有特征峰中，以棕榈酸的色谱峰为内参峰，设定该棕榈酸的色谱峰的相对保留时间为1.0，上述相对保留时间为0.76的特征峰的相对峰面积为1.0，构建得到由上述共有特征峰构成的王老吉凉茶中间品挥发性成分指纹图谱。
在充分考察了各共有特征峰的特点后，选择内标棕榈酸的色谱峰作为内参峰，并以相对保留时间为0.76的第9号峰的相对峰面积为1，在指纹图谱相似度评价时具有较好的评价效果。
在其中一个实施例中，步骤(2)中，将王老吉凉茶中间品与乙酸乙酯按照体积比为1∶1.5-2.5的体积比进行超声提取，随后取乙酸乙酯上清液即得供试品溶液。
本发明还公开了一种王老吉凉茶中间品挥发性成分指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
(1)内标溶液的配制：
精密称取棕榈酸，以乙酸乙酯溶解并定容，即得内标溶液；
(2)供试品溶液的制备：
精密量取王老吉凉茶中间品，以乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯上清液，即得供试品溶液；
(3)分别精密吸取上述内标溶液和供试品溶液，混合后注入气相色谱仪进行检测。
上述王老吉凉茶中间品挥发性成分指纹图谱的检测方法，以棕榈酸作为指纹图谱中的参照物，并且具有稳定性好的特点。
在其中一个实施例中，将步骤(3)检测得到的供试品溶液色谱图与上述构建方法得到的指纹图谱比较，计算相似度，对王老吉凉茶中间品的质量进行评价。
在其中一个实施例中，步骤(3)中，气相色谱仪的测定条件如下：
色谱柱：聚乙二醇类聚合物为固定相的毛细管色谱柱；
升温程序：初温为60℃，保持5min，以5℃/min升温至195℃，再以2℃/min升温至230℃，保持10min。
载气：氮气；
柱流量：2.8ml/min-3.2ml/min；
氢气流量：35ml/min-45ml/min；
空气流量：350ml/min-450ml/min；
进样口温度：210℃-240℃；
检测器：FID检测器；
检测器温度：240℃-260℃。
采用上述检测条件，能够使王老吉凉茶中间品中的挥发性成分在气相色谱中分离，并具有较好峰型、分离度及分离效果，从而更好得以指纹图谱表征王老吉凉茶中含有的中药化学成分群中的挥发性成分。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种王老吉凉茶中间品挥发性成分指纹图谱的构建方法，选取了棕榈酸作为内标，即内参物，在对指纹图谱相似度评价时具有较好的评价效果，具有稳定性好的特点，既能有效表征王老吉凉茶中间品的质量，又有利于监控产品的质量，并且，还为谱效学的研究奠定了基础。
特别是，本发明对王老吉凉茶挥发性成分的控制，能够更好的监控产品风味物质的情况，为王老吉凉茶的口感保证提供了技术支持。
并且，该构建方法还确定了供试品溶液的制备以及整个构建过程中各步骤的最优参数，能有效表征王老吉凉茶中间品的质量，有利于监控产品的质量。
本发明的一种王老吉凉茶挥发性成分指纹图谱的检测方法，能够全面的表征王老吉凉茶中的挥发性成分，并且具有稳定性好的特点，既能有效表征王老吉凉茶中间品的质量，又有利于监控产品的质量。该检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好的优点；可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。
附图说明
图1为实施例1中正己烷部位的气相色谱图；
图2为实施例1中石油醚部位的气相色谱图；
图3为实施例1中乙醚部位的气相色谱图；
图4为实施例1中乙酸乙酯部位的气相色谱图；
图5为实施例1中5ml乙酸乙酯第二次萃取的气相色谱图；
图6为实施例1中OV-1701柱子的气相色谱图；
图7为实施例1中分流比为20∶1的气相色谱图；
图8为实施例1中分流比为10∶1的气相色谱图；
图9为实施例1中分流比为5∶1的气相色谱图；
图10为实施例1中内标棕榈酸与样品气相色谱图；
图11为实施例1中10批样品的气相色谱图与对照谱图；
图12为实施例1中凉粉草的气相色谱图；
图13为实施例1中鸡蛋花的气相色谱图；
图14为实施例1中金银花的气相色谱图；
图15为实施例1中夏枯草的气相色谱图；
图16为实施例1中布渣叶的气相色谱图；
图17为实施例1中甘草的气相色谱图；
图18为实施例1中菊花的气相色谱图；
图19为实施例1中不同阴性药材与样品的气相色谱图；
图20为实施例1中乙酸乙酯空白溶剂的气相色谱图；
图21为实施例1中样品的气相色谱图；
图22为实施例1中样品120min内的气相色谱图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
本实施例为王老吉凉茶挥发性成分指纹图谱的构建方法。
一、仪器与设备
日本岛津GC-2010AF气相色谱仪，FID检测器，GC solution色谱工作站，高纯氮气，GH-400高纯氢发生器(北京中兴汇利科技发展有限公司)，GA-380A低噪音空气泵(北京中兴汇利科技发展有限公司)。
二、材料与试剂
王老吉凉茶中间品(共10批次)由广州王老吉药业股份有限公司提供。正己烷(广东光华科技股份有限公司)、石油醚(天津市致远化学试剂有限公司)、乙醚(广州化学试剂厂)、乙酸乙酯(广州化学试剂厂)均为分析纯。对照品棕榈酸购自上海麦克琳，纯度在99％以上。
三、方法
(一)、条件筛选。
A、样品处理方法筛选。
实验分别采用正己烷、石油醚、乙醚、乙酸乙酯4种有机溶剂对王老吉凉茶中间品的样品进行液液萃取，以下述色谱条件进行检测：色谱柱为DB-WAX毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；载气为高纯氮气；进样量1μl；分流比10∶1；检测器温度250℃；进样口温度230℃；柱流量3.0ml/min；氢气流量40.0ml/min；空气流量400ml/min；升温程序：初温60℃，保持5min，以5℃/min升温至195℃，再以2℃/min升温至230℃，保持10min。测定得到图1-图4所示的气相色谱图。
从结果中可以看出，正己烷及石油醚萃取部位色谱峰数量少且丰度小，即这两种溶剂对样品中挥发性成分提取效果差；乙醚萃取部位的色谱峰信息没有乙酸乙酯部位多，特别表现在低沸点化合物部分，且色谱峰的总体丰度也没有乙酸乙酯部位高，故最终确定最佳萃取溶剂为乙酸乙酯。
分别用10ml、5ml乙酸乙酯溶剂两次萃取5ml的王老吉凉茶中间品样品溶液，将两次的萃取液分别进气相分析，第二次的萃取液气相色谱图如图5所示。
结果表明第二次的5ml萃取液中绝大部分色谱峰消失，即用10ml乙酸乙酯一次萃取即可基本萃取完全。
B、气相分析方法优化。
按照上述色谱条件，以OV-1701柱子替换上述DB-WAX柱子，进行分析测定，其气相色谱图如图6所示。
对比上述OV-1701柱子和DB-WAX柱子的分析结果，结果显示，DB-WAX柱子的选择性及分离效果优于OV-1701柱子(图4、图6)。
按照上述色谱条件，以不同的分流比(20∶1、10∶1、5∶1)进行分析测定，其气相色谱图如图7-图9所示。结果表明分流比为10∶1的进样浓度适中，色谱图的分离效果及直观上表现较好。
C、参照物的选择。
棕榈酸化学性质比较稳定，且经实验考察确认其对其他化学成分的峰面积无干扰，实验最终将棕榈酸加入样品供试液中作为内参物(内标)。
(二)、指纹图谱的构建方法。
1、内标溶液的配制。
取棕榈酸2mg，精密称定，乙酸乙酯定容至2ml，作为内标溶液。
2、供试品溶液的制备。
王老吉凉茶中间品供试品溶液：精密吸取各批次的王老吉凉茶中间品样品5ml，乙酸乙酯10ml萃取，分取乙酸乙酯层，浓缩至2ml，即得供试品溶液。
单味原料药材供试液：分别取7味药材(仙草、蛋花、菊花、夏枯草、甘草、金银花、布渣叶)约1g，精密称定，加乙酸乙酯25ml，超声提取15min，离心，取上清液，即得。
3、指纹图谱建立。
(1)、检测条件。
气相色谱测定条件如下：
色谱柱：DB-WAX毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)，为聚乙二醇类聚合物为固定相的毛细管色谱柱；
升温程序：初温为60℃，保持5min，以5℃/min升温至195℃，再以2℃/min升温至230℃，保持10min。
载气：氮气；
进样量：1μl；
分流比：10∶1；
柱流量：3ml/min；
氢气流量：40ml/min；
空气流量：400ml/min；
检测器：FID检测器；
进样口温度：230℃；
检测器温度：250℃。
分别精密吸取王老吉凉茶中间品样品供试液1.0ml及内标溶液60μl，混合摇匀，精密吸取1μl，注入气相色谱仪，按照上述条件测定，得到图11所示的10个不同批次样品的气相色谱图(图中S1-S10分别表示10个不同批次样品)。
再分别精密吸取步骤2中制备的单味原料药材供试液1μl，注入气相色谱仪，按照上述条件测定，进行各单味药材对照试验，对各组成药味与样品间的相关性进行研究，确定主要色谱峰的药味归属。分别得到如图12-图18所示的凉粉草、鸡蛋花、金银花、夏枯草、布渣叶、甘草、和菊花的气相色谱图。
制备不同药材为阴性的中间品样品，按照上述确定的处理方法进行处理，注入气相色谱仪，按照上述条件测定，分别得到如图19所示的阴性凉粉草、阴性鸡蛋花、阴性金银花、阴性夏枯草、阴性布渣叶、阴性甘草、和阴性菊花的气相色谱图。
(2)、分析。
A、10批样品共有特征峰的标定。
按照上述方法，选用10个不同批次的王老吉凉茶中间品(由广州王老吉药业股份有限公司提供)，进行测定，得到如图11所示的10个不同批次样品(S1-S10)的气相色谱图，将气相色谱结果的文件导入″中药色谱指纹图谱相似度评价系统″(2004A版)，得到样品叠加图及对照图谱，如图11所示，图中R为对照图谱。，初步标定13个共有特征峰，以棕榈酸为内参物(S峰)，计算各特征峰与S峰的相对保留时间；以9号峰的峰面积为1，计算其它各共有特征峰的相对峰面积，其相对保留时间和相对保留峰面积结果如下表所示。
表1.10批样品中各共有峰的相对保留时间值
表2.10批样品中各共有峰的相对保留峰面积值
从上述结果中可以看出，10批的王老吉样品特征指纹峰的相对保留时间基本一致，但其相对峰面积值有一定的差异，即10批样品中各挥发性成分的含量具有差异。
B、样品指纹图谱分析。
采用各单味药材对照试验，对各组成药味与样品间的相关性进行研究，确定主要色谱峰的药味归属，各药材色谱图见图12-图18。
分析色谱图发现：1号峰在各药材中均有体现，2、3号峰主要由甘草、菊花贡献，13号峰除甘草、夏枯草外其它药材具有体现，而样品色谱图中15～40min间的色谱峰未能在成方7味药材中找到相应归属，造成这种结果可能是因为样品为经过制剂过程得到，而药材为固体粉末，未经制剂处理，所以最终得到的色谱峰信息有所差异。
通过各药材阴性与样品对照，如图19所示，根据色谱峰峰面积的减少程度来判断其主要药材归属。
结果显示，1、4、7、8、13号峰由7味药材共同体现，2、3号峰由布渣叶、凉粉草外其它药材贡献，5、6号峰由凉粉草外的其它药材贡献，9号峰主要由布渣叶、菊花、鸡蛋花贡献，10号峰主要由凉粉草贡献，11号峰主要由金银花外的其它药材贡献，12号峰主要由布渣叶、鸡蛋花贡献。
依据以上各味药材和阴性实验分析可知，该指纹图谱能够体现组成王老吉凉茶7味药材的信息，观察各阴性药材中色谱峰的缺失程度可知，菊花、鸡蛋花对王老吉凉茶挥发性成分指纹图谱的贡献最大，而凉粉草的贡献则最少，对样品中各共有特征峰的归属见下表所示。
表3.气相指纹图谱中特征峰的归属
C、10批样品指纹图谱相似度评价。
以″中药色谱指纹图谱相似度评价系统″(2004A版)对10批中间品样品GC图谱进行评价，相似度计算结果见下表所示。
表4.相似度评价
从上述结果中可以看出，本实验采用气相色谱法对10批王老吉凉茶中间品样品进行指纹图谱分析，其中能检测到的绝大多数色谱峰均得到很好的分离，并标定了13个共有指纹峰为特征图谱。通过与各味药材及阴性对照试验，结果13个共有指纹峰可归属到成方7味药材中，即本实验建立的王老吉凉茶挥发性成分指纹图谱可表达王老吉凉茶成方7味药材的整体信息，可用于其质量评价。且10批王老吉凉茶样品的图谱相似度均在0.98以上，说明本实验建立的王老吉凉茶挥发性成分指纹图谱与对照图谱的相似度较高，可体现其共性特征，可用于控制其质量。
4、方法学考察。
(1)空白试验
吸取乙酸乙酯空白溶液1μl，注入气相色谱仪，按照上述建立的色谱条件测定，观察乙酸乙酯溶剂峰对样品色谱峰的影响情况。实验色谱图(图20和图21)表明，乙酸乙酯溶剂峰主要为3min前的色谱峰，对样品色谱峰的影响不大。
(2)精密度试验。
取同一供试品溶液(S3)，按上述测定方法测定，连续进样5次，各共有峰相对保留时间的RSD值均小于0.05％，相对峰面积的RSD值均小于4.12％，表明仪器的精密度良好。
(3)重复性试验。
取同一批待测样品(S3)6份，按上述测定方法测定，各共有峰相对保留时间的RSD值均小于0.05％，相对峰面积的RSD值均小于4.83％，表明该方法的重复性良好。
(4)稳定性试验。
取同一供试品溶液(S3)，按上述测定方法，分别于0、2、4、8、12、24h进样分析，结果各共有峰相对保留时间的RSD值均小于0.05％，相对峰面积的RSD值均小于4.72％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
(5)分析时间考察。
吸取供试品溶液1μl，注入气相色谱仪，按照上述色谱条件运行120min，记录色谱图(图22)。从样品的2h色谱图可以看出，在59min后没有色谱峰出现，即样品中挥发性成分在59min前已出峰完全，故采集时间确定为59min。
实施例2
王老吉凉茶中间品挥发性成分指纹图谱的检测方法。
本实施例利用王老吉凉茶中间品挥发性成分指纹图谱对王老吉凉茶进行检测，具体如下：
一、仪器与设备
同实施例1。
二、材料与试剂
另取10批王老吉凉茶中间品样品(由广州王老吉药业股份有限公司提供)，其它材料与试剂同实施例1。
三、方法
1、内标溶液的配制：同实施例1。
2、供试品溶液的制备：同实施例1。
3、检测。
(1)、色谱条件：同实施例1。
分别精密吸取王老吉凉茶中间品样品供试液1.0ml及内标溶液60μl，混合摇匀，精密吸取1μl，注入气相色谱仪，按照上述条件测定，得到10个不同批次样品的气相色谱图
(2)、评价分析。
利用上述检测方法分别对10批王老吉凉茶样品进行检测，记录色谱图并导入中药色谱相似度评价系统软件(2004A版处理)，与实施例1得到的对照图谱比较，计算相似度，相似度计算结果见下表。
表5.相似度计算结果
从上述结果可以看出，各批样品相似度均大于0.90。表明王老吉凉茶挥发性成分指纹图谱的相似度较高，可以作为王老吉凉茶质量控制和评价指标。
实施例3
本实施例利用王老吉凉茶挥发性成分指纹图谱对王老吉凉茶进行检测，与实施例2基本相同，不同之处在于：
本实施例中的王老吉凉茶样品的制备中，分别不投料布渣叶、甘草、鸡蛋花、金银花、菊花、夏枯草、或仙草，分别制得阴性布渣叶、阴性甘草、阴性鸡蛋花、阴性金银花、阴性菊花、阴性夏枯草、阴性仙草的王老吉凉茶不合格品，再以上述指纹图谱对该王老吉凉茶不合格品进行检测，记录色谱图并导入中药色谱相似度评价系统软件(2004A版处理)，与实施例1得到的对照图谱比较，如图19所示，计算相似度，结果如下表所示。
表6各阴性样品与共有模式的相似度
从上述结果可以看出，不合格品的相似度均小于0.9。表明王老吉凉茶挥发性成分指纹图谱可以作为王老吉凉茶中间品质量控制和评价指标。并且，本发明能有效表征王老吉凉茶的质量，有利于监控产品的质量；具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好；可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
机译： 基于毛细管四色荧光电泳检测系统和多重荧光PCR扩增的高通量棉花品种DNA指纹图谱构建方法
机译： 同时测定思茅汤多组分的方法及其指纹图谱的构建方法
机译： 药理学指纹图谱和定量构效关系的一级文库的构建
