鉴定黑色羊肚菌类群中四个种的交配型方法和引物对

摘要

本发明涉及鉴定黑色羊肚菌类群中四个种的交配型方法和引物对，属于生物技术领域，该方法为提取待测菌株DNA作为模板，以引物对P7‑2F/P7‑2R或P8‑5F/P8‑5R进行PCR扩增能获得预期条带的菌株为MAT1‑1交配型，以引物对P10‑1F/P10‑2R或P10‑2F/P10‑3R进行PCR扩增能获得预期条带的菌株为MAT1‑2交配型，2条预期的扩增条带都能检测到的菌株则具有两种交配型。这四个引物对可以通用于上述四种羊肚菌的交配型检测。本发明的检测结果特异性强，稳定可靠快速，适用于羊肚菌菌种选育、栽培、交配型基因和系统发育方面的研究。

说明书

技术领域

本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种鉴定梯棱羊肚菌（Morchella>importuna）、六妹羊肚菌（Morchella>）、七妹羊肚菌(Morchella>)和高羊肚菌(Morchella>)交配型的分子检测方法和通用特异引物对。本发明技术适用于羊肚菌菌种选育、栽培、交配型基因和系统发育方面的研究。

背景技术

O’Donnell等利用多基因谱系一致性系统发育学物种识别法（GCPSR），基于LSU、ef1‐a、rpb1>和rpb2>这4个基因的核苷酸序列，把羊肚菌属真菌划分为黄色羊肚菌支系（Esculenta Clade）、黑色羊肚菌支系（Elata Clade）和变红羊肚菌支系（RufobrunneaClade）。梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和高羊肚菌均属于黑色羊肚菌支系。

子囊菌的有性生殖目前认为由单一交配位点MAT1控制，这个交配位点包括以MAT1-1-1基因为特征的MAT1-1交配型和以MAT1-2-1基因为特征的MAT1-2交配型。同宗交配的子囊菌自交可育，而异宗交配的子囊菌自交不育，必须由分别具有交配型MAT1-1和交配型MAT1-2的个体交配后才能完成有性生殖。

近几年，梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌的人工栽培获得成功并在全国兴起热潮，很多地方纷纷大面积商业化种植，但不出菇的情况经常发生，有时甚至出现整个大棚或田块1个羊肚菌都不出，究其原因除气候环境因素外，最主要的就是菌种问题，确保菌种的可靠是首要的技术关键。

我们通过前期的研究工作，分别获得了梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和高羊肚菌的MAT1-1-1和MAT1-2-1基因全长序列。通过单子囊孢子交配型比例分析并结合交配位点结构分析，证实这四种羊肚菌都是异宗交配型真菌，有性生殖过程（出菇）需要两种配型个体结合才能完成。羊肚菌的孢子分离和组织分离都有可能只得到一种交配型的菌株，而菌种的继代培养过程中也会出现一种交配型丢失的现象。因此，对菌株交配型的检测是获得有效栽培菌株的关键。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种鉴定黑色羊肚菌类群中四个种的交配型方法和通用特异引物对，通过特异引物对PCR扩增后条带的有无，鉴定梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和高羊肚菌菌株的交配型，从而确定是否为有效栽培菌株。引物对可以通用于四种羊肚菌菌株，方法简便而结果稳定可靠。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

鉴定黑色羊肚菌类群中四个种的交配型方法，包括用于检测交配型MAT1-1的特异引物对P7-2F/P7-2R或P8-5F/P8-5R，用于检测交配型MAT1-2的特异引物对P10-1F/P10-2R或P10-2F/P10-3R，相应的PCR扩增体系和扩增程序；

所述的P7-2F/P7-2R特异引物对：

P7-2F的核苷酸序列为5’-CCGGTTTATCTTACTGGACTGGTTC-3’ ；（SEQ ID No.1）

P7-2R 的核苷酸序列为5’-GCTTTCCTCTTCTCTCGTTGCCATA -3’ ；（SEQ ID No.2）

所述的P8-5F/P8-5R特异引物对：

P8-5F的核苷酸序列为5’-ATGTCACTCCGTCCGGTTTACCTTA -3’，（SEQ ID No.3）

P8-5R 的核苷酸序列为5’-TGGAATGTCTGTGATTGAGGCTGTG -3’ ；（SEQ ID No.4）

所述的P10-1F/P10-2R特异引物对：

P10-1F的核苷酸序列为5’-GGCCAGAACAGATGCTCGAAGAAGC -3’，（SEQ ID No.5）

P10-2R 的核苷酸序列为5’-CTCCCAAAGCATGATCAAATCCCTC -3’ ；（SEQ ID No.6）

所述的P10-2F/P10-3R特异引物对：

P10-2F的核苷酸序列为5’-AGACCGCTTTAGATAGATTGGCAGG -3’，（SEQ ID No.7）

P10-3R 的核苷酸序列为5’-GATCAAATCCCTCCATTAAGGCATC -3’。（SEQ ID No.8）

进一步，优选的是，鉴定交配型MAT1-1和MAT1-2的PCR扩增体系相同，均包括2×PCRmix12.5µL，10µM/L的正反向引物各1µL， DNA模板10ng， ddH₂O补足至25µL。

进一步，优选的是，特异引物对P7-2F/P7-2R鉴定菌株的MAT1-1交配型的PCR扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 sec，62℃退火30 sec，72℃延伸40 sec，30个循环；72℃延伸10 min；

特异引物对P8-5F/P8-5R鉴定菌株的MAT1-1交配型的PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30 sec，65℃退火30 sec，72℃延伸90 sec，30个循环；72℃延伸10 min。

特异引物对P7-2F/P7-2R检测菌株的MAT1-1交配型时，可以获得大小约为0.6kb的唯一条带；特异引物对P8-5F/P8-5R检测菌株MAT1-1交配型时，可以获得大小约为1.7kb的唯一条带。

进一步，优选的是，特异引物对P10-1F/P10-2R和P10-2F/P10-3R鉴定菌株的MAT1-2交配型的PCR扩增程序相同，均为：94℃预变性3 min；94℃变性30 sec，64℃退火30 sec，72℃延伸60 sec，30个循环；72℃延伸10 min。

特异引物对P10-1F/P10-2R，检测菌株MAT1-2交配型时，可以获得大小约为1.1kb的唯一条带；特异引物对P10-2F/P10-3R检测菌株MAT1-2交配型时，可以获得大小约为1.0kb的唯一条带。

本发明提供鉴定黑色羊肚菌类群中四个种的交配型的PCR引物对：包括用于检测交配型MAT1-1的特异引物对为P7-2F/P7-2R或P8-5F/P8-5R，以及用于检测交配型MAT1-2的特异引物对为P10-1F/P10-2R或P10-2F/P10-3R。

本发明还要求保护上述PCR 引物对的鉴定黑色羊肚菌类群中四个种的交配型的试剂及试剂盒。

本发明还提供上述PCR 引物对、试剂或试剂盒在鉴定黑色羊肚菌类群中四个种的交配型中或黑色羊肚菌育种的应用。

在本发明中，利用P7-2F/P7-2R引物对PCR扩增出0.6kb左右唯一条带，或者P8-5F/P8-5R引物对PCR扩增出1.7kb左右唯一条带，表明菌株含MAT1-1交配型；利用P10-1F/P10-2R引物对PCR扩增出1.1kb左右唯一条带，或者P10-2F/P10-3R引物对PCR扩增出1.0kb左右唯一条带，表明菌株含MAT1-2交配型；检测菌株若能检测到两条预期的条带，说明该菌株为含有两种交配型的菌株，可以作为有效栽培菌株，而只检测到其中一条预期的条带，说明该菌株为只具有一种交配型的菌株，不能用于栽培，可以作为杂交育种的备选菌株。

本发明基于前期研究工作获得的梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和高羊肚菌两个交配基因序列的特征，设计了四对特异引物，可以通用于这四种羊肚菌菌株MAT1-1和MAT1-2交配型的检测。扩增条带为单一条带，条带的有无即可确定菌株的交配型，结果稳定可靠。

本发明中所涉及的四种羊肚菌交配基因序列和检测方法目前国内外均未报道。本发明中的四对特异引物对，均可以通用于四种羊肚菌交配型的检测，对于羊肚菌的有性生殖和系统进化研究都有重要意义。

引物对P7-2F/P7-2R或P8-5F/P8-5R可以通用于上述四种羊肚菌的MAT1-1交配型检测。

引物对P10-1F/P10-2R或P10-2F/P10-3R可以通用于上述四种羊肚菌的MAT1-2交配型检测。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、高羊肚菌MAT1-1-1和MAT1-2-1基因序列目前国内外皆未见报道，本发明的四对特异引物对，可以通用于这四种羊肚菌交配基因保守区段的扩增，通过扩增条带的有无即可鉴定出菌株的交配型，方法简便而结果稳定可靠。在4小时内可以完成全套检测流程，每个样品的检测成本只需50元左右。此方法还可以进一步用于羊肚菌有性生殖和系统进化方面的研究。

附图说明

图1为梯棱羊肚菌YPL2单子囊孢子菌株交配型检测电泳图。A:P8-5F/P8-5R引物对扩增交配基因MAT1-1-1；B：P10-1F/P10-2R引物对扩增交配基因MAT1-2-1。M代表Marker-DL2000（图中从上到下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）；1~24代表梯棱羊肚菌单子囊孢子菌株YPL2-1~YPL2-24。

图2为六妹羊肚菌HL1单子囊孢子菌株交配型检测电泳图。M代表Marker-DL2000（图中从上到下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp）；1~12代表菌株HL1-1~HL1-12用引物对P7-2F/P7-2R扩增交配基因MAT1-1-1；13-24代表菌株HL1-1~HL1-12用引物对P10-2F/P10-3R扩增交配基因MAT1-2-1。

图3为高羊肚菌2688单子囊孢子菌株交配型检测电泳图。M代表Marker-DL2000（图中从上到下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp）；1~12代表菌株23-S1~23-S12用引物对P7-2F/P7-2R扩增交配基因MAT1-1-1；13~24代表菌株23-S1~23-S12用引物对P10-2F/P10-3R扩增交配基因MAT1-2-1。

图4为羊肚菌有效栽培菌株检测电泳图。M代表Marker-DL2000（图中从上到下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp）；1、2、、3、4分别代表菌株YPL2、YPL6、HL1、HL2用引物对P7-2F/P7-2R扩增交配基因MAT1-1-1；5、6、7、8分别代表菌株YPL2、YPL6、HL1、HL2用引物对P10-2F/P10-3R扩增交配基因MAT1-2-1；CK代表没加模板的负对照。

图5为七妹羊肚菌3712单子囊孢子菌株交配型检测电泳图。M代表Marker-DL2000（图中从上到下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）；1~12代表菌株3712-10~3712-21用引物对P8-5F/P8-5R扩增交配基因MAT1-1-1；13~24代表菌株3712-10~3712-21用引物对P10-1F/P10-2R扩增交配基因MAT1-2-1。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1梯棱羊肚菌YPL2单子囊孢子菌株交配型鉴定

梯棱羊肚菌单子囊孢子菌株YPL2-1—YPL2-24接种在PDA培养基上，23℃培养10d，挑取适量菌丝体，CTAB法提取DNA，取3 µL在1%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度。

分别以YPL2-1—YPL2-24的DNA为模板，用引物对P8-5F/P8-5R进行PCR扩增：25µL扩增体系包括2×PCRmix（TSINGKE Bio Inc）12.5 µL，10 µM/L 的P8-5F、P8-5R引物各1 µL，DNA模板1µL，ddH₂O>

分别以YPL2-1—YPL2-24的DNA为模板，用引物对P10-1F/P10-2R进行PCR扩增，25µL扩增体系包括2×PCRmix（TSINGKE Bio Inc）12.5 µL，10 µM/L 的P10-1F、P10-2R引物各1 µL， DNA模板1 µL，ddH₂O>

所有扩增产物在1.2%(W/V)琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图1的A和B，菌株YP2-2、YPL2-8、YPL2-10、YPL2-12、YPL2-13、YP2-14、YPL2-16、YPL2-17、YPL2-18、YPL2-21、YPL2-22、YPL2-23、YPL2-24在引物对P8-5F/P8-5R扩增时有1.7kb左右唯一条带，而用引物对P10-1F/P10-2R扩增时无条带，鉴定为交配型MAT1-1菌株。而菌株YP2-1、YPL2-3、YPL2-4、YPL2-5、YPL2-6、YP2-7、YPL2-9、YPL2-11、YPL2-15、YPL2-19、YPL2-20在引物对P8-5F/P8-5R扩增时无条带，而引物对P10-1F/P10-2R扩增时有1.1kb左右唯一条带，鉴定为交配型MAT1-2菌株。

实施例2 六妹羊肚菌HL1单子囊孢子菌株交配型鉴定

六妹羊肚菌单子囊孢子菌株HL1-1—HL1-12接种在PDA培养基上，23℃培养10d，挑取适量菌丝体，CTAB法提取DNA，取3 µL在1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度。

分别以HL1-1—HL1-12的DNA为模板，用引物对P7-2F/P7-2R进行PCR扩增，25µL扩增体系包括2×PCRmix（TSINGKE Bio Inc）12.5 µL，10 µM/L 的P7-2F、P7-2R引物各1 µL，DNA模板1µL，ddH₂O>

分别以HL1-1—HL1-12的DNA为模板，用引物对P10-2F/P10-3R进行PCR扩增，25 µL扩增体系包括2×PCRmix（TSINGKE Bio Inc）12.5 µL，10 µM/L 的P10-2F、P10-3R引物各1µL， DNA模板1 µL，ddH₂O>

所有扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图2，菌株HL1-1、HL1-5、HL1-6、HL1-7、HL1-9、HL1-10只有引物对P7-2F/P7-2R扩增出0.6kb左右条带，为MAT1-1交配型；菌株 HL1-3、HL1-8、HL1-11、HL1-12只有引物对P10-2F/P10-3R扩增出1.0kb左右条带，为MAT1-2 交配型；而菌株HL1-2、HL1-4两个引物对都扩增出条带，包含两种交配型。

实施例3 高羊肚菌2688单子囊孢子菌株交配型鉴定

高羊肚菌单子囊孢子菌株23-S1—23-S12接种在PDA培养基上，23℃培养10d，挑取适量菌丝体，CTAB法提取DNA，取3 µL在1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度。

用引物对P7-2F/P7-2R和P10-2F/P10-3R进行交配型检测，操作步骤同实施例2。

所有扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图3，菌株 23-S3、23-S7、23-S9、23-S10、23-S11只有引物对P7-2F/P7-2R扩增出0.6kb左右条带，为MAT1-1交配型；菌株23-S1、23-S2、23-S4、23-S15、23-S6、23-S8、23-S12只有引物对P10-2F/P10-3R扩增出1.0kb左右条带，为MAT1-2交配型。

实施例4 梯棱菌株和六妹羊肚菌有效栽培菌株鉴定

梯棱羊肚菌菌株YPL2、YPL6和六妹羊肚菌菌株HL1、HL2接种在PDA培养基上，23℃培养10d，挑取适量菌丝体，CTAB法提取DNA，取3 µL在1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度。

用引物对P7-2F/P7-2R和P10-2F/P10-3R进行交配型检测，操作步骤同实施例2。

所有扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图4，菌株YPL6、YPL2、HL1、HL2用两个引物对都扩增出预期条带，表明包含两种交配型，可作为有效栽培菌株。通过鉴定的有效栽培菌株菌株YPL6、和HL1栽种后，均已出菇，而只含一种交配型的4个菌株均未出菇。

实施例5 七妹羊肚菌3712单子囊孢子菌株交配型鉴定

七妹羊肚菌3712单子囊孢子菌株3712-10—3712-21接种在PDA培养基上，23℃培养10d，挑取适量菌丝体，CTAB法提取DNA，取3 µL在1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度。

用引物对P8-5F/P8-5R和P10-1F/P10-2R进行交配型检测，操作步骤同实施例1。

所有扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图5，菌株 3712-1、3712-5、3712-8、3712-9只有引物对P8-5F/P8-5R扩增出1.7kb左右条带，为MAT1-1交配型；菌株3712-2、3712-3、3712-4、3712-6、3712-7、3712-10、3712-11、3712-12只有引物对P10-1F/P10-2R扩增出1.1kb左右条带，为MAT1-2交配型。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

SEQ ID No.1

CCGGTTTATC TTACTGGACT GGTTC 25

SEQ ID No.2

GCTTTCCTCT TCTCTCGTTG CCATA 25

SEQ ID No.3

ATGTCACTCC GTCCGGTTTA CCTTA 25

SEQ ID No.4

TGGAATGTCT GTGATTGAGG CTGTG 25

SEQ ID No.5

GGCCAGAACA GATGCTCGAA GAAGC 25

SEQ ID No.6

CTCCCAAAGC ATGATCAAAT CCCTC 25

SEQ ID No.7

AGACCGCTTT AGATAGATTG GCAGG 25

SEQ ID No.8

GATCAAATCC CTCCATTAAG GCATC 25

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所

<120> 鉴定黑色羊肚菌类群中四个种的交配型方法和引物对

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

CCGGTTTATC TTACTGGACT GGTTC 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

GCTTTCCTCT TCTCTCGTTG CCATA 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ATGTCACTCC GTCCGGTTTA CCTTA 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

TGGAATGTCT GTGATTGAGG CTGTG 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

GGCCAGAACA GATGCTCGAA GAAGC 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

CTCCCAAAGC ATGATCAAAT CCCTC 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

AGACCGCTTT AGATAGATTG GCAGG 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

GATCAAATCC CTCCATTAAG GCATC 25

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