一种鉴别水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记

摘要

本发明公开了一种鉴别水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记。与phyB野生型及突变位点检测相关的标记，其核苷酸序列分别如Seq No.1‑2所示。利用引物PHYBF4/PHYBR1进行PCR扩增，扩增产物进行BamHⅠ酶切并进行电泳分析：如果PCR产物不能被BamHⅠ酶切，为175bp DNA片段，则为野生型phyB；如果能够被BamHⅠ酶切，酶切产物为25bp和151bp两条DNA片段的，则为突变体phyB1。本发明的分子标记具有扩增简单、快速，成本低的优势。该分子标记可以对phyB等位基因型进行有效、快速、可靠的鉴定，为后续将phyB突变体应用于育种群体筛选提供有力的工具。

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴别水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记，属于植物生物技术领域。

背景技术

高等植物利用光敏色素(phytochromes)、隐花色素(cryptochromes)和向光素(phototropins)等光受体，感受其生长环境中光质、光强、光周期等条件的变化，调节自身的生长发育，以最大限度适应周围环境。其中，光敏色素主要感受红光(red light,R)和远红光(far-red light,FR)。水稻中光敏色素基因家族包括3个成员：PHYA、PHYB和PHYC。其中PHYB基因位于水稻的第3染色体短臂，为单拷贝。Takano等(2005)通过伽马射线诱导突变筛选得到了多个phyB突变体，分别命名为phyB1～phyB5。其中phyB1突变体在PHYB基因内部1644bp处插入一个碱基C，从而引起翻译提前终止(Takano等，2005，Plant Cell,2005,17:3311-3325)。通过分析水稻光敏色素突变体的光形态建成特征，发现phyB在水稻生长发育和胁迫反应中具有重要作用。phyB突变体无论是长日照条件还是短日照条件下，开花期均明显提前(Takano等，2005，Plant Cell,2005,17:3311-3325)；其干旱胁迫耐性也明显增强(Liu等，2012，Plant Mol Biol.,78(3):289-300)；而且对于稻瘟病具有一定的抗性(Xie等，2011，Mol.Plant 4(4):688-696)。而phyB突变体的株高，穗粒数，结实率等农艺性状与野生型水稻日本晴相比没有明显差异(Takano等，2005，Plant Cell,2005,17:3311-3325)。因此phyB突变体可以作为一种重要的种质资源用于早熟、抗病、耐旱水稻品种培育。

为了将phyB突变体更好的应用于育种中，开发一种简单方便的区分phyB突变体与其他常规水稻品种的分子标记，以实现phyB等位基因型的有效、可靠、快速鉴定，在后续利用phyB突变位点进行育种群体筛选中具有重要价值。虽然Takano等(2005)《Distinct andCooperative Functions of Phytochromes A,B,and C in the Control ofDeetiolation and Flowering in Rice》(The Plant Cell,Vol.17,3311–3325)的文章中开发了一种鉴定phyB1突变体的分子标记，但是该标记扩增片段较大(1Kb)，GC含量较高，要用高GC的PCR buffer进行扩增，而且PCR扩增时间较长，且用于酶切的限制性内切酶NlaIV属于罕见的限制性内切酶，购买困难，且价格昂贵(3.49元/U，NEB北京)，提高了鉴定成本，不适用于大规模的鉴定；经常出现没有库存、断货等现象，严重影响鉴定工作顺利进行。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的不足，提供一种简单、有效、成本较低的鉴别水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记及引物。本发明的另一目的在于提供上述分子标记的应用。

本发明的技术方案是：一种鉴别水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记，其特征是，

与phyB野生型位点检测相关的核苷酸序列如下所示(Seq No.1)：

TGTCACACAAAGCCCCAGCATCATGGACCTTGTGAAGTGTGATGGTGCTGCTCTGTATTACCATGGGAAGTACTACCCTCTTGGTGTCACTCCCACAGAAGTTCAGATTAAGGACATCATCGAGTGGTTGACTATGTGCCATGGAGACTCCACAGGGCTCAGCACAGATAGCCTT。

与phyB突变体位点检测相关的核苷酸序列如下所示(Seq No.2)：

TGTCACACAAAGCCCCAGCATCATGGACCCTTGTGAAGTGTGATGGTGCTGCTCTGTATTACCATGGGAAGTACTACCCTCTTGGTGTCACTCCCACAGAAGTTCAGATTAAGGACATCATCGAGTGGTTGACTATGTGCCATGGAGACTCCACAGGGCTCAGCACAGATAGCCTT。

所述的光敏色素突变体phyB突变体为phyB1突变体。

本发明还公开了一种用于鉴定上述水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记的引物，具体为：

上游引物PHYBF4：5’-TGTCACACAAAGCCCCAGCATCATGGATC-3’(Seq No.3)；

下游引物PHYBR1：5’-AAGGCTATCTGTGCTGAGCC-3’(Seq No.4)。

所述的用于鉴定水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记在水稻种质资源鉴定或育种辅助选育中的应用。

应用上述引物鉴定水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)利用上游引物PHYBF4和下游引物PHYBR1对水稻基因组DNA进行PCR扩增；

(2)对步骤(1)得到的PCR扩增产物进行电泳分析：

如果PCR扩增产物大小为175bp DNA片段，则为野生型phyB；

如果PCR扩增产物大小为176bp DNA片段，则为突变体phyB1；

(3)对步骤(1)得到的PCR产物进行BamHⅠ酶切并进行电泳分析：

如果PCR产物不能被BamHⅠ酶切，依然为175bp DNA片段，则为野生型phyB；

如果PCR产物能够被BamHⅠ酶切，酶切产物为25bp和151bp两条DNA片段的，则为突变体phyB1。

步骤(1)中所述的PCR扩增体系可以利用普通PCR buffer进行扩增，也可以用PCRmix进行扩增，优选体系为20μL体系，用PCR mix进行扩增。本实验所用PCR mix为全式金公司2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)，PCR反应体系包括如下组分：

步骤(1)所述的PCR扩增反应程序优选为：94℃预变性3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃后延伸5min。

上述水稻品系可以为日本晴(公开报道的一个品种)、新稻18(国审稻2008028)和临稻11(鲁农审字[2004]014号)等水稻品系。

本发明相对于现有的技术具有如下的优点及效果：

(1)开发了一种用于区分水稻光敏色素基因phyB突变体与其他常规水稻品种的分子标记引物PHYBF4/PHYBR1，从而对phyB等位基因型进行有效、快速、可靠的鉴定，为后续将phyB突变体应用于育种群体筛选提供有力工具。

(2)本发明的功能标记引物PHYBF4/PHYBR1利用普通PCR技术，能够特异性的检测phyB突变体。与已有标记相比，本标记扩增更加简单、快速；PCR扩增程序时间(1h)远远低于原有标记的时间(2h)(Takano等，2005，Plant Cell,2005,17:3311-3325)；PCR产物酶切所用的限制性内切酶BamHⅠ为分子生物学常用酶，各公司都常规备货不会出现因为断货导致实验中断现象；同时BamHⅠ的价格(0.0478元/U,NEB北京)远远低于NlaIV(3.49元/U,NEB北京)，大大降低成本。该标记可以对不同的水稻材料phyB1突变体等位基因进行基因分型，并可作为一种分子标记应用于育种杂交、回交分离群体鉴定，提高分子标记辅助选择育种效率。

附图说明

图1水稻光敏色素PHYB野生型序列与phyB1突变体序列差异位点比对结果；

图2为利用本标记引物PHYBF4/PHYBR1，利用2×GC buffer(TAKARA)、2×PCR Mix(TRANSGEN)和10×PCR buffer(TAKARA)进行PCR扩增的结果；其中M:500bp DNA ladder；1：日本晴；2：phyB1突变体；3：新稻18；4：新稻18/phyB1突变体F₁；5：临稻11；6：临稻11/phyB1突变体F₁；

图3为利用本标记引物PHYBF4/PHYBR1，用2×GC buffer(TAKARA)、2×PCR Mix(TRANSGEN)和10×PCR buffer(TAKARA)进行PCR扩增，扩增产物用BamHⅠ进行酶切的结果；中M:500bp DNA ladder；1：日本晴；2：phyB1突变体；3：新稻18；4：新稻18/phyB1突变体F₁；5：临稻11；6：临稻11/phyB1突变体F₁；

图4为利用原有标记引物PHYBF1/PHYBR2，利用2×GC buffer(TAKARA)、2×PCRMix(TRANSGEN)和10×PCR buffer(TAKARA)进行PCR扩增的结果；其中M:2Kb DNA ladder；1：日本晴；2：phyB1突变体；3：新稻18；4：新稻18/phyB1突变体F₁；5：临稻11；6：临稻11/phyB1突变体F₁；

图5为利用原有标记PHYBF1/PHYBR2，用2×GC buffer(TAKARA)和2×PCR Mix(TRANSGEN)进行PCR扩增，扩增产物用NlaIV进行酶切的结果；其中M:2Kb DNA ladder；1：日本晴；2：phyB1突变体；3：新稻18；4：新稻18/phyB1突变体F₁；5：临稻11；6：临稻11/phyB1突变体F₁。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：一种鉴别水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记的建立

(1)引物设计

已知phyB1突变体在PHYB基因内部1644bp处插入一个碱基C，从而引起翻译提前终止(Takano等，2005，Plant Cell,2005,17:3311-3325)。在突变位点前后选取175bp序列进行比对(图1)，根据序列差异，实用dCAPS Finder 2.0在线设计软件(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)设计引物，引物序列如下：

上游引物PHYBF4：5’-TGTCACACAAAGCCCCAGCATCATGGATC-3’(Seq No.3)；

下游引物PHYBR1：5’-AAGGCTATCTGTGCTGAGCC-3’(Seq No.4)。

(2)扩增片段理论分析

水稻野生型基因组DNA能扩增出一条175bp的片段(序列1)；phyB突变体基因组DNA年能扩增出1条176bp的片段(序列2)；野生型基因组DNA扩增片段不能被BamHⅠ酶切，phyB突变体基因组扩增片段能够被BamHⅠ酶切成25bp和151bp两条DNA片段。

Seq No.1：

TGTCACACAAAGCCCCAGCATCATGGACCTTGTGAAGTGTGATGGTGCTGCTCTGTATTACCATGGGAAGTACTACCCTCTTGGTGTCACTCCCACAGAAGTTCAGATTAAGGACATCATCGAGTGGTTGACTATGTGCCATGGAGACTCCACAGGGCTCAGCACAGATAGCCTT。

Seq No.2：

TGTCACACAAAGCCCCAGCATCATGGACCCTTGTGAAGTGTGATGGTGCTGCTCTGTATTACCATGGGAAGTACTACCCTCTTGGTGTCACTCCCACAGAAGTTCAGATTAAGGACATCATCGAGTGGTTGACTATGTGCCATGGAGACTCCACAGGGCTCAGCACAGATAGCCTT。

实施例2：利用水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记分析6个水稻材料PHYB基因型

(1)水稻叶片基因组DNA的提取

试验材料包括水稻野生型日本晴(编号1)、phyB1突变体(编号2)、新稻18(编号3)、新稻18/phyB1杂交F₁(编号4)、临稻11(编号5)、临稻11/phyB1杂交F₁(编号6)。

选取水稻单株的幼嫩叶片，采用SDS法提取水稻的基因组DNA，具体步骤如下：

①取适量叶片置于2mL离心管中，加入DNA提取液300μL，加入钢珠一枚，用组织破碎研磨仪震荡30s左右；

②将离心管置于65℃水浴30min，期间上下颠倒混匀2-3次；

③静置至室温，加入等体积的氯仿，上下剧烈摇动，充分混匀；

④12000rpm离心10min，吸上清约200μL到新的灭菌的1.5mL离心管中；

⑤加入等体积的预冷的异丙醇上下颠倒混匀，-20℃放置30min左右，使DNA充分沉淀；

⑥12000rpm离心10min，倒掉上清，加入500μL 75％乙醇漂洗一次；

⑦12000rpm瞬间离心，倒掉上清后将离心管倒置在纸巾上，静置2min；

⑧通风厨内干燥DNA后加入适量1×TE buffer溶解DNA；

⑨置于-20℃保存，备用。

(2)利用鉴别水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记分析6个水稻材料PHYB基因型

利用鉴定引物PHYBF4(Seq No.3)/PHYBR1(Seq No.4)进行PCR扩增，反应体系分别为2×GC buffer(TAKARA)、2×PCR Mix(TRANSGEN)和10×PCR buffer(TAKARA)，其中20μL2×PCR Mix(TRANSGEN)体系为：DNA模板2μL，10μM引物(PHYBF4和PHYBR1)各0.3μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 10μL，用ddH₂0补足20μL；PCR反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，共35个循环，然后72℃后延伸5min。

(3)扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测、酶切和基因型判定

PCR扩增产物经过2％的琼脂糖凝胶电泳(1×TAE,120V,时间20min)，利用君意凝胶成像系统观察，结果发现本引物能够在野生型和突变体中扩增出单一的，清晰的、非常明亮的条带。片段大小与预期一致(图2)。其中2×PCR Mix(TRANSGEN)体系的扩增效果最好，条带最清晰。

PCR扩增产物用BamHⅠ(TAKARA)进行酶切，酶切体系为：10×buffer 2μL，PCR产物取10μL，BamHⅠ1U，用ddH₂O补齐至20μL，30℃酶切1h。然后用3％的琼脂糖凝胶进行电泳检测(1×TAE,120V,时间25min)，利用君意凝胶成像系统观察，结果发现野生型仍然为一条单一，清晰的条带，而phyB突变体条带明显小于野生型，这是因为酶切掉25bp，但是由于25bp条带太小在凝胶上无法显示；杂交F1单株有两条明显的带，大小分别与野生型和突变体大小一致(图3)。其中2×PCR>

上述的基因型跑胶结果与对应的材料带型一致，与预期结果一致。证明开发的标记能够有效的区分野生型和突变体。

(4)与原有鉴定标记的比较分析

根据Takano等，2005，Plant Cell,2005,17:3311-3325文章中的引物PHYBF1/PHYBR2序列合成上述引物，引物序列如下：

上游引物PHYBF1：5’-GGGTTCCATTGCATCTCTTG-3’(Seq No.5)；

下游引物PHYBR2：5’-TTGCCCATTgCTTCCTCAAC-3’(Seq No.6)。

利用上述引物PHYBF1(Seq No.5)/PHYBR2(Seq No.6)，对野生型和突变体进行PCR扩增，反应体系为20μL体系：DNA模板2μL，10μM引物(PHYBF1和PHYBR2)各0.3μL,2×EasyTaqPCR SuperMix 10μL，用ddH₂O补足20μL；PCR反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性1min，60℃复性1min，72℃延伸1min，共35个循环，然后72℃后延伸5min。结果见图4，由图4可以看出，引物PHYBF1/PHYBR2扩增条件要求较高，只有高GC的GC>

原有的鉴定标记PHYBF1/PHYBR2扩增野生型和phyB突变体的PCR产物均能被NlaIV(NEB)酶切(图5)；酶切体系为：10×buffer 2μL，PCR产物取10μL，NlaIV 1U，用ddH₂O补齐至20μL，37℃酶切1h。然后用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测(1×TAE,120V,时间25min)，利用君意凝胶成像系统观察。其中野生型为两个片段大小分别为564bp和437bp，phyB突变体能够被NlaIV(NEB)酶切为三条片段，大小分别为437bp，323bp和242bp；而杂合体带型则有四条片段，大小分别是564bp，437bp，323bp和242bp(图5)。新标记与其相比，新标记所用酶BamH>

综上所述，新标记的开发不仅能够有效的区分野生型和突变体，而且与原有标记相比更加的节省时间和成本。是一个有效、快速、低廉的鉴定光敏色素PHYB突变体的分子标记。

上述实施例是本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、简化等均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。