ERC1在制备诊断或治疗下咽癌工具中的应用

摘要

本发明公开了一种基因标记物，该基因标记物是ERC1。ERC1可用于判断受试者是否具有患下咽癌的风险或者判断受试者是否患有下咽癌。另外，ERC1还可以用于制备治疗下咽癌的药物。本发明为临床在分子水平上诊断下咽癌提供了新的诊断方法，同时为下咽癌的基因治疗提供了新的药物靶点。

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤诊断、治疗、预测预后领域，更具体地，本发明涉及以检测ERC1异常为手段的肿瘤诊断、预测预后方法；及激活ERC1基因或蛋白质的肿瘤治疗剂。

背景技术

下咽癌是严重危害人们生命和健康的常见头颈部恶性肿瘤，病理类型多为鳞状细胞癌。近年来，由于环境等多种不同致癌因素的共同作用，下咽癌的发病率呈逐渐上升的趋势。尽管以外科手术为主的综合治疗措施取得较大进展，但是下咽癌患者综合治疗后的年生存率仍无明显的提高。尽管如此，临床大量数据表明，治疗的早晚对患者预后产生重要的影响。据统计，早期下咽癌治疗效果相对较好，晚期下咽癌由局部浸润和处淋巴结转移，治疗效果较差，年生存率下降。由此，提高下咽癌疗效的关键在于的早期诊断、早期治疗。然而下咽癌早期诊断困难，目前尚没有可靠的用于早期诊断的特异性指标，因此，临床上亟待寻找下咽癌相关的特异性肿瘤标志物以辅助早期诊断。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种通过检测ERC1基因或蛋白表达差异来诊断下咽癌的方法。

本发明的目的之二在于提供一种通过检测ERC1基因或蛋白表达差异来预测下咽癌预后的方法。

本发明的目的之三在于提供一种通过激活ERC1基因或ERC1蛋白来治疗下咽癌的方法。

本发明的目的之四在于提供一种用于筛选治疗下咽癌的药物的方法。

本发明的目的之五在于提供一种用于治疗下咽癌的药物。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测ERC1基因或ERC1蛋白的产品在制备下咽癌诊断工具中的用途。

本发明还提供了检测ERC1基因或ERC1蛋白的产品在制备预测下咽癌预后工具中的用途。

进一步，所述检测ERC1基因或ERC1蛋白的产品包括检测ERC1基因或ERC1蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合ERC1基因的核酸或者能够结合ERC1蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测ERC1基因的表达水平；所述物质能够检测ERC1蛋白的表达水平。

本发明的检测ERC1基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。

包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。

进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。

上面所述的核酸包括扩增ERC1基因的引物，产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。

在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1(正向序列)和SEQ ID NO.2(反向序列)所示。

上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。

本发明的检测ERC1蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。

本发明的检测ERC1蛋白的产品包括特异性结合ERC1蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)₂、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的检测ERC1蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。

抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的ERC1蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对ERC1蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。

标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。

作为依照本发明的检测产品的样品，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。

在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。

在本发明中，“预后”是指肿瘤患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过程或结果。在本说明书中，预后可以是通过手术处理抑制或缓解肿瘤生长后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可以通过检查生物标志物即ERC1蛋白或编码ERC1蛋白的基因来预测。预后预测可以这样进行：根据生物标志物的有或无，或者升高或降低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。

在本发明中，“预后良好”是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解肿瘤生长之后，患者长时期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长)没有危急状况。或者，预后好可以意指在这样长时间内存活、无转移、无复发、或无再发。例如，预后良好可以意指至少3年或尤其是至少5年存活，优选没有转移或复发。预后良好最优选的状态是长期无疾病的存活。如本文中所使用的，“预后良好”还可以包括任何这样的状态，其中可以发现疾病如转移，但是恶性低且不严重地影响生存能力。

在本发明中，“预后不良”是指患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的短时期(例如1、2、3、4、5年或更短)内发生致命状况。或者，预后差是指在这样的短时期里死亡、转移、复发、或再发。例如，预后差可以意指至少3年或尤其至少5年内复发、转移、或死亡。

预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本发明而言，本发明中ERC1基因或ERC1蛋白的水平降低的患者中，与不显示该特征的患者相比，更有可能观察到特定过程或结果。

进一步，所述检测ERC1基因或ERC1蛋白的产品可以是检测ERC1基因或ERC1蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。

本发明还提供了一种诊断下咽癌的工具，所述工具能够检测ERC1基因或ERC1蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合ERC1基因的核酸或者能够结合ERC1蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测ERC1基因的表达水平；所述物质能够检测ERC1蛋白的表达水平。

进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。

进一步，所述诊断下咽癌的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断下咽癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知ERC1基因的异常与下咽癌相关也属于ERC1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种预测下咽癌预后的工具，所述预测下咽癌预后工具包括能够结合ERC1基因的核酸或者能够结合ERC1蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测ERC1基因的mRNA水平；所述物质能够检测ERC1蛋白的表达水平。

进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。

进一步，所述预测下咽癌预后的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断下咽癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知ERC1基因的异常与下咽癌相关也属于ERC1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗ERC1抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合ERC1即可。

本发明还提供了一种诊断下咽癌或预测下咽癌预后的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取受试者的样品；

(2)检测受试者样品中ERC1基因或蛋白的表达水平；

(3)将测得的ERC1基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。

(4)与对照相比，ERC1基因或蛋白的表达水平降低，则该受试者被诊断为下咽癌，或该受试者被确定为预后不良。

本发明还提供了一种下咽癌的治疗方法，所述方法包括激活ERC1基因或ERC1蛋白。

进一步，所述方法包括促进ERC1基因的表达，或促进ERC1蛋白的表达或增强ERC1蛋白的活性。

本发明还提供了一种肿瘤药物的筛选方法，可以通过在对癌细胞添加测试药物后或在对肿瘤模型动物施用测试药物后的某个时期测量ERC1基因或者ERC1蛋白的表达水平来测定肿瘤药物改善肿瘤预后的效果。更具体地说，当ERC1基因或者ERC1蛋白的表达水平在添加或施用测试药物后升高时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善肿瘤预后的治疗药物。

本发明还提供了一种含有ERC1基因或ERC1蛋白的激活剂的药物。

本发明还提供了上述激活剂在制备治疗下咽癌的药物中的应用。

本发明的ERC1基因或ERC1蛋白的激活剂不受限制，只要是可以促进或者增强ERC1或涉及ERC1上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于治疗肿瘤有效的药物即可。

进一步，所述激活剂包括ERC1基因、ERC1蛋白、促进型miRNA、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物。

所述激活剂还包括包含携带ERC1基因的载体或者宿主细胞。

本发明的激活剂一方面可以用于补充内源性的ERC1蛋白的缺失或不足，通过提高ERC1蛋白的表达，从而治疗因ERC1蛋白缺乏导致的下咽癌。另一方面可以用于增强ERC1蛋白的活性，从而治疗下咽癌。

本发明的药物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物的效果即可，优选的是，用于治疗或预防肿瘤的药物可以包括例如烷化剂，诸如异环磷酰胺、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法仑、和雷莫司汀；抗代谢物，诸如依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐(cytarabine ocfosfate)、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟吉美嘧啶奥替拉西钾、去氧氟尿苷、羟基脲、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯嘌呤、和甲氨蝶呤；植物生物碱，诸如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他赛、nogitecan、帕利他赛、长春瑞滨、长春地辛、和长春碱；抗癌抗生素，诸如放线菌素D、阿柔比星、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他丁stimalamer、柔红霉素、多柔比星、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素C、和米托蒽醌；基于铂的药物，诸如奥沙利铂、卡铂、顺铂、和奈达铂；激素药物，诸如阿那曲唑、依西美坦、雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡鲁胺、氟他胺、泼尼松龙、磷雌酚、米托坦、甲睾酮、甲羟孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和来曲唑；生物反应修饰剂，诸如干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素、乌苯美司、干BCG、和香菇多糖；和分子靶向药物，诸如伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆单抗、奥佐米星、他米巴罗汀、曲妥单抗、维A酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔单抗等。

本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

在本发明的上下文中，“诊断下咽癌”既包括判断受试者是否已经患有下咽癌、也包括判断受试者是否存在患有下咽癌的风险。

本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：

(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；

(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者

(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。

术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。

本发明的优点和有益效果：

本发明的发现了一种诊断下咽癌的分子标志物，使用该分子标志物可以在下咽癌发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。

另外，通过预测患者的预后，本发明能够提供有意义的信息来为患者决定治疗方案策略。

本发明的包括ERC1基因或蛋白的激活剂的治疗药物可用作新的下咽癌的治疗药物。

附图说明

图1显示利用QPCR在mRNA水平上研究ERC1基因的差异表达；

图2显示利用免疫印迹在蛋白水平上检测ERC1基因的差异表达；

图3显示利用QPCR在mRNA水平上检测ERC1基因过表达的情况；

图4显示利用免疫印迹在蛋白水平上检测ERC1基因过表达的情况；

图5显示ERC1基因过表达对下咽癌细胞增殖的影响。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 基因芯片筛选差异表达基因

1、取材：

8例行同期颈部淋巴结清扫的原发下咽癌患者手术切除癌组织，另取9例非下咽癌疾病患者的下咽正常粘膜组织作为对照。所有癌组织均术后病理证实为下咽癌。全部原发下咽癌患者术前均未行放、化疗，全部病例临床资料完整。

2、组织RNA的获取

使用Trizol一步法提取组织总RNA。

3、RNA纯度及浓度的测定

取RNA溶液 1μl，仪器测定OD260、OD280，RNA浓度为OD260值×稀释倍数×40/1000，计算OD260/OD280，比值在1.7-2.0代表RNA溶液纯度高，含蛋白质等杂质少，-20℃保存。

4、RNA完整性检测

(1)取 2μl RNA样品行1.5％琼脂糖凝胶电泳(80v，15min)；

(2)分出区带后，genefinder染色，蓝光下观察电泳区带；

(3)当 28s/18s约 2:1时，说明RNA稳定无降解。

5、高通量转录组测序

5.1 RNA-seq读段定位

首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用的TopHat方法的系统默认参数。

5.2转录丰度评估

匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。

5.3差异表达基因的检测

将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。

6、结果

RNA-Sep结果显示，下咽癌组织与正常对照组织之间共筛选出211个差异表达基因，其中表达水平上调的基因54个，表达水平下调的基因157个。

实施例2 大样本验证筛选出的差异表达基因

基于前期高通量转录组深度测序的结果，根据P value的大小，我们选择ERC1基因进行验证。

1、样本收集

按照实施例1的方法收集下咽癌组织45例，正常对照组织50例。

2、在mRNA水平上进行验证

2.1提取组织RNA

步骤同实施例1。

2.2逆转录

反转录使用Primescript 1^st>

(1)在微量离心管中加入以下反应液体，如表1所示：

表1反应液体

试剂剂量RNA2.0μgdNTP1.0μlOligo(dT)2.0μlRnase free dH₂O加至10.0μl

(2)70℃孵育5min，迅速冷却至4℃；

在微量离心管内加入以下反应试剂，制成反应体系：

表2反应体系的配制

轻轻震荡，快速离心后，42℃反应1h，70℃10min终止反应，4℃冷却，-20℃保存。

采用SYBP Premix Ex Tap^TM>

(1)在冰上配制以下PCR反应液：

表3 PCR反应液的配制

试剂剂量SYBR10.0μl正向引物1.0μl反向引物1.0μlcDNA2.0μlddH₂O6.0μl总量20.0μl

引物序列设计如下：

ERC1基因：

5’-CTTCTTCTCTGGCATCCT-3’(SEQ ID NO.1)；

5’-ACACTCCTCCTTCTTCTG-3’(SEQ ID NO.2)

β-actin：

5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’(SEQ ID NO.3)；

5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’(SEQ ID NO.4)

(2)上机，执行下述程序：95℃预变性3min；95℃变性15s。59℃退火20s，72℃延伸20s，共40个循环。

结果釆用相对定量法，运用公式2^-△△ct计算。实验重复3次。

△ct＝ct(A)-ct(β-actin)

△△ct＝△ct(实验组)-△ct(对照组)

结果如图1所示，与正常对照组织相比，下咽癌组织中ERC1基因的mRNA水平明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3、在蛋白水平上进行验证

按照RIPA蛋白裂解液试剂盒说明书提取各组蛋白，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测样品中蛋白浓度。以常规Western-blot方法检测ERC1蛋白变化，各组实验均重复3次，以β-actin为内参，做ERC1蛋白条带吸光度定量分析，表达量以ERC1蛋白/β-actin吸光度的比值代表。

结果如图2所示，与正常对照组织相比，下咽癌组织中ERC1蛋白水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例3 ERC1基因过表达

1、质粒构建

根据ERC1基因的编码序列设计扩增引物，引物的设计为本领域技术人员所熟知。从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号：638831)中扩增全长的ERC1基因的编码序列，上述cDNA序列插入到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-ERC1用于后续实验。

2、下咽癌细胞的培养与转染

2.1细胞培养

下咽癌FADU细胞采用含有10％胎牛血清(FBS)、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml的RPMI 1640培养基置于37℃，5％CO₂，饱和湿度环境下培养。

2.2细胞转染

(1)转染前一天将0.5-2*10⁵个肿瘤细胞悬浮于500μl不含抗生素的培养基，接种至24孔培养板。

(2)转染当天细胞密度应达80％-90％，准备以下复合物A：将1μg质粒DNA稀释于无血清培养基中，轻轻混匀；复合物B：取4μl Lipofectamine2000稀释于无血清培养基中，混匀。

(3)将复合物A和B混合，轻轻混匀，室温孵育。

(4)将100μl脂质体复合体加入肿瘤细胞中，上下左右轻轻混匀，将细胞放入37℃含5％CO₂培养箱孵育5-7小时。

(5)加1ml含有2倍正常血清和抗生素浓度的生长培养基，继续培养细胞18-24小时。

3、利用QPCR实验检测pcDNA3.1-ERC1的过表达情况

3.1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。

3.2逆转录

步骤同实施例2。

3.3 QPCR

步骤同实施例2。

3.4结果

结果如图3所示，pcDNA3.1-ERC1能够成功过表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3、Western blot实验检测pcDNA3.1-ERC1过表达情况

步骤同实施例2。

结果如图4所示，与转染pcDNA3.1组相比，转染pcDNA3.1-ERC1的细胞中ERC1蛋白的含量明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例4 ERC1基因的表达对下咽癌细胞增殖能力的测定

1、步骤：

将转染24小时后的下咽癌细胞FADU接种于96孔细胞培养板中，每孔2*10³个细胞/孔/200μl，细胞分组如下：

实验组1(对照组)：下咽癌细胞转染pcDNA3.1；

实验组2：下咽癌细胞转染pcDNA3.1-ERC1。

将细胞在37℃、5％CO₂培养箱再次孵育24小时后，根据Brd>

2、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

3、结果

结果如图5所示，相比于实验组1，实验组2的细胞增殖减缓，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明，ERC1表达可以抑制下咽癌细胞增殖。

实施例5 检测ERC1基因表达对细胞迁移的影响

1、迁移实验步骤

(1)将转染24h后的细胞消化，调整细胞密度为10⁵/ml；

(2)24孔细胞培养板每孔加入600μL进口胎牛血清(FBS)，将Transwell小室置入24孔细胞培养板小孔，Transwell小室内加入各100μL RPMI 1640培养基细胞悬液；

(3)24孔细胞培养板孵育24h，将Transwell小室从24孔细胞培养板取出，弃掉培养基，PBS冲洗Transwell小室膜部附着细胞；

(4)取新24孔细胞培养板，小孔内加入甲醇/PBS混合液((1:1)600μL，将Transwell小室放入小孔，使甲醇/PBS混合液从下室(24孔细胞培养板小孔)浸入上室，室温静置15min；

(5)弃掉Transwell小室上室及24孔细胞培养板小孔内甲醇/PBS混合液，下室加入600μL甲醇，将Transwell小室置入小孔，使甲醇从下室(24孔细胞培养板小孔)浸入上室，室温静置15min；

(6)弃掉甲醇，室温下干燥15-30min；

(7)取0.1％结晶紫染液600μL滴入24孔细胞培养板小孔，将Transwell小室置入小孔染色15min；

(8)弃掉0.1％结晶紫染液，蒸馏水冲洗Transwell小室15min，晾干，显微镜下观察，取不同视野拍照计数，实验重复3次。

2、结果

转染pcDNA3.1组和转染pcDNA3.1-ERC1组每个视野下平均迁移细胞数目分别为(166.32±15.41)个和(76.57土9.13)个，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明，ERC1基因表达抑制了下咽癌细胞的迁移。

实施例6 检测ERC1基因表达对细胞侵袭的影响

1、侵袭实验步骤

实验前从-20℃冰箱取出Matrigel^TM基质胶，冰盒上融化，取Matrigel^TM基质胶与RPMI>2培养箱孵育30min，后续细胞接种及培养操作同上述细胞迁移实验。培养24h后，弃掉培基，用棉签轻轻拭去Transwell小室上室内Matrigel^TM基质胶，勿损伤小室底膜，余操作同细胞转移实验。本实验重复3次。

2、结果

转染pcDNA3.1组和转染pcDNA3.1-ERC1组每个视野下平均侵袭细胞数目分别为(55.24±5.74)个和(26.01土3.45)个，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明，ERC1基因表达抑制了下咽癌细胞的侵袭。

实施例7 体外克隆形成能力的检测

1、步骤

(1)将转染24h后的细胞消化后制成细胞悬液，细胞计数板计数；

(2)六孔细胞培养板每孔加入2ml 10％FBS-RPMI 1640培养基，按500个/孔细胞密度接种细胞悬液，轻轻混匀；

(3)六孔细胞培养板移至37℃5％CO₂培养箱孵育10天，每3天更换培养基1次，每次2ml/孔；

(4)培养结束后，弃掉培养基，PBS缓冲液小心清洗3次，每次5min，室温干燥，甲醇固定15min，弃掉甲醇，室温空气干燥20min；

(5)取0.1％结晶紫染液加入细胞培养板，每孔加入1ml，染色15min；

(6)回收0.1％结晶紫染液，细胞培养板蒸馏水清洗15min；

(7)拍照观察计数，重复试验3次。

2、结果

转染pcDNA3.1组平均集落形成数目分别为(174.41±15.63)个，转染pcDNA3.1-ERC1组细胞平均集落形成数目为(77.15土4.73)个。上述实验结果表明，ERC1基因表达抑制了下咽癌细胞的成瘤能力。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。