一种野生稻染色体片段置换系的构建方法

摘要

本发明公开了一种野生稻染色体片段置换系(CSSL)的构建方法。本发明构建了能够覆盖全部染色体基因组的置换系群体，且置换系的遗传背景非常清晰，对某一个置换系而言，其遗传背景与受体亲本大致相同，只在某个已知标记区段与供体亲本存在差异，而对全套置换系而言，所有野生稻的染色体片断都有与之对应的标记区段，而且避免了重复和缺失。本发明构建的野生稻染色体片段置换系不仅为建立一个全面进行野生稻基因组学研究的平台提供基础，也为水稻基因组学研究、创新种质资源提供了长期有利的帮助。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种野生稻染色体片段置换系的构建方法。

背景技术

普通野生稻(Oryza.rufipogon Griff.)是亚洲栽培稻(O.sativa L.)的祖先种，是水稻品种改良的重要种质资源。已经发现野生稻具有抗病虫、抗逆、高产、优质、磷高效利用、不育和恢复等宝贵基因。因此，从野生稻中挖掘在栽培稻中已丢失或削弱了的优异基因，寻找和利用新的有利基因资源已成为水稻品种改良的新的突破口。

农作物产量、品质、抗性等许多重要的农艺性状，多属于复杂的数量遗传性状。由于其遗传背景复杂，通过遗传群体利用分子标记分析，QTL定位的精确度不高，也很难对QTL进行准确的效应估计和可靠的标记辅助选择，更不能实现QTL的分离克隆。染色体片段置换系(CSSL，chromosome segment substitution line)，是以同一亲本为遗传背景，置换了供体亲本一个或少数染色体片段的系列株系所组成的群体，利用该群体无需考虑其他基因组区域的遗传效应，可以大大提高对复杂农艺性状基因定位的精确性。此外，还可以在初级定位基础上，通过利用含有目标QTL的染色体片段置换系和背景亲本建立F₂次级分离群体及其高密度的遗传图谱，能将QTL位点分解成单个的孟德尔因子，进而通过图位克隆技术分离目标基因。

要利用野生稻种质资源中的有利基因，首先要对其进行遗传分析和基因定位的研究，为外源基因转移和利用提供遗传信息，从而为进一步进行分子辅助育种选择和基因克隆打下基础。但野生稻综合农艺性状差，不利基因出现频率高且多与有利基因连锁，这些都限制了对野生稻优良基因的直接精确定位和利用，借助于已知基因组序列的栽培稻平台，建立一套以野生稻为供体亲本的多代回交的染色体片段置换系，使栽培稻的遗传背景只携带部分野生稻染色体片段或基因，是挖掘、定位、克隆野生稻优良基因的一种快捷准确的方法。

现有的已经构建的野生稻置换系以及导入系有很多，主要的方法是利用连续回交与分子辅助选择相结合的方法。如：Tian利用126个SSR分子标记构建了156个渗入系(IL)，Tan利用179个SSR分子标记构建了120个IL，Hirabayashi等人利用粳稻日本晴构建了3套渗入系，供体亲本为2个野生稻种。但是渗入系的缺点是导入片段过大，群体染色体基因组覆盖不完全，对下一步的QTL的精细定位于基因克隆效率不高。Furuta等人利用149个SNP分子标记构建了33个野生稻染色体偏独置换系，但这种小群体不足够对野生稻的基因组学进行全面的研究分析。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于构建野生稻染色体片段置换系的成套引物。

本发明提供的用于构建野生稻染色体片段置换系的成套引物由引物组1和引物组2组成；

所述引物组1由181个引物对组成；

所述引物组2由100个引物对组成；

所述181个引物对由引物对1-引物对181组成，引物对1-引物对181的核苷酸序列如表1所示；

所述100个引物对由所述引物对1、所述引物对3、所述引物对5、所述引物对7、所述引物对9、所述引物对11、所述引物对13、所述引物对15、所述引物对17、所述引物对19、所述引物对21、所述引物对23、所述引物对25、所述引物对27、所述引物对29、所述引物对31、所述引物对33、所述引物对35、所述引物对37、所述引物对39、所述引物对41、所述引物对43、所述引物对45、所述引物对47、所述引物对49、所述引物对51、所述引物对53、所述引物对55、所述引物对57、所述引物对59、所述引物对60、所述引物对61、所述引物对62、所述引物对64、所述引物对66、所述引物对68、所述引物对70、所述引物对71、所述引物对72、所述引物对74、所述引物对76、所述引物对78、所述引物对79、所述引物对81、所述引物对83、所述引物对85、所述引物对87、所述引物对89、所述引物对91、所述引物对93、所述引物对96、所述引物对98、所述引物对99、所述引物对101、所述引物对105、所述引物对106、所述引物对108、所述引物对112、所述引物对114、所述引物对116、所述引物对118、所述引物对120、所述引物对122、所述引物对124、所述引物对126、所述引物对128、所述引物对130、所述引物对132、所述引物对134、所述引物对136、所述引物对137、所述引物对138、所述引物对139、所述引物对141、所述引物对142、所述引物对144、所述引物对145、所述引物对146、所述引物对148、所述引物对150、所述引物对152、所述引物对153、所述引物对154、所述引物对156、所述引物对157、所述引物对159、所述引物对160、所述引物对162、所述引物对164、所述引物对165、所述引物对166、所述引物对168、所述引物对170、所述引物对172、所述引物对173、所述引物对174、所述引物对175、所述引物对176、所述引物对178和所述引物对180组成。

本发明的另一个目的是提供用于构建野生稻染色体片段置换系的成套PCR试剂或试剂盒。

本发明提供的用于构建野生稻染色体片段置换系的成套PCR试剂由PCR试剂1和PCR试剂2组成；

所述PCR试剂1包括所述181个引物对；

所述PCR试剂2包括所述100个引物对。

本发明还有一个目的是提供上述成套引物或上述成套PCR试剂或试剂盒的新用途。

本发明提供了上述成套引物或上述成套PCR试剂或试剂盒在构建野生稻染色体片段置换系中的应用。

本发明还有一个目的是提供一种野生稻染色体片段置换系的构建方法。

本发明提供的野生稻染色体片段置换系的构建方法包括如下步骤：

(1)以栽培稻为非轮回亲本，以野生稻为轮回亲本，回交三次，得到BC₃F₁代群体；

(2)用上述引物组2对所述BC₃F₁代群体进行筛选，得到所述引物组2中每个引物对的代表株，将选择得到的代表株组成的群体记作BC₃F₁-A代群体；

所述每个引物对的代表株为满足如下条件的单株：该引物对对应的基因组上的标记片段在该代表株中与在所述野生稻中一致；

(3)将所述BC₃F₁-A代群体的单株分别与所述栽培稻进行第四次回交，得到BC₄F₁代群体；

(4)用上述引物组1中的各个引物对对所述BC₄F₁代群体进行筛选，选择满足如下条件的单株作为目标单株：该单株中仅有1对或2对或3对引物对对应的标记片段与在所述野生稻中一致，而引物组1中其余引物对在该单株中对应的标记片段与在所述栽培稻中一致；由目标单株组成的群体记作BC₄F₁-A代群体，即为目的野生稻染色体片段置换系中的成员。

上述方法中，所述步骤(4)中还包括如下步骤(ⅰ)：将所述BC₄F₁代群体中非目标单株的剩余单株记作BC₄F₁-B代群体；将所述BC₄F₁-B代群体的单株重复(3)-(4)的步骤，得到目标单株，由目标单株组成的群体作为目的野生稻染色体片段置换系中的成员；

所述BC₄F₁-A代群体的单株还包括自交的步骤；所述自交的次数为3-6次，所述自交的每一代中筛选含有相应引物对对应的标记片段的单株。

上述方法中，

所述步骤(2)的方法包括如下步骤：

a1)任意选取所述BC₃F₁代群体中的三个单株，分别记作单株X、单株Y和单株Z；任意选取所述引物组2中某一引物对，记作引物对M；

a2)采用所述引物对M分别对所述单株X、所述单株Y和所述单株Z进行鉴定，直至得到引物对M的代表株；

a3)依次类推，直至得到所述引物组2中每一个引物对的代表株，并将所有所述引物组2中的每一个引物对的代表株记作BC₃F₁-A代群体；

所述步骤(4)的方法包括如下步骤：

b1)采用所述引物组1中的各个引物对对所述群体O中的单株进行鉴定，选择满足如下条件的单株作为引物对M的目标单株：该单株中除了所述引物对M对应的标记片段与在所述野生稻中一致以外，引物组1其他引物对中至多含有2对引物对对应的标记片段与在所述野生稻中一致，而引物组1中其余引物对在该单株中对应的标记片段与在所述栽培稻中一致；

所述群体O为所述引物对M的代表株与所述栽培稻回交，得到的子代群体；

b2)依次类推，对所述BC₄F₁代群体中的其他单株进行鉴定，直至得到所述引物组2中每一个引物对的目标单株，并将所有所述引物组2中的每一个引物对的目标单株记作BC₄F₁-A代单株。

上述方法中，所述b1)中，所述引物组1其他引物对中至多含有2对引物对对应的标记片段与所述野生稻一致为如下N1)或N2)或N3)：

N1)引物组1其他引物对中没有引物对对应的标记片段与在所述野生稻中一致；

N2)引物组1其他引物对中仅含有1对引物对对应的标记片段与在所述野生稻中一致；

N3)引物组1其他引物对中仅含有2对引物对对应的标记片段与在所述野生稻中一致。

上述方法中，

所述栽培稻为栽培稻9311；

所述野生稻为普通野生稻。

本发明还有一个目的是提供上述方法制备得到的野生稻染色体片段置换系。

上述野生稻染色体片段置换系在作为近等基因系中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的最后一个目的是提供上述成套引物或上述PCR试剂或上述试剂盒或上述方法或上述野生稻染色体片段置换系的新用途。

本发明提供了上述成套引物或上述PCR试剂或上述试剂盒或上述方法或上述野生稻染色体片段置换系在如下c1)或c2)中的应用：

c1)数量性状位点定位；

c2)基因克隆。

本发明的构建方法的优点如下：

1、本发明在前人所用染色体片段置换系构建方法的基础上，加以改进，在BC₃F₁代才开始进行分子标记辅助选择(MAS，marker-assisted>3F₁代选择足够多的单株以使得群体足以覆盖野生稻全部的染色体基因组。BC₄F₁代检测所有单株的遗传背景，这一步工作量巨大，但是，以此为基础，构建的路线已经非常清晰，此后田间无论回交还是自交，工作量都已经缩小到了最小。

2、本发明构建的染色体片段置换系群体，已经最大限度地覆盖了供体亲本野生稻的染色体基因组，可达100％，即使构建过程中发生分子标记丢失产生空位(GAP)，亦可追溯上一代材料，选择单株继续自交或回交，弥补GAP。

3、本发明构建的染色体片段置换系群体，每个株系所含的置换片段平均不超过3个，每个置换片段长度小于5cM。多数只有一个置换片段，即单片段置换系，可以作为近等基因系(NIL，near isogenic line)利用，大大提高了下一步进行数量性状位点(QTL)定位和基因克隆的效率。

4、目前，本发明构建的野生稻染色体片段置换系，无论群体大小(200个左右)、染色体基因组覆盖率、单个株系所含有的片段大小、遗传噪音(即每个株系所含置换片段的多少)，都优于前人所构建的置换系群体。可以高效利用进行野生稻QTL定位与优异基因克隆。

本发明构建了能够覆盖全部染色体基因组的置换系群体，且置换系的遗传背景非常清晰，对某一个置换系而言，其遗传背景与受体亲本大致相同，只在某个已知标记区段与供体亲本存在差异，而对全套置换系而言，所有野生稻的染色体片段都有与之对应的标记区段，而且避免了重复和缺失。本发明构建的野生稻染色体片段置换系不仅为建立一个全面进行野生稻基因组学研究的平台提供基础，也为水稻基因组学研究、创新水稻种质资源提供了长期有利的帮助。

附图说明

图1为野生稻染色体片段置换系的构建流程图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的母本材料栽培稻9311为大规模推广的水稻恢复系品种，是测序品种，其全部的基因组序列可以从网站上下载获得：http://www.ricedata.cn/(国家水稻数据库中心)，可由国家水稻种质库免费提供，如用于商业育种用途，需与国家种质库(圃)以及种质资源收集人签订惠益分享协议。

下述实施例中的父本材料普通野生稻可由野生稻种质资源国家种质库(圃)免费提供，如用于商业育种用途，需与国家种质库(圃)以及种质资源收集人签订惠益分享协议。

实施例1、多态性SSR分子标记的鉴定与筛选

1、选择分布于12条染色体的780对SSR引物，175对InDel引物，用来筛选构建置换系所用的引物，所有的引物遗传距离(单位：cM厘摩尔根)来自于网站http://www.gramene.org。

2、参考文献“Eshed Y,Zamir D:A genomic library of Lycopersicon pennellii in L.esculentum:a tool for fine mapping of genes.Euphytica,1994,79(3):175-179.”中369对SSR引物检测出在双亲(野生稻与栽培稻9311)之间有多态性，最终选取均匀分布于12条染色体的119对SSR引物和62对InDel引物共181对引物用于构建置换系。181对引物的信息及序列如表1所示，每两条引物之间的遗传距离平均为5.7cM。

表1、119对SSR引物和62对InDel引物信息

实施例2、野生稻染色体片段置换系的构建方法

本发明的野生稻染色体片段置换系的构建方法是利用连续回交结合MAS，从BC3代开始进行分子标记检测，根据外源DNA片断的分布进行选择性回交，连续跟踪检测至高代回交后代，建立野生稻全基因组系列的染色体片段置换系。本发明的野生稻染色体片段置换系的构建流程图如图1所示，本发明的野生稻染色体片段置换系的构建方法具体如下：

1、以栽培稻9311为母本，普通野生稻为父本，进行杂交，得到F₁代种子。

2、将F₁代种子种植以后，田间鉴定杂种真伪(由于以栽培稻为母本，野生稻与栽培稻的杂种田间表型明显不同于栽培稻，自交后代和杂交后代在田间很容易区分)。选取其中一株杂交F₁代植株，将其与栽培稻9311回交，得到BC₁F₁代种子。

3、将BC₁F₁代种子单粒种植，得到约为200个BC₁F₁代单株，每株分别与栽培稻9311回交，每株行平均收获10个BC₂F₁代种子，同时收获自交种子保存；将BC₂F₁代种子单粒种植，得到约为2000个BC₂F₁代单株；每个株行选择1-2个BC₂F₁单株再分别与栽培稻9311回交，得到BC₃F₁代种子；将BC₃F₁代种子单粒种植，得到1000个BC₃F₁代单株。

4、自BC₃F₁代开始，选择某个分子标记野生稻基因型的单株，自交或者回交，下代植株仍然以该分子标记进行筛选，即选取该分子标记野生稻基因型的单株，自交或者回交，直至株系稳定。具体步骤如下：

(1)单标记追踪的方法检测BC₃F₁代植株基因型

采用单标记追踪的方法，随机选取均匀分布于12条染色体上的100个引物对(由引物对1、引物对3、引物对5、引物对7、引物对9、引物对11、引物对13、引物对15、引物对17、引物对19、引物对21、引物对23、引物对25、引物对27、引物对29、引物对31、引物对33、引物对35、引物对37、引物对39、引物对41、引物对43、引物对45、引物对47、引物对49、引物对51、引物对53、引物对55、引物对57、引物对59、引物对60、引物对61、引物对62、引物对64、引物对66、引物对68、引物对70、引物对71、引物对72、引物对74、引物对76、引物对78、引物对79、引物对81、引物对83、引物对85、引物对87、引物对89、引物对91、引物对93、引物对96、引物对98、引物对99、引物对101、引物对105、引物对106、引物对108、引物对112、引物对114、引物对116、引物对118、引物对120、引物对122、引物对124、引物对126、引物对128、引物对130、引物对132、引物对134、引物对136、引物对137、引物对138、引物对139、引物对141、引物对142、引物对144、引物对145、引物对146、引物对148、引物对150、引物对152、引物对153、引物对154、引物对156、引物对157、引物对159、引物对160、引物对162、引物对164、引物对165、引物对166、引物对168、引物对170、引物对172、引物对173、引物对174、引物对175、引物对176、引物对178和引物对180组成)进行分子标记辅助选择(MAS)，来检测步骤3获得的1000个BC₃F₁代单株的基因型，分别选取含有每一对SSR引物对应的野生型片段的BC₃F₁代单株。

以100对SSR引物中的某一对SSR引物举例说明：将某一对SSR引物命名为SSR引物A，采用SSR引物A分别对任意3个BC₃F₁代单株(分别命名为植株1、植株2和植株3)的基因组DNA进行PCR扩增，分别检测PCR扩增产物，若SSR引物A对植株2的扩增结果与SSR引物A对野生稻的扩增结果相同，选取植株2，植株2即为含有SSR引物A对应的野生稻片段的单株，舍弃植株1和植株3。

按照此方法，得到其余100对SSR引物中每一对SSR引物对应的野生稻片段的单株，最终从1000个BC₃F₁代单株共选取了236个BC₃F₁代单株。将236个BC₃F₁代单株分别与栽培稻9311回交，得到BC₄F₁代种子，单粒种植，得到376个BC₄F₁代单株。

(2)单标记追踪的方法检测BC₄F₁代植株群体基因型(遗传背景)

采用全部181对SSR引物进行分子标记辅助选择(MAS)，来检测376个BC₄F₁代单株基因型，进而确定所有置换系单株的遗传背景。以后的世代单株，利用得到的遗传背景信息，检测除了追踪的标记片段以外其它野生稻片段是否置换掉，即选择遗传噪音少的单株，继续回交或者自交。

以含有SSR引物A对应的野生稻片段的单株举例说明：分别采用181对SSR引物对含有SSR引物A对应的野生稻片段的单株进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，

若该单株除了含有SSR引物A对应的野生稻片段外，还含有其他SSR引物对应的野生稻片段的个数不多于2个，则将该单株自交，一直自交至BC₄F₄或BC₄F₅，直至稳定，多代自交中结合MAS，自交的下一代植株中，仍然筛选含有SSR引物A对应的野生稻片段且田间表现稳定的植株；

若该单株除了含有SSR引物A对应的野生稻片段外，含有其他SSR引物对应的野生稻片段的个数多于2个，则将该单株与栽培稻9311回交，一直回交至BC₅F₁或BC₆F₁或BC₇F₁，直至该单株含有其他SSR引物对应的野生稻片段的个数少于或等于2个，再按照上述方法多代自交结合MAS，自交和回交的下一代植株中，仍然筛选含有SSR引物A对应的野生稻片段且田间表现稳定的植株。

每代每系种植20-30株，选择20单株取叶片提取DNA，固定分子标记追踪。直至各系材料田间表现稳定，最终获得200个株系，整个群体覆盖全部的野生稻染色体基因组。通过与水稻序列比对和功能检测结果表明，本发明得到的染色体片段置换系不仅能够全面开展野生稻基因组学研究，而且还可能获得一系列具有野生稻优良基因的水稻创新种质。