基于杂交链式反应(HCR)的检测的邻近试验

摘要

本发明提供一种用于检测样品中的分析物的方法，所述方法包括a)使所述样品与包括至少第一和第二邻近探针的一组邻近探针接触，所述探针每个包括能够直接或间接结合所述分析物的分析物结合结构域和核酸结构域，从而所述邻近探针可以同时直接或间接结合所述分析物，其中i)所述第一和第二邻近探针的所述核酸结构域包括能够在允许条件下介导涉及所述结构域的相互作用的区域；并且ii)所述第一和第二探针中的一个的所述核酸结构域包括HCR起始子区域，所述HCR起始子区域包括在亚稳定的二级结构内，从而在从所述亚稳定的二级结构释放之前，所述HCR起始子区域不能起始HCR反应；b)引入允许条件以当所述探针两者均已直接或间接结合所述分析物时，允许所述第一和第二探针的所述核酸结构域彼此相互作用，其中所述相互作用使得所述第一或第二探针的所述核酸结构域的所述亚稳定的二级结构解折叠，以释放单链HCR起始子区域；c)使用至少两个HCR单体进行HCR反应，其中所述第一HCR单体包括所述HCR起始子区域的互补性区域，并且所述HCR起始子区域与所述第一HCR聚合物的杂交使所述HCR反应开始，以形成聚合物；以及d)检测所述聚合物，由此检测所述分析物。

说明书

技术领域

本发明涉及用于样品中的分析物的基于邻近探针的检测试验(“邻近试验(proximity assay)”)。分析物可以是任何形式或任何类型的样品(例如，无论是原位还是以分离形式)中期望检测的任何分子，包括蛋白和核酸。通过至少两个探针的结合来检测分析物，所述至少两个探针可以直接或间接结合分析物，并且当通过结合分析物而靠近时，所述至少两个探针相互作用以允许产生信号。在本发明的新方法中，通过杂交链式反应(HCR)产生信号，当探针在分析物结合后相互作用时，引发所述杂交链式反应(HCR)。也提供了用于进行这样的试验的试剂盒和试剂。

背景技术

邻近试验依赖于“邻近探测”的原理，其中分析物通过多个(即，两个或更多个，一般为两个、三个或四个)探针的同时结合来检测，当通过结合分析物而靠近(因此为“邻近探针”)时，所述多个探针允许产生信号。典型地，至少一个所述邻近探针包括与探针的分析物结合结构域(或部分)连接的核酸结构域(或部分)，并且信号的产生涉及核酸结构域/部分和/或其他探针携带的一个或多个另外的功能部分之间的相互作用。由此，信号产生依赖于探针之间的相互作用，更具体和典型地邻近探针的核酸结构域/部分之间的相互作用，并且因此仅在必要的两个(或更多个)探针已结合分析物时发生，由此提高试验的特异性。最近几年已经开发了邻近探测的概念，并且基于该原理的许多试验目前也是本领域所熟知的。例如，邻位连接试验(PLA)依赖于邻近探针与分析物的邻近结合，以从涉及或者由邻近探针的核酸结构域介导的(例如，所述邻近探针的核酸结构域之间的和/或以所述邻近探针的核酸结构域为模板的)连接反应产生信号。在PLA中，至少一个，并且优选地两个或更多个核酸分子的分子内或分子间连接形成可检测的，优选地可扩增的核酸检测产物，通过所述核酸检测产物来检测所述分析物。

因此，通过将样品中的一种或更多种分析物的存在转变为可快速检测的或可定量的基于核酸的信号，基于邻近探针的检测试验，并且更具体地邻位连接技术允许灵敏、快速并且方便地检测或定量这样的分析物，并且所述检测或定量可以以均相的或异相方式进行。

本领域的邻近探针一般成对使用，并且各自由对靶分析物或对靶分析物的主要结合物(例如抗体)具有特异性的分析物结合结构域，以及与所述邻近探针联接(linked)、结合(coupled)或偶联(conjugated)的核酸结构域组成。分析物结合结构域可以是例如核酸“适配体”(Fredriksson等(2002)Nat Biotech 20:473-477)或者可以是蛋白质的，如单克隆抗体或多克隆抗体(Gullberg等(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101:8420-8424)。每个邻近探针对的各自的分析物结合结构域可以具有针对分析物上不同的结合位点的特异性，所述分析物可以由单个分子或者相互作用的分子的复合物组成，或者例如在靶分析物作为多聚体存在时，可以具有相同的特异性。当邻近探针对彼此靠近时，这主要发生在所述两个邻近探针均被结合它们在分析物分子或分析物复合物上各自的位点时，即在探针到靶分析物的同时结合时，功能结构域(例如，核酸结构域)能够直接或间接相互作用。例如，核酸结构域可以一般通过连接反应而接合，以形成新的核酸序列，所述连接反应可以以添加到反应的夹板寡核苷酸(splint oligonucleotide)为模板，所述夹板寡核苷酸包含针对邻近探针对的各自的核酸结构域的末端的互补性区域。由此产生的新的核酸序列用于报告样品中分析物的存在和量，并且可例如通过实时定量PCR(q-PCR)来定性或定量检测。

可选地，不是彼此连接，而是当邻近时，邻近探针的一个或多个核酸结构域可以作为一个或更多个寡核苷酸彼此连接的模板(所述一个或更多个寡核苷酸可以是一个或更多个邻近探针的核酸结构域或者一个或多个添加的寡核苷酸)，所述连接包括分子内连接，以使添加的线性寡核苷酸环化，例如基于被称作锁式探针的原理，其中类似于锁式探针，添加的线性寡核苷酸的末端靠近用于通过与模板(此处为邻近探针的核酸结构域)杂交来连接。在这样的试验中，强信号扩增可以通过所产生的环状核酸分子的滚换扩增(RCA)来实现。当邻近试验用于分析物的局部“原位”检测时，基于RCA的信号产生是特别有利的。各种试验方式描述在WO 01/61037和WO 97/00446中。

WO 97/00446和US 6,511,809公开了邻位连接试验的异相方式，即通过特异性的分析物结合试剂，首先将分析物固定到固体底物上。

WO 01/61037、WO 03/044231、WO 2005/123963,Fredriksson等(2002)NatBiotech20:473-477和Gullberg等(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101:8420-8424公开了均相邻位连接试验(即，在溶液中)。

并非所有邻近试验都基于连接。WO 2007/044903公开了用于检测分析物的基于邻近探针的试验，所述试验依赖于释放的核酸裂解产物的形成和检测。所描述的实施方式中的一些涉及包括分析物结合部分和附着的酶的探针，所述酶作用于附着至第二探针的分析物结合部分的核酸部分，使得可检测的核酸裂解产物释放。其他的邻近试验依赖于可以仅在探针已经邻近结合时发生的延伸反应。

已经证实了基于接近探针的检测试验，具体地邻近连接试验在许多不同的应用中在对蛋白的特异且灵敏的检测中是非常有用的，例如，对弱表达或低丰度蛋白的检测或者对核酸或蛋白的原位检测。基本上存在有或可以产生结合物的任何分析物都可以被检测，并且不仅在诊断环境中对检测已知蛋白或其他分析物感兴趣，而且也感兴趣的是在蛋白质组学研究中不仅仅检测特定蛋白及其水平还检测它们的活性。在许多情况下，蛋白活性可以依赖于翻译后修饰(PTM)和蛋白-蛋白相互作用(PPI)。的确，蛋白和核酸之间的相互作用(PNAI)对于细胞和蛋白的活性以及PTM的分析是重要的，并且这样的相互作用，PNAI和PPI，以及对蛋白本身的检测对于确定细胞或信号通路的功能状态是重要的。因此，对蛋白、PTM和蛋白相互作用，例如PPI，的选择性且灵敏的检测是蛋白质组学研究和临床诊断中的主要挑战。尽管邻近试验具有许多益处使得它们特别适合于使用在这样的应用中，但是所述邻近试验也具有弊端，即通常使用酶来介导核酸结构域之间的相互作用(例如连接酶)和/或信号产生或检测步骤(例如聚合酶)。这使得试验更加昂贵并且对于酶的储存和稳定性提出要求。对于用于蛋白、PTM和蛋白相互作用的检测的护理点设备的开发而言，不需要酶催化步骤的更稳健的方法将是有益的。

为了解决该需要，以及更一般地对于具有减少的背景(减少的非特异性信号产生)的稳健、简单且容易使用但是特异且灵敏的试验的需要，已经开发了本发明。本发明的新的实验方法有利地结合通过邻近试验的分析物检测与通过杂交链式反应(HCR)的信号产生，来提供可以用来选择性地，或特异性地且灵敏地检测蛋白或者蛋白修饰或相互作用，或者其它分析物的方法，所述方法具有强信号扩增但是不依赖于酶。

HCR是最近开发的用于基于核酸分子的杂交链式反应的无酶核酸扩增的技术，所述一系列核酸分子的杂交是从彼此杂交以形成缺口核酸聚合物的稳定的(更具体地亚稳定的)单体发夹或其他亚稳定的核酸结构开始引发的。HCR被详细描述在Dirks和Pierce,2004,PNAS,101(43),15275-15278中以及在US 7,632,641和US 7,721,721中，所述参考文件均通过引用以其全部并入本文(也见US 2006/00234261；Chemeris等,2008DokladyBiochemistry and Biophysics,419,53-55；Niu等,2010,46,3089-3091；Choi等,2010,Nat.Biotechnol.28(11),1208-1212；以及Song等,2012,Analyst,137,1396-1401，所述所有参考文件也都通过引用以其全部并入本文)。

在最简单形式的HCR中，当引入“起始子”核酸分子时，两种不同的稳定的发夹单体经历杂交链式反应事件，而形成长的缺口双链DNA分子。在不存在起始子的情况下，发夹单体是稳定的，或者动力学上受限制的(“亚稳定的”)，并且保持为单体(即，阻止系统快速平衡)。然而，一旦被引入，起始子能够与第一发夹单体杂交，并且干扰所述第一发夹单体而使它打开并且与第二发夹单体杂交并且干扰所述第二发夹单体，接着使所述第二发夹单体打开并且使它与第一单体的另一个分子杂交并干扰第一单体的另一个分子，以此类推，直到单体被耗尽，使得形成具有交替的第一和第二单体种类单元的缺口链。起始子的杂交和干扰由此引发HCR。HCR背后的基本原理是短环核酸对于互补的单链核酸的干扰有抵抗力。该稳定性允许势能以核酸环的形式储存。当被引发的构象改变允许环中的单链碱基与互补链杂交时，势能被释放。HCR单体由此包含这样的环，以及被环结构防护或保护的另一个HCR单体的互补性区域，从而当环结构被打开时所述互补性区域仅可以与另一个HCR单体杂交。第一种单体还包括起始子分子可用的互补性区域。起始子的引入引发两个单体种类(species)的交替的动力学逃逸(环结构开口)的链式反应，从而允许它们杂交并且由此相应地“聚合”成缺口双螺旋，所述起始子与第一单体种类杂交并干扰第一单体种类，使所述第一单体种类打开。

最初被开发的是通过使用适配体检测靶核酸或生物小分子，而HCR近来用于和抗体(Choi等,2011,上文)、酶辅助读出(Niu等,2010,上文)和实时分析(Chemeris等.2008,上文)结合。

如上文指出的，本发明结合了邻近探针与HCR的益处。在产生本发明的工作中，发明人能够开发出这样的系统，在所述系统中邻近探针的核酸结构域的相互作用可以使得用于HCR反应的起始子释放(即，产生或暴露)。以该方式，反应可以被控制，从而不引发或起始HCR，除非或直到探针已被直接或间接与靶分析物结合。进一步，邻近探针的核酸结构域的相互作用可以被控制，从而只有被结合邻近的分析物的探针的核酸结构域能够彼此相互作用。这使得因非特异性探针结合而产生的信号减少，并且因此使得试验特异性增强。因此，由邻近探针提供的特异性和减少的背景可以有利地与由HCR提供的快速和有效的无酶信号产生结合。

在本发明的新方法中，邻近探针的核酸结构域被设计以包含能够典型地通过彼此杂交而与另一个邻近探针的核酸结构域中的区域(序列)相互作用的区域或序列。因此，两个邻近探针的核酸结构域可以包含彼此的相互互补性区域，即与另一个邻近探针中的区域或序列的区域或序列互补，从而当探针邻近时核酸结构域能够在所述互补序列处杂交。探针中的一个在它的核酸结构域中还包含能够起HCR反应的起始子的作用的区域或序列(换言之，所述区域或序列是或者包括与第一HCR单体中可用的序列互补(即与HCR单体的起始子互补区域互补)的序列)。该HCR起始子区域被“保护”或避免与HCR单体杂交，并且由此通过被包含在亚稳定的二级结构(更具体地双链亚稳定的二级结构，例如类似于HCR单体的结构的茎环结构)中而起始HCR反应。邻近探针的核酸结构域的相互作用，例如通过它们的互补区域的杂交，使得亚稳定的二级结构破裂或解折叠(即“打开”)，由此释放HCR起始子，所述HCR起始子随后游离与第一HCR单体杂交并且触发或引发HCR反应。

为了将另外的控制元件添加到系统，邻近探针的核酸结构域可以被设计为使得它们不能够彼此相互作用，即被阻止相互作用(例如，它们被阻止彼此杂交)，直到相互作用被激活或允许，而通常当探针已结合它们的一个或多个靶分子时就会激活允许所述相互作用。因此，尽管核酸结构域具有相互作用区域，但是一旦邻近探针已结合它们各自的靶(并且如果需要的话，任何未结合的探针已经被除去，例如被洗掉)，至少一个所述探针的核酸结构域的相互作用区域或“反应元件”(即参与核酸结构域之间的相互作用的元件或区域)，例如互补性区域，只可用于相互作用。换言之，至少一个核酸结构域的相互作用区域可以被保护或避免相互作用，或者所述区域仅在某些允许条件下才能够相互作用。核酸结构域可以例如通过除去“保护”或引入允许条件被“激活”以相互作用。这可以以各种方式实现，例如，通过使用可以被除去或替换的封闭性寡核苷酸，或者通过将相互作用区域保护在亚稳定的二级结构内，例如通过引入能够与核酸结构域杂交并且干扰亚稳定的二级结构而使得它打开或解折叠的激活子或“起始子”寡核苷酸(类似于HCR起始子)，所述亚稳定的二级结构可以被解折叠或破裂以释放或暴露相互作用区域并使其为可用的或者可用于相互作用的。

通过控制核酸结构域的相互作用，试验方法或反应可以被允许顺序进行，即以不连续的和/或可分开的阶段进行。这可以显著地提高试验的灵敏度和特异性。而且，在一些实施方式中，这可以简化试验流程，因为它允许所有潜在地相互作用元件同时与样品接触，而它们不相互作用，即邻近探针的核酸结构域的反应元件被阻止相互作用并且因此不会起始HCR反应。因此，在第一个实例中，邻近探针被允许与样品相互作用，从而只有邻近探针的分析物结合结构域可以与样品中的分析物相互作用。根据允许邻近探针结合分析物(即，基于探针到分析物的同时结合)的充分条件，邻近探针的核酸结构域的相互作用可以被激活或允许。这可以减少试验中的非特异性背景信号。

因此，在其最宽泛的范围内，可以看到本发明提供了一种检测样品中的分析物的方法，所述方法包括：

(a)使所述样品与包括至少第一和第二邻近探针的一组邻近探针接触，所述探针每个包括能够直接或间接结合所述分析物的分析物结合结构域和核酸结构域，从而所述邻近探针可以同时直接或间接结合所述分析物，其中

(i)所述第一和第二邻近探针的所述核酸结构域包括能够在允许条件下介导涉及所述结构域的相互作用的区域；并且

(ii)所述第一和第二探针中的一个的所述核酸结构域包括HCR起始子区域，所述HCR起始子区域包括在亚稳定的二级结构内，从而在从所述亚稳定的二级结构释放之前，所述HCR起始子区域不能起始HCR反应；

(b)引入允许条件以当所述探针两者均已直接或间接结合所述分析物时，允许所述第一和第二探针的所述核酸结构域彼此相互作用，其中所述相互作用使得所述第一或第二探针的所述核酸结构域的所述亚稳定的二级结构的解折叠，以释放单链HCR起始子区域；

(c)使用至少两个HCR单体进行HCR反应，其中所述第一HCR单体包括所述HCR起始子区域的互补性区域，并且所述HCR起始子区域与所述第一HCR单体的杂交使所述HCR反应开始，以形成聚合物；

(d)检测所述聚合物，由此检测所述分析物。

有利地，在步骤(a)中，条件是不允许的，并且核酸结构域不能够相互作用。

更具体地，所述相互作用是核酸结构域之间的相互作用，即结构域彼此相互作用。优选地，所述相互作用包括或涉及，或者实际上是，结构域之间的杂交。因此，核酸结构域可以包含互相相互作用的相互作用区域，例如能够彼此杂交的区域。换言之，第一邻近探针的核酸结构域(第一核酸结构域)可以包含与第二或其他邻近探针的核酸结构域(第二或其他核酸结构域)中的关联互补性区域互补的互补性区域(即序列)。核酸结构域中这样的互补区域可以被看作是用于另一个核酸结构域的结合位点。

术语“允许条件”在本文中被用来宽泛地指核酸结构域的相互作用区域能够相互作用的任何状态或条件。“非允许”条件意为相反地，即相互作用区域不能够相互作用，并且这包括相互作用区域例如通过单独添加的杂交或结合所述相互作用区域的封闭性寡核苷酸或其他分子，或者通过核酸结构域中的二级结构区域而被保护(或防护或掩蔽)。即核酸结构域可以包含自互补性区域。自互补区域可以彼此杂交，以形成二级结构区域。典型地，二级结构区域将包含单链核酸的环，更具体地包括双链“茎”区域和单链环的茎环或发夹结构。更具体地，二级结构是亚稳定的二级结构。

在优选实施方式中，亚稳定的二级结构是或者包括茎环或发夹。相互作用区域可以被包含在二级结构，例如茎结构中。在该情况下，所述相互作用区域被茎结构保护免于相互作用。可选地，所述相互作用区域可以位于环区域中。为了阻止相互作用，只要相互作用区域中的一个被保护就足够了，但是并不排除更多个或所有的(即两个)相互作用区域都被保护。因此，在第一核酸结构域的相互作用结构域被保护的情况下，第二核酸结构域的相互作用结构域可以位于二级结构的环区域的可用区域中。具体地，在两个相互作用核酸结构域的情况下，相互作用区域可以位于第一核酸结构域的茎中，并且相应的相互作用区域可以位于第二核酸结构域的环中，从而它可进入与第一相互作用区域的相互作用。在一个实施方式中，第一核酸结构域的相互作用区域可以位于核酸结构域的末端处，更具体地位于形成茎环结构或发夹的环时涉及的末端处。第二核酸结构域的相互作用区域可以位于内部，具体地位于茎环结构或发夹的环中。以该方式，一旦第一相互作用区域通过破裂或解折叠茎环或发夹而被释放或暴露，第二结构域的相互作用区域可接近而与第一结构域的相互作用区域相互作用。然而，明显地，第二核酸结构域的相互作用区域可以部分位于茎环结构或发夹的环中，并且部分位于茎环结构或发夹的茎中，即第一核酸结构域的相互作用区域结合第二核酸结构域的相互作用区域的一部分使得第一核酸结构域的链干扰以及发夹结构解折叠。因此，在相互作用区域位于可进入相互作用的核酸结构域的区域中(例如环中)的情况下，相互作用区域的一部分可相互作用(即，与它相应的结合伴侣结合(杂交))就足够了——相互作用区域的全部不必是初始可用的，但是可以由于亚稳定的二级结构的链干扰和打开而成为完全可进入的。因此，核酸结构域的相互作用区域(以及照此类推核酸结构域和/或HCR单体的其他的结合结构域/位点或互补性区域)不需要是沿互补区域的全长都可用——存在足够的允许结合(或杂交)发生的可进入的互补序列就足够了。

可以通过除去封闭性寡核苷酸或者破裂或解折叠二级结构(例如破裂或替换或干扰茎环或发夹结构的双链茎)引入允许条件。这可以包括添加另外的试剂或试验成分，例如寡核苷酸(如上文讨论的激活子或“起始子”寡核苷酸)，所述另外的试剂或试验成分能够结合核酸结构域来“打开”二级结构，例如，以干扰或以其他方式代替茎结构，或者更宽泛地诱导构象改变，所述构象改变暴露相互作用区域并且从而可进入结合所述相互作用区域。可选地，可以添加试剂或成分，或者可以引入条件，所述试剂或成分或者条件造成或导致封闭性寡核苷酸的除去或替换，例如造成或导致封闭性寡核苷酸的降解或裂解。为了这个目的，封闭性寡核苷酸可以包括一个或更多个裂解或可降解的基团或核苷酸。例如，封闭性寡核苷酸可以包括或者可以由核糖核苷酸构成，从而它可以通过核糖核酸酶(例如Rnase)的添加而被消化。

在可选的实施方式中，封闭性寡核苷酸可以包括可以使用尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)从所述寡核苷酸切割的尿嘧啶残基。一个或更多个尿嘧啶碱基的除去可以破坏封与闭性寡核苷酸的杂交，导致它被替换或释放。进一步可选地，封闭性寡核苷酸可以包括用于切口酶的一个或更多个切割识别位点。切口酶对封闭性寡核苷酸的切割可以破坏它的杂交，从而导致它被替换或释放。

在使用封闭性寡核苷酸的情况下，所述封闭性寡核苷酸将在探针与样品接触之前与核酸结构域预杂交。

在进一步的实施方式中，第一邻近探针的核酸结构域可以被这样设计，从而当探针未结合它的靶时，第一相互作用区域被保护在二级结构内。然而，当靶结合时可以诱导构象改变，所述构象改变暴露第一相互作用区域并且使它可用于与第二邻近探针的第二相互作用区域的相互作用。例如，探针的结合可以导致二级结构的破裂或解折叠，以暴露或释放第一相互作用区域并且使它可用于相互作用。这可以例如用邻近探针来实现，在所述邻近探针中结合结构域是适配体，所述适配体在结合时经历构象改变，或者其中适配体的结合导致探针的核酸结构域中的构象改变。在该情况下，将看到的是，允许条件是探针已直接或间接结合分析物的情况(即探针已结合它的靶的情况)，而非允许条件是探针未结合的情况(例如靶或分析物不存在时)，或者探针与它的靶的特异性结合尚未发生(例如如果条件不适合或不利于结合，或者没有允许足够的用于结合的时间的情况)。例如在分析物是或者包括核酸的情况下，这样的系统可以是有用的。在其他实施方式中，第一邻近探针的核酸结构域可以被这样设计，从而物理或化学条件的变化可以诱导或促进构象改变，所述构象改变暴露或释放第一相互作用区域，例如pH、温度、磁场、导电性或氧化还原条件的变化，或者化学试剂的添加。邻近探针，或者更具体地核酸结构域，可以包括或者与这样的分子或部分缔合，所述分子或部分响应物理或化学条件的变化，并且经历或导致核酸结构域中发生构象改变。

例如，在一个这样的实施方式中，相互作用区域可以通过被包含在二级结构中而被保护，所述二级结构被一个或更多个二硫桥键或其他共价桥键产生或保持在适当位置中。换言之，可逆的化学交联可以被引入到一个或多个核酸结构域中。因此，化学基团或部分可以被引入到能够形成共价键的一个或多个核酸结构域中。通过在核酸结构域中适当定位这样的基团(例如，修饰核苷酸上的基团)，二级结构可以在邻近探针(例如，在它与分析物接触之前)中被产生或固定在适当位置中(如果二级结构可以通过自互补区域之间的杂交形成的话)。例如，例如通过将二硫键形成的基团或部分合并在核酸结构域的5’和3’末端，二硫桥键可以被引入到发夹结构的茎中。这样的共价桥键可以被破裂或破坏，以解折叠二级结构并且释放(即脱保护)互相作用区域。这可以例如通过引入适当的化学试剂或适当的条件，例如在二硫键的情况下通过添加还原剂(例如DTT)来实现。形成可逆的共价键的一些不同的基团为本领域已知的，所述基团可以被用来使核酸结构域交联，并且产生二级结构或者使所述二级结构固定或保持在适当位置。和二硫键一样，这样的键可以使用基于硼酸盐的联接技术，或者本领域中已知或使用来产生化学交联的其他化学反应或方法来产生。例如通过使硼酸基团与乙醇(例如二醇)基团反应而使硼酸盐偶联化学过程起作用(Weith等1970.Biochemistry 9,4396-4401,US 5,777,148)。

在更具体限定的方面中，可以看到本发明提供了一种用于检测样品中的分析物的方法，所述方法包括：

(a)使所述样品与包括至少第一和第二邻近探针的一组邻近探针接触，所述探针每个包括能够直接或间接结合所述分析物的分析物结合结构域和核酸结构域，从而所述邻近探针可以同时直接或间接结合所述分析物，其中

(i)所述第一探针的所述核酸结构域包括所述第二探针的所述核酸结构域中的关联第二互补性区域的第一互补性区域，并且保护所述第一互补性区域，从而所述第一和第二互补区域不能够彼此杂交；

(ii)所述第二探针的所述核酸结构域包括HCR起始子区域，所述HCR起始子区域包括在亚稳定的二级结构内，从而在从所述亚稳定的二级结构释放之前，所述HCR起始子区域不能起始HCR反应；

(b)使所述第一互补性区域脱保护以当所述探针两者均已直接或间接结合所述分析物时，允许所述第一和第二探针的所述核酸结构域的所述第一和第二互补区域彼此杂交，其中所述杂交使得所述第二探针的所述核酸结构域的所述亚稳定的二级结构解折叠，以释放单链HCR起始子区域；

(c)使用至少两个HCR单体进行HCR反应，其中所述第一HCR单体包括所述HCR起始子区域的互补性区域，并且所述HCR起始子区域与所述第一HCR单体的杂交使所述HCR反应开始，以形成聚合物；

(d)检测所述聚合物，由此检测所述分析物。

第一互补性区域可以被封闭性寡核苷酸或者被自互补区域(例如通过如上文讨论的二级结构，更具体地亚稳定的二级结构)保护，并且可以同样如上文讨论的，例如通过除去(例如降解或替换)封闭性寡核苷酸或者通过解折叠或破裂二级结构而被脱保护。

因此，至少一个邻近探针的核酸结构域包含亚稳定的二级结构，并且在一个优选实施方式中，两个探针的核酸结构域包含亚稳定的二级结构，优选地包含环的结构，具体地茎环结构或发夹。在第一探针的核酸结构域中，亚稳定的二级结构保护第一互补区域。在第二探针的核酸结构域中，亚稳定的二级结构保护HCR起始子区域。在该实施方式中，第二互补区域在第二探针的核酸结构域的可用部分中，并且(如下文进一步解释的)与激活寡核苷酸互补的区域可以位于第一探针的核酸结构域的可用区域中。

如上文描述的，并且如众所周知和文献报道的，HCR单体还包含亚稳定的二级结构。HCR单体是能够组装以通过杂交在由HCR起始子分子起始的杂交链式反应中形成聚合物的核酸分子(一般地为寡核苷酸)。

“亚稳定的”意为当在非允许条件下，或者在不存在用于反应或相互作用的起始子或激活子(即在HCR单体的情况下为HCR起始子)或用于邻近探针相互作用(更具体地，邻近探针的核酸结构域之间的相互作用)的起始子/激活子的情况下，所讨论的核酸分子(无论是邻近探针的核酸结构域还是HCR单体)在动力学上不利于与它被设计来缔合(具体地，杂交)的另一个分子缔合，而无论所述另一个分子是另一个邻近探针的核酸结构域(还是更具体地所述另一个邻近探针的核酸结构域的相互作用/互补区域)。核酸结构域或HCR单体是动力学上受限制的。即，核酸结构域或HCR单体保持它们的二级结构；它们在非允许条件下或者在不存在起始子/激活子的情况下是稳定的，并且系统不能够平衡。当引入允许条件时，例如当起始子/激活子被添加或存在时，它可以破裂(例如干扰)核酸结构域的二级结构或HCR单体中的一个(第一HCR单体)的二级结构。该破裂或解折叠释放(或暴露)反应元件，即核酸结构域的相互作用/互补区域，或者就邻近探针的核酸结构域而言HCR起始子，或者就HCR单体而言另一个HCR单体种类的互补性区域。因此，本发明的方法依赖于在亚稳定的二级结构中由起始子分子或区域诱导的二级结构的变化。

亚稳定的二级结构优选地包括至少一个环(更具体地单链核酸环)以及至少一个双链区域(更具体地自互补性区域)，其中核酸结构域(或HCR单体)的两个自互补区域或部分杂交在一起，例如以形成茎结构或茎状结构。因此，在优选实施方式中，亚稳定的二级结构是(例如由以下组成)或者包括茎环或发夹。在二级结构(例如发夹)在邻近探针的核酸结构域中的进一步优选的实施方式中，所述二级结构没有粘性末端，即所述二级结构没有单链末端区域。(在HCR单体的情况下，如本领域已知的，一般会有HCR起始子结合的和/或杂交链式反应中使用的粘性末端)。在邻近探针的核酸结构域中不存在这样的粘性末端帮助确保：在不存在探针结合和/或允许条件的情况下核酸结构域不会相互作用，由此减少背景信号并且提高试验的特异性。

在试验的许多实施方式中，二级结构是或者包括单个茎环或发夹结构，特别是就核酸结构域而言。然而，如本领域已知的(尤其是在HCR情况范围中)，可以设计和设想其他的二级结构。因此，例如二级结构可以包含两个或更多个环，例如两个环。例如，发夹结构可以被修饰以在茎的一条“链”中包括第二个环——杂交以形成发夹的茎的自互补区域中的一个可以包含非互补核苷酸(即非互补并且因此不与构成茎的其他的自互补区域的核苷酸杂交)的伸展，并且所述非互补核苷酸因此“凸”出来形成环(所谓的“凸环(bulge-loop)”)。发夹结构还可以被修饰以包括茎的两条链之间的错配区域。在另一个实施方式中，两个发夹结构可以被单链区域连接。这样的二级结构常用在被设计来获得比线性HCR扩增更多的HCR单体的设计中，如下文进一步讨论的(参见例如US 7,721,721，特别是它的图3和4)。

如上文提到的，邻近探针中的一个或两个的核酸结构域优选地包括发夹，或者采取发夹的形式。在第一探针的核酸结构域中，茎优选地包含第一互补区域。在第二探针的核酸结构域中，茎优选地保护HCR起始子区域。第二互补区域位于环中，然而这可以延伸到茎中，即与HCR起始子区域互补的链中。因此，这可通过第一互补区域进入结合(“可用的(accessible)”意为当二级结构处于它的动力学稳定(“亚稳定”)状态时，区域对结合(杂交)有用)。在这样的实施方式中，第一互补区域优选地位于核酸结构域的自由末端(即未被附着至探针的结合结构域的末端)处或附近，例如3’末端，并且该末端被杂交在发夹的茎中。然而，在可选的实施方式中，第一互补区域可以位于被附着至结合结构域的核酸结构域的末端附近或者朝向所述末端，或者事实上核酸结构域中的任何地方。HCR起始子区域优选地位于第二核酸结构域的自由末端处，例如3’末端，所述末端被杂交在发夹的茎中。当第一互补区域被脱保护或释放时，它能够在第二核酸结构域的环(和茎)中与第二互补区域杂交。这导致第二核酸结构域的发夹解折叠并且打开茎结构，从而释放或暴露HCR起始子区域，在存在HCR单体的情况下所述HCR起始子区域随后可自由起始HCR反应。更具体地，第一互补区域到第二互补区域的结合导致所释放的第一核酸结构域的发夹干扰第二核酸结构域的发夹的茎结构，从而导致第二核酸结构域的发夹打开以暴露或释放HCR起始子区域。在第一互补区域与第二互补区域杂交的优选实施方式中，所产生的核酸双链结构可以包括一个或更多个错配(如两个、三个、四个或更多个错配)。在进一步优选的实施方式中，第二互补区域的关联互补序列(即，在第二邻近探针的核酸结构域中形成发夹的链的序列)可以相对于激活寡核苷酸的序列包括涉及一个或更多个错配(如两个、三个、四个或更多个错配)。换言之，在优选实施方式中，激活寡核苷酸可以不以100％的互补性与该区域结合。此外，在再另一个优选的实施方式中，第一互补区域可以相对于HCR单体中存在的序列互补物包括一个或更多个错配(如两个、三个、四个或更多个错配)。换言之，在该实施方式中，第一互补区域可以不以100％的互补性结合该区域。错配降低所形成的复合物的稳定性，这可以使系统具有较低效率。然而，错配阻止激活寡核苷酸结合第二互补区域，并且阻止HCR单体结合激活寡核苷酸和第一邻近探针的核酸结构域之间的复合物(即第一互补区域)。换言之，尽管不是邻近HCR检测的必要特征，这也可以帮助减少非特异性信号。

在进一步优选的实施方式中，HCR起始子区域的序列不存在于第一邻近探针的核酸结构域中，并且与激活寡核苷酸互补的序列不存在于第二邻近探针的核酸结构域中。

为了使第一互补区域脱保护(即，为了引入允许条件)，优选地使用激活子或起始子寡核苷酸。这是用于邻近探针相互作用的起始子(即，邻近或相互作用起始子)并且与HCR起始子不同。为了方便起见，在本文中使用术语“激活寡核苷酸(activatoroligonucleotide)”。因此，单独的激活寡核苷酸可以被引入，或者与结合的邻近探针接触(例如，被添加到样品或反应混合物中)。在这样的实施方式中，第一邻近探针的第一核酸结构域进一步包括用于激活寡核苷酸的结合位点，即与激活寡核苷酸中的关联互补区域互补的区域，即“激活子互补区域”。激活子互补区域位于第一核酸结构域中可用的位点，从而它可用于与激活子杂交(即，当第一核酸结构域的二级结构处于它的动力学上稳定的“亚稳定的”状态时)。便利地，激活子互补区域可以被包含在第一核酸结构域的发夹的环中，但是也可以延伸到第一核酸结构域的茎中，即与第一互补区域的链中互补。(如上文提到和解释的，激活子互补区域的至少一部分为可用的(即，位于核酸结构域的可用部分中)就足够了)。

激活寡核苷酸因此包括第一核酸结构域的激活子互补区域的关联互补性区域。

在实行本方法时，激活寡核苷酸可以被添加到样品中，或者被添加到包含结合分析物的邻近探针的反应混合物中。这可以，例如，在使探针与样品接触并且使探针与样品一起孵育以允许探针结合的步骤之后。有利地，在探针已被允许结合之后，可以存在洗涤步骤，或者除去或分离任何未结合的探针的其他步骤。在这之后，激活寡核苷酸可以被添加(或者，可以进行类似地引入允许条件的另一个步骤，例如，使第一互补区域脱保护)。

在激活寡核苷酸结合激活子互补区域之后，激活寡核苷酸就可以干扰或以其他方式替换第一核酸结构域的发夹的茎区域，从而导致它打开，即释放发夹。这种暴露或释放，即使第一互补区域脱保护，使得它可用于与第二互补区域杂交。

亚稳定的二级结构如发夹等的设计是本领域已知的，并且可以基于已知的原理来实行。对于本发明，一个或多个核酸结构域的二级结构被设计为足够稳定的，从而它在被激活或允许解折叠或打开时才会这么做，例如从而一个或多个发夹不会自己打开。这可以通过将已知的参数如环或茎等的大小/长度以及茎(双链区域)等的C/G比率考虑在内来实现。茎的强度需要与试验设计考虑在内的环等的大小相平衡，例如，平衡反应时间与稳定性，以减少非特异性信号等。这样的设计考虑在本领域技术人员的常规技能范围内。因此，环和茎或双链区域的长度可以被改变或调整，以确保在特定条件下的动力学稳定性和/或控制或调整反应速率。

为了提高本方法的特异性，各种选项可用于确保：不想要的用于激活寡核苷酸的结合(杂交)位点不存在于“其他”邻近探针的核酸结构域中，并且进一步对应于(即等同于或相同于)HCR起始子的所述不想要的序列不存在，例如，等同(即相同)于HCR起始子的序列不存在于第一邻近探针的核酸结构域中，并且激活子互补区域(即用于激活子的杂交位点)不存在于第二核酸结构域的核酸结构域中。

因此，在本发明的优选实施方式中，干扰链(激活寡核苷酸、第一互补区域或HCR起始子区域)不同于在亚稳定的二级结构中的双链区域内(例如，形成茎)的核酸结构域的序列。因此，干扰序列不能够与核酸结构域的双链(例如茎)结构中的互补序列结合(杂交)。这可以以不同方式来实现，例如通过使相应的互补区域(与干扰链互补)的序列移位，从而它可进入一个探针的核酸结构域中(例如，位于环中)并且被隐藏在另一个探针的双链结构中；通过设计序列从而干扰链不与茎区域的末端杂交；以及通过引入错配，如上文讨论的，从而所讨论的序列是不同的，并且避免不想要的(非特异性)杂交或减少到最低；或者这些方法中任意几项的组合。因此，干扰链可以a)除茎区域的一部分之外，还结合茎环结构的单链环内的序列，和/或b)不结合茎区域的全长；和/或c)相对于茎区域的核酸序列包括一个或更多个错配。当设计本发明的核酸时可以包括这些特征的任意组合，如单独地(a)、(b)或(c)，(a)和(b)，(a)和(c)，(b)和(c)，或者(a)、(b)和(c)。

提高特异性的进一步的可能性是减少激活寡核苷酸的长度——这可以允许激活寡核苷酸与第二邻近探针的核酸结构域不想要的杂交被减少或减到最少，但是对信号产生没有显著的不利影响。例如，激活寡核苷酸可以典型地为44nt长——从中减少6nt仍然可以允许足够的HCR的起始，但是可能减少激活寡核苷酸到第二探针的核酸结构域的杂交。这可以与上文选项中的任何一个或更多个组合(例如，(a)、(b)和/或(c))。

如下文实施例中描述的，例如，在使用具有发夹和44nt的激活寡核苷酸的两个邻近探针的系统中，第一发夹被设计为具有30bp的茎和18nt的环，并且第二发夹具有24bp的茎和19nt的环。因此，通过代表性的例子，核酸结构域中的茎环结构的茎与环的比率可以在1.0至2.0、优选地1.2至1.8、或更具体地1.24至1.70或约1.25至约1.67的范围中，例如1.3至1.6。例如，第一发夹可以具有约1.3的比率，并且第二发夹可以具有约1.6的比率。然而，取决于所采用的具体系统、结构设计和/或反应条件，可以使用不同的比率。

对于核酸结构域代表性的环大小可以例如为9至30nt，更具体地从10、11、12、15、16、17或18中的任一个至30、28、25、24、23、22、21、20或19中的任一个，例如15至20、16至20、17至20、16至19或17-19。然而，如上文指出的，这可以取决于系统而变化。

对于核酸结构域代表性的茎长度可以为例如10至50nt，更具体地从12、15、18、19、20、21、22、23或24中的任一个至45、40、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25或24中的任一个，例如15至32、15-30、18-32、18-30等。

如上文指出的，邻近探针的分析物结合结构域可以是用于靶分析物的结合伴侣，并且它可以是用于所述靶分析物的直接或间接的结合伴侣。因此，它可以经由结合靶分析物的中间分子或结合伴侣直接或间接结合靶分析物，分析物结合结构域结合所述中间分子(结合伴侣)。在这样的情况下，直接结合分析物的中间结合伴侣可以被看作主要结合伴侣或分析物，而邻近探针会是次级结合伴侣。特别地，分析物结合结构域或中间结合伴侣是用于分析物的特异性结合伴侣。结合伴侣是能够结合它的靶(例如靶分析物)的任何分子或实体，而特异性结合伴侣是能够特异性地结合它的靶(例如靶分析物)的一类分子或实体，即所述结合伴侣以比样品中的其他成分更大的亲和性和/或特异性结合所述靶(例如分析物)。因此，结合靶分析物可以与非靶分析物区别；特异性结合伴侣既不会结合非靶分析物，也不会以可忽略地或不可检测地或者任何这样的非特异性结合的方式结合非靶分析物，如果它发生，就可以进行区别。靶分析物好它的结合伴侣之间的结合典型地为非共价的。

在邻近探针经由中间分子结合分析物的一些实施方式中，邻近探针可以与中间分子一起预孵育。在其他实施方式中，样品可以首先与中间分子接触，并且孵育以允许所述分子结合。在可选的洗涤步骤之后，邻近探针随后可以与样品接触。

分析物结合结构域可以被选择为针对它的靶(例如靶分析物或中间分子)具有高的结合亲和性。通过高的结合亲和性，意为至少约10^-4M，通常至少约10^-6M或更高，例如10^-9M或更高的结合亲和性。分析物结合结构域可以是各种不同类型的分子中的任一种，只要它作为邻近探针的一部分存在时对靶分子表现出必需的结合亲和性。在其他实施方式中，分析物结合结构域可以是针对它的靶具有中等或甚至更低的亲和性(例如小于约10^-4M)的配体。

因此，邻近探针的分析物结合结构域可以是能够选择性地结合靶分子的任何分子。例如，结合结构域可以选自蛋白，如单克隆或多克隆抗体、凝集素、可溶性细胞表面受体、来自噬菌体展示或核糖体展示的组合衍生蛋白、肽；碳水化合物；核酸，如适配体或包括靶核酸的互补序列的核酸分子，或其组合。在本发明的优选实施方式中，分析物结合结构域是蛋白，优选地所述蛋白的抗体或衍生物或片段。

在另一个优选实施方式中，邻近探针的分析物结合结构域是核酸分子。邻近探针的分析物结合结构域可以由核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸，以及能够参与沃森-克里克类型的或类似的碱基对相互作用的合成的核苷酸残基构成。因此，核酸结构域可以是DNA和/或RNA或其任意修饰物，例如PNA，或者包含非核苷酸骨架的其他衍生物。

术语“检测(detecting)”在本文中宽泛地被用来包括确定分析物存在(即它是否存在)的任何工具，或者对分析物进行的任何形式的测定。因此，“检测”可以包括以任何方式确定、测定、评估或分析分析物的存在与否，或者分析物的量或位置。包括定量和定性确定、测定或评估，包括半定量。这样的确定、测定或评估可以是相对的，例如当检测分析物中的两种或更多种不同分析物时，或者绝对的。像这样，当使用在定量样品中的一种或多种靶分析物的情景中时，术语“定量”可以指绝对的或相对的定量。绝对定量可以通过包括一种或多种已知浓度的一种或更多种对照分析物，和/或参照靶分析物与已知对照分析物的检测水平(例如，通过标准曲线的产生)来完成。可选地，相对定量可以通过两种或更多种不同靶分析物之间的检测水平或量的比较，来提供对所述两种或更多种不同的分析物中的每个(即相对于彼此)的相对定量来完成。

“分析物”可以是期望通过本发明的方法来检测的任何物质(例如分子)或实体。分析物是本发明的试验方法的“靶(target)”。分析物因此可以是期望检测的任何生物分子或化学化合物，例如肽或蛋白，或者核酸分子或小分子，包括有机或无机分子。分析物因此可以是或者可以包括核酸分子，所述核酸分子可以是任何核酸，例如RNA或DNA或其任意修饰物。所包括的是仅由核酸组成的分子，或者包括核酸和另一种成分的嵌合分子或复合物。核酸可以是天然形式的，例如在样品中原位的，或者它可以是被分离的，或者合成的核酸分子，例如克隆分子或扩增子等。分析物可以是细胞或微生物，包括病毒，或其片段或产物。因此，将会看到，分析物可以是可以为它开发出特异性结合伴侣(例如，亲和结合伴侣)的任何物质或实体。所有这些都需要的是分析物能够同时结合至少两个结合伴侣(更具体地，至少两个邻近探针的分析物结合结构域)。基于邻近探针的试验，如本发明的那些试验，已经发现在蛋白或多肽的检测中具有特别的效用。特别感兴趣的分析物因此可以包括蛋白质分子如肽、多肽、蛋白或朊病毒，或者包括蛋白或多肽成分等的任何分子，或其片段。分析物可以是包含两个或更多个分子亚基的单个分子或复合物，例如包括但不被限制于蛋白-蛋白和蛋白-核酸(例如蛋白-DNA)复合物，所述两个或更多个分子亚基可以或者可以不共价结合彼此并且可以是相同或不同的。因此，除了细胞或微生物之外，这样的复合物分析物还可以是蛋白复合物或蛋白相互作用。这样的复合物或相互作用因此可以是同源或异源多聚体。分子(例如蛋白)聚集体也可以是靶分析物，例如相同蛋白或不同蛋白的聚集体。分析物还可以是蛋白或肽和核酸分子(如DNA或RNA)之间的复合物。特别感兴趣的可能是蛋白和核酸之间的相互作用，例如调节因子(如转录因子)和DNA或RNA之间的相互作用。在其他代表性实施方式中，分析物可以是核酸分子或其区域。因此，分析物可以是DNA(例如，基因组的、线粒体的)或RNA(例如，信使RNA、核糖体RNA、微小RNA等)。有利地，核酸可以在原位，即在不从细胞除去或者提取核酸的情况下检测。

所有的生物和临床样品都被包括在内，例如有机体的任何细胞或组织样品，或者来源于所述有机体的任何体液或制备品，以及如细胞培养物、细胞制备品、细胞裂解物等的样品。环境样品，例如土壤和水样品或食物样品也被包括在内。样品可以是新鲜制备的或者它们可以是以任何方便的方式(例如为了储存)提前处理的。

代表性的样品因此包括可以包含生物分子或者任何其他期望的或靶分析物的材料，包括例如食物和相关产品、临床和环境样品。样品可以是生物样品，所述生物样品可以包含任何病毒或细胞材料，包括所有的原核或真核细胞、病毒、噬菌体、支原体、原生质体和细胞器。这样的生物材料因此可以包括所有类型的哺乳类和非哺乳类动物细胞、植物细胞、包括蓝绿藻的藻类、真菌、细菌、原生动物等。代表性的样品因此包括全血和血源性产品(如血浆、血清和血沉棕黄层、血细胞)、尿、粪便、脑脊液或任何其他体液(例如，呼吸道分泌物、唾液、乳汁等)、组织、活体组织切片、细胞培养物、细胞悬液、条件培养基或细胞培养组分的其他样品等。为使用在本发明的方法中，样品可以以任何方便或期望的方式预处理来制备，例如通过细胞裂解或纯化、分析物的分离等。

分析物上用于组中的邻近探针的各自的分析物结合结构域的结合位点可以是相同或不同的。因此，例如在包括两个或三个相同亚基或蛋白组分的同源蛋白复合物或聚集体的情况下，两个或更多个探针的分析物结合结构域可以是相同的。在分析物是单个分子或者包括不同的亚基或组分(例如，异源复合物或不同蛋白的聚集体或不同分子之间的相互作用)的情况下，分析物结合结构域会是不同的。

因为邻近探针的核酸结构域的长度可以被构建以跨越不同的分子距离，分析物上用于分析物结合结构域的结合位点不需要在同一个分子上。它们可以在分开的、但是位置靠近的分子上。例如，有机体(如细菌或细胞或病毒)的或者蛋白复合物或相互作用的多个结合结构域可以通过本发明的方法被靶向。

用于使用在本发明的检测方法中的邻近探针包括分析物结合结构域和核酸结构域。邻近探针实际上是(经由分析物结合结构域)结合分析物的检测探针，通过检测在发生这样的结合时所述检测探针的核酸结构域之间发生的相互作用，所述检测探针的结合可以被检测到(以检测分析物)。核酸结构域被结合分析物结合结构域并且该“结合”或连接可以通过本领域已知的任何工具，并且所述“结合”或连接可以是期望或方便的并且可以是直接或非直接的，例如经由联接基团。在分析物结合结构域也是核酸的情况下，优选的是所述结构域通过核苷酸键(即磷酸二酯键)结合。蛋白可以被结合核酸的方式的实施例被详细描述在下文中。优选地，在邻近探针不只包括核酸的情况下，用来结合邻近探针的分析物结合结构域和核酸结构域的联接物或工具对于每个邻近探针是相同的。

在本发明的方法的优选的方面，至少一个邻近探针(进一步优选地至少两个邻近探针，或者优选地所有的邻近探针)的分析物结合结构域是蛋白质分子。因此，分析物结合结构域可以是小的肽分子或者较大的多肽或蛋白。肽可以例如大小范围为从约5至约100个氨基酸残基，通常为从约5至约50个残基，并且更通常地为从约10至约30个残基。通过大的多肽或蛋白，意为大小范围为从约100个氨基酸残基或更大的分子。如上文指出的，特别感兴趣的分析物结合结构域是抗体，及其结合片段和衍生物或模拟物。在抗体是分析物结合结构域的情况下，它们可以来源于多克隆组合物，从而在特异性上不同的抗体的异源群体每个被“标记”以相同的标记核酸(核酸结构域)或单克隆组合物，其中针对靶分析物具有相同的特异性的相同的抗体的异源群体每个被标记以相同的核酸。像这样，分析物结合结构域可以为或者单克隆抗体或者多克隆抗体。在再其他实施方式中，分析物结合结构域是它的抗体片段或衍生物或模拟物，其中这些片段、衍生物和模拟物具有必需的针对靶分析物的结合亲和性。抗体及其抗体片段、模拟物和衍生物的实施例被描述在上文中，并且本发明预期到亲和结合结构域可以是这些分子中的任何类型，只要它们具有必需的针对靶分析物的结合亲和性。

在本文中使用时，术语“抗体”可以意为所述抗体的抗体结合片段或衍生物或模拟物，其中这些片段、衍生物和模拟物具有针对靶分析物的结合亲和性。例如，抗体片段(如Fv、F(ab)₂和Fab)可以通过对完整蛋白的裂解来制备，例如通过蛋白酶或化学裂解法。同样感兴趣的是以重组或合成方式产生的抗体片段或衍生物，如单链抗体或scFvs，或者其他抗体衍生物如嵌合抗体或CDR移植抗体，其中这些以重组或合成方式产生的抗体片段保留上述抗体的结合特点，即它们能够特异性地结合靶分析物。这样的抗体片段或衍生物一般包括至少本发明的抗体的V_H和V_L结构域，以便保留本发明的抗体的结合特点。本发明的这些抗体片段、衍生物或模拟物可以使用任何方便的方法学容易地制备，如在美国专利Nos.5,851,829和5,965,371中公开的方法学；所述美国专利的公开通过引用并入本文。

上文描述的抗体及其片段、衍生物和模拟物可以由商业来源获得和/或使用任何方便的技术制备，其中生产多克隆抗体，单克隆抗体，所述抗体的片段、衍生物和模拟物(包括所述抗体的重组衍生物)的方法是本领域技术人员已知的。

在其他优选的实施方式中，如上文描述的，邻近探针中的一个或更多个(优选地两个或更多个或所有)的分析物结合结构域可以是核酸分子。

重要地，分析物结合结构域将是包括这样的部分的一个结构域，所述部分可以被共价地附着到核酸结构域，而不会实质上废除分析物结合结构域对它的靶分析物的结合亲和性。

在本发明的方法的一个实施方式中，邻近探针可以是多价邻近探针。这样的多价邻近探针包括与至少一个并且优选地多于一个核酸偶联的至少两个分析物结合结构域。因此，多价邻近探针可以包括与至少一个并且优选地多于一个核酸偶联的至少5、10、20、50、100、200、500或1000个分析物结合结构域

如上文描述的“结合”或连接可以通过本领域已知的任何工具，并且所述“结合”或连接可以是期望或方便的并且可以是直接或非直接的，例如经由联接基团。例如，结构域可以通过共价联接(例如化学交联)彼此缔合，或者通过非共价缔合，例如经由基于链霉亲和素-生物素的结合(生物素被提供在一个结构域上，而链霉亲和素被提供在另一个结构域上)。

邻近探针的两个成分可以或者通过键直接连接在一起，或者通过联接基团间接连接在一起。在采用联接基团的情况下，这样的基团可以被选择来提供结合结构域和核酸结构域通过联接基团的共价附着。感兴趣的联接基团可以取决于成分结构域的性质而有很大不同。当存在时，联接基团在许多实施方式中是生物学上惰性的。各种联接基团是本领域技术人员已知的，并且可应用于本发明的邻近探针中。在代表性实施方式中，联接基团一般为至少约50道尔顿，通常至少约100道尔顿，并且可以大至1000道尔顿或更大，例如如果联接基团包含间隔子则直至1000000道尔顿，但是一般不会超过约500道尔顿，并且通常不会超过约300道尔顿。一般，这样的联接物将包括在两个末端终止的间隔子基团，所述间隔子基团具有能够共价结合核酸结构域或蛋白成分的反应功能性。感兴趣的间隔子基团可以包括脂肪族和不饱和烃链、包含杂原子如氧(醚类如聚乙二醇)或氮(聚胺类)的间隔子、多肽、碳水化合物、有可能包含杂原子环或无环系统。间隔子基团还可以包括结合金属的配体，从而金属离子的存在协调两个或更多个配体以形成复合物。具体的间隔子元件包括：1,4-乙二胺、二甲苯二胺、对苯二甲酸、3,6-二氧杂辛二酸、乙二胺-N,N-乙酰乙酸、1,1'-亚乙基二(5-氧-3-吡咯啶甲酸)、4,4'-乙烯偶氮二甲酰二哌啶。潜在的反应功能性包括亲核的功能基团(胺类、醇类、硫醇类、酰肼类)、亲电子的功能基团(醛类、酯类、乙烯酮、环氧化合物、异氰酸酯、马来酰亚胺)、能够进行环加成反应、形成二硫键或结合金属的功能基团。具体的示例包括伯胺和仲胺、异羟肟酸、N-轻骑琥珀酰亚胺酯、N-羟基琥珀酰亚胺碳酸盐、氧羰基咪唑、硝基苯酯、三氟乙酯、环氧丙酯、乙烯砜，以及马来酰亚胺。可以应用于本发明的标志物中的具体的联接基团包括异功能化合物，如叠氮基苯甲酰酰肼、N-[4-(p-叠氮基水杨酰胺)丁基]-3'-[2'-吡啶二硫]丙酰胺),双-璜基琥珀酰亚胺辛二酸、二甲基亚胺酸酯、酒石酸二琥珀酰亚胺、N-马来酰亚胺基羧酸乙酯琥珀酰亚胺酯、N-羟基琥珀酰亚胺-4-叠氮苯甲酸盐、N-琥珀酰亚胺[4-叠氮苯基]-1,3'-二硫丙酸盐、N-琥珀酰亚胺[4-碘乙酰]氨基苯甲酸盐、戊二醛，以及琥珀酰亚胺-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸盐、3-(2-砒啶二硫)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)等等。本发明的方法中采用的邻近探针可以使用任何方便的方法来制备。在代表性实施方式中，分析物结合结构域和核酸结构域可以或者直接结合，或者通过联接基团结合。成分可以通过如本领域已知的功能基团被共价地结合彼此，其中这样的功能基团可以存在于成分上，或者使用一个或更多个步骤(例如氧化反应、还原反应、裂解反应等等)引入到成分中使用。可以被使用在将成分共价地结合在一起以生产邻近探针的功能基团包括：羟基、巯基、氨基等等。不同成分被修饰以提供共价联接的具体部分可以被选择，以便不会实质上不利地干扰成分与它的靶的结合亲和性。换言之，共价联接不应该抑制邻近探针的分析物结合结构域结合靶分析物，并且不应该鼓励核酸结构域结合靶分析物。当需要和/或期望时，成分上的某些部分可以使用封闭基团保护，如本领域已知的，参见例如Green&Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis(John Wiley&Sons)(1991)。用于生产核酸/抗体偶联的方法是本领域技术人员已知的。参见例如美国专利号5,733,523，所述美国专利的公开通过引用并入本文。

在其他实施方式中，邻近探针可以使用产生核酸-蛋白偶联(即具有被共价地结合蛋白的核酸(例如编码序列)的分子)的体外实验流程被引入，即分析物结合结构域或蛋白成分在体外由编码邻近探针的载体产生。这样的感兴趣的体外实验流程的示例包括：基于RepA的实验流程(参见例如，Fitzgerald,Drug Discov.Today(2000)5:253-258和WO 98/37186)，基于核糖体展示的实验流程(参见例如，Hanes等,Proc.Natl Acad.Sci.USA(1997)94:4937-42；Roberts,Curr Opin Chem Biol(1999)Jun；3:268-73；Schaffitzel等,JImmunol Methods(1999)Dec 10；231:119-35；以及WO 98/54312)等。

如上文指出的，分析物结合结构域可以直接或间接接合到分析物。在直接结合的情况下，靶分析物可以通过特异性结合伴侣(或亲和配体)首先被结合，而邻近探针的分析物结合结构域可以结合所述特异性结合伴侣。在这样的情况下，邻近探针可以被看作次级结合伴侣。这使得邻近探针作为通用试剂的设计成为可能。例如，分析物特异性结合伴侣可以是抗体，而通用的邻近探针组可以被用来通过结合各种不同的分析物特异性抗体的Fc区域而检测不同的分析物。

在具体实施方式中，基于核酸的间隔子(即寡核苷酸间隔子或间隔子序列)可以被用来为核酸结构域提供附加的长度和/或柔性。这在蛋白质分析物结合结构域(如抗体)情况下是特别有用的，并且尤其是当邻近探针被用作次级结合试剂(例如，次级抗体)时。这样的间隔子可以由根据选择或要求的一些核苷酸组成，并且一定会被选择或设计为不干扰核酸结构域中存在的其他结合位点(杂交区域/互补区域)或与之竞争。典型地，它会是同聚物序列，例如一段腺嘌呤(A)残基。长度可以取决于所使用的精确系统和序列(核酸结构域、分析物结合结构域等)，并且可以通过常规试验容易地确定。例如可以使用具有3至12(例如3至10、4至10、4至8，或4至6，例如5)个核苷酸的寡核苷酸序列(例如oligoA)。因此，例如，下文实施例中表2-5示出的用于邻近探针核酸结构域序列(邻近探针发夹)的序列被示出在它们的5’末端处具有附加的5个A残基。本发明的方法的HCR步骤可以如本领域已知和描述的进行，例如如US 7,721,721或本文引用的其他美国专利中的任一件中描述的。HCR单体可以与样品接触，例如被添加到样品。取决于试验设计，所述HCR单体可以与邻近探针一起(例如连同探针一起或者基本上同时)被添加到样品。可选地，所述HCR单体可以在探针结合步骤之后，例如在探针已被允许结合之后，任选地在未结合的探针已被洗掉之后，被添加。所述HCR单体可以在激活寡核苷酸(如果使用的话)之前、之后或者同时，或者类似地在其他允许条件引入之前、之后或期间，被添加。在一个代表性实施方式中，所述HCR单体可以在激活寡核苷酸已被添加并且允许孵育之后，并且任选地在随后的洗涤步骤之后，被添加。

HCR反应需要至少两个HCR单体，即至少两个种类的HCR单体。HCR单体包括亚稳定的二级结构，如上文限定和描述的。所述HCR单体一般还包括粘性末端。二级结构(例如茎环或发夹结构)保护用于不同(其他)的HCR单体(种类)中的相应的结合位点(或互补性区域)的结合位点(或它的互补性区域)。第一HCR单体(种类)包括HCR起始子区域的互补性区域，即“HCR起始子互补区域”。该区域位于HCR单体的可用区域(位点、位置或部分)，从而当第一HCR单体处于动力学上稳定的状态(即处于未折叠单体状态的单体)时，所述“HCR起始子互补区域”可以被HCR起始子结合。如上文指出的，HCR起始子互补区域一般位于HCR单体的粘性末端。这样的粘性末端因此可以被视为HCR单体的“输入”区域。HCR起始子的杂交导致它干扰二级结构，并且打开或解折叠所述二级结构，并且释放或者使得可用于结合所谓的“输出”区域，即包括用于另一个(例如第二个)HCR单体种类的结合位点的区域。该输出区域反过来与它相应的结合位点杂交，所述相应的结合位点(如第一HCR单体的)位于第二(或另外的)HCR单体的粘性末端。第二或其他HCR单体的粘性末端因此可以被视为类似于第一HCR单体的起始子互补区域，即作为输出区域。因此，当单体被打开时，一个(例如第一)HCR单体的输出区域(被保护或隔绝在处于它的动力学上稳定的状态的单体中)与另一个(例如第二)HCR单体的输入区域杂交(可进入处于它的动力学上稳定的状态的单体)。该第一(解折叠的)HCR单体随后干扰第二HCR单体的二级结构，导致所述第二HCR单体打开(解折叠)以释放它的输出区域。所述输出区域反过来与第一HCR单体种类中的另一个成员的输入区域杂交并且干扰它，打开它，并且因此HCR反应继续，直到所有的单体都被用尽。交替的HCR单体单元的这种杂交导致由单体单元构成的聚合物(即聚合反应)的积累。所得到的聚合物可以被检测。

另一个HCR单体的输出区域或结合位点(“HCR单体结合位点”)可以位于发夹的环和/或茎区域。一般，它位于环中或者至少包括环部分。在代表性实施方式中，结合位点部分位于单体发夹的环区域中并且部分位于所述单体发夹的茎区域中。类似地，HCR单体可以被这样设计，从而输入区域不仅包括粘性末端，而且部分位于茎区域中。因此，输入区域的一部分可以与输出区域的一部分互补。不同的HCR单体的茎区域可以是相同的。

对基本的HCR反应的修饰是可能的。可以使用多于两个(种类的)HCR单体，例如3、4、5或6个或更多个。这样的修饰可以被用来获得比线性扩增更多的，例如装配到支链结构中，导致二次式增长；或者装配到树枝状结构中，导致指数式扩增，如，例如US 7,721,721中所描述的。典型地，每个HCR单体包括与至少一个其他的HCR单体互补的至少一个区域。对于非线性扩增方案，典型地使用至少3个或者更优选地至少4个HCR单体。在这样的系统中，HCR单体可以包括两个或更多个环，例如发夹可以包括如上文描述的凸环和/或两个相连的发夹。可选地，为了获得比线性扩增更多的，HCR单体可以被提供有“标签”序列，所述“标签”序列在单体被解折叠时释放并且能够充当另一轮HCR的起始子。

在经典的HCR中，两个HCR单体的序列是完全彼此互补的，从而所得到的聚合物具有缺口结构。在这样的实施方式中，双链聚合物中的一条或两条链中的缺口可以例如使用连接酶连接。这可以有利于，例如，创建核酸聚合物，所述核酸聚合物被共价附着到第二邻近探针的HCR起始子，并且因此被牢固地附着或衔羁(tethered)到分析物。这可以用于例如局部或原位检测。它也可以有利于具有更刚性或稳定的HCR产品。这可以通过提供具有用于连接的5’磷酸基团的HCR单体中的一个或更多个而容易地实现。然而，HCR反应不被限制到产生缺口产物，并且通过对HCR单体的适当的设计，可以产生包含单链区域的HCR产物。例如，HCR单体可以被这样设计，从而它们彼此杂交，以在杂交的末端之间留下间隙而不是缺口。在这样的情况下，HCR单体可以包括，例如，作为环的一部分或者在环区域中的、不与另一个(例如第二个)HCR单体互补的序列。单链区域还可能使用修饰的HCR单体，例如包括被单链区域联接的两个发夹的HCR单体，被引入。这样的单链区域可以是，例如，长度为5-30，例如10-25、10-30、15-30、15-25nt。这可以允许另外的类型的探针(例如检测探针)结合所述单链区域(进一步参考下文)。

在HCR反应之后，HCR产物可以被进一步操纵，例如，通过如上文讨论的连接，或者通过合并(例如)使用HCR产物作为模板的聚合酶延伸反应(例如)以延伸跨越HCR产物中的单链间隙区域。HCR反应因此可以与其他信号产生或信号扩增步骤结合。一个可能性可能是通过将HCR的信号产生与滚环扩增(RCA)步骤结合。RCA是这样的步骤，所述步骤已知用于使用链置换聚合酶(例如，如phi29的聚合酶)来扩增圆形核酸模板分子，以产生包括模板环的多个互补副本的长的线状多联体产物。这样的RCA产物可以容易地被检测到，并且RCA最近几年已经形成一些基于核酸的检测技术的基础，包括在如下情况下使用邻近探针的技术：或者来自核酸结构域的核酸分子成环形，或者探针的一个或多个核酸结构域以添加的一个或多个寡核苷酸的环化为模板来形成RCA的环形模板。更一般地，成环形的寡核苷酸(例如探针)可以被用来产生RCA的环形模板，例如作为检测反应的一部分被环化(通过连接)的检测探针，例如锁式探针或分子倒置探针。因此在一个实施方式中，在HCR步骤之后，成环形的探针可以与所述方法组合使用。换言之，本发明的方法可以包括使用HCR聚合物产物实行RCA步骤的进一步的步骤。例如，成环形的探针可以与HCR产物杂交，更具体地包括单链区域的HCR产物。探针可以被设计为具有互补末端，所述互补末端与用于直接或间接彼此连接的并列的单链区域杂交。末端的连接导致可以被用作RCA反应的模板的环形分子的产生。如果末端邻近地彼此杂交，它们可以被直接连接。可选地，如果它们在具有介于中间的间隙的情况下杂交，在连接之前，间隙可以以间隙寡核苷酸或者被杂交的3’末端的间隙填充聚合酶延伸填充，在所述情况下，末端被间接彼此连接。可以检测RCA产物(例如使用与所述RCA产物的可杂交的检测探针杂交，或者通过将标记的核苷酸合并到RCA产物中，通过被合并到RCA产物中的标签/条形码序列等)。如上文指出的，通过对HCR单体的适当设计，单链区域可以被合并到HCR产物中。

如上文关于核酸结构域讨论的，HCR单体可以使用本领域已知的原理设计，例如，考虑到获得期望的亚稳定的二级结构(即具有处于平衡状态的稳定的二级结构)、杂交动力学、序列对称最简化等，选择适当的环大小、茎长度、茎C/G比率、粘性末端长度等。

除了获得用于二级结构的形成以及用于结合HCR起始子或另一个HCR单体的期望的杂交，HCR单体的序列并非关键。然而，序列应该被选择以避免除了所期望的那些杂交之外的杂交事件的发生。

环、茎和/或粘性末端的长度可以被调整以确保在特定反应条件下的动力学稳定性，并且调整HCR起始子存在时的聚合反应的速率。在一些实施方式中，环可以是与粘性末端相同长度的。在一些实施方式中，环比茎短，例如茎可以是环的两倍或三倍长。然而，在其他实施方式中，包括如在下文实施例中以举例形式说明的，可以使用例如在上文核酸情况下讨论的范围中的低得多的茎与环的比率。

通过代表性的例子，环可以为3至100nt，例如3至50、3至40、3至30、3至20、3-18、3-15，或3至12；或者更具体地从4、5、6、7或8中的任一个至20、18、15、13、14、13、12、11、10或9中的任一个。然而，在优选实施方式中，环长度至少为6nt，如长度为7、8、9、10或11nt。

通过代表性的例子，茎可以为从例如8至50nt，更具体地从9、10、11、12、15、18、19中20中的任一个至45、40、35、30、25、20或18中的任一个，例如8-20、8-18、9-20、9-18、10-20、10-18、12-18等。然而，在优选实施方式中，茎长度小于18bp，如长度为17、16或15bp。

因此通过代表性的例子，HCR单体的茎与环的比率可以优选地为从1.0至2.0，优选地1.2-1.8，或者更具体地1.4-1.7。这允许扩增速率以合理的速率进行，同时提供稳定的扩增产物。

邻近探针或HCR单体的核酸结构域可以由核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸以及能够参与沃森-克里克型或类似的碱基对相互作用的合成核苷酸残基构成。因此，核酸结构域和/或HCR单体可以是DNA或RNA或其任意修饰物，例如PNA，或者包含非核苷酸骨架的其他衍生物。HCR单体还可以包括核苷酸的化学修饰或其他非核苷酸化学基团。例如，类似于上文在邻近探针的核酸结构域的情况下所讨论的修饰，HCR单体可以包括二硫键或其他共价桥键，或者更具体地允许这样的键或桥键形成的基团。因此，HCR单体可以包括二硫键形成基团或部分，或者形成其他可裂解的共价键的其他基团或部分，这可以被用于形成使单体的二级结构稳定，并且可以裂解或破裂(即破坏)以破坏二级结构的稳定并且允许单体解折叠的键或桥键。

一旦核酸结构域和HCR单体的序列被选定或识别出，它们可以使用任何方便的方法来合成。

当在本文使用时，术语“杂交(hybridisation)”或“杂交(hybridises)”指双链体在充分互补以经由沃森-克里克碱基配对形成双链体的核苷酸序列之间的形成。当那些分子拥有相同的碱基对组织同源性时，两条核苷酸序列是“互补”于彼此的。因此，邻近探针的核酸结构域中的互补性区域指核酸结构域的能够形成分子内或分子间双链体的部分，即或者相同分子内的双链体(发夹结构)或者与不同分子的双链体。“互补的(complementary)”核苷酸序列将在适当的杂交条件下以特异性组合而形成稳定的双链体。例如，当第一条序列的一段可以以反义平行方式结合第二条序列的一段时，则两条序列是互补的，其中每条序列的3'末端结合另一条序列的5'末端，并且一条序列中的每个A、T(U)、G和C随后分别与另一条序列中的T(U)、A、C和G配对。RNA序列还可以包括互补的G＝U或U＝G碱基对。因此，在本发明下，两条序列不需要具有完美的同源性来成为“互补的”。通常当在限定的分子长度上，至少约85％(优选地至少约90％，并且最优选地至少约95％)的核苷酸拥有共同的碱基对组织时，两条序列就是充分互补的。互补性区域(即杂交区域)可以具有范围为4-30bp的长度，例如6-20、6-18、7-15或8-12bp。

为了实施本发明的方法，样品可以在与至少一组探针接触之前与封闭试剂接触，以减少非特异性的邻近探针相互作用。

在某些实施方式中，可以针对两种或更多种不同的靶分析物评估样品。在这样的实施方式中，针对每种靶分析物，样品与一组邻近探针接触，从而与样品接触的组的数量可以是两组或更多组，例如，三组或更多组、四组或更多组等(即可以使用多组邻近探针)。这样的方法可特别应用于多联体和高通量应用中。在这方面，本发明的方法对于样品中同源和异源两种形式的多种分析物的检测是特别有利的。在一些实施方式中，例如，对于高度可变的分析物(如病毒序列)的检测，针对相同的分析物(例如转录本)可以使用多个探针组，以最优化检测效率。在其他代表性实施方式中，分析物结合结构域可以被设计为包含对一些错配的耐受性，例如在分析物结合结构域和分析物都是核酸的情况下，序列不需要是100％互补的，例如序列可以拥有至少85、90后95％的序列同一性。每个不同的探针组可以与它自己的HCR单体组一起使用，这可以被设计以导致可区分的聚合物的形成(例如，单体可以是(例如)用可区分的标记不同标记的，或者可以被设计为具有不同的可检测的序列，例如可以结合可区分的检测探针的标签序列等)。

被添加到样品的邻近探针的量可以被选择以在反应混合物中提供足够低的浓度的邻近探针，以确保在不存在到靶分析物的结合时，邻近探针将不会随便地与彼此极为邻近，至少不会到任何较大或实质性的程度。像这样，期望的是仅在邻近探针通过邻近探针的分析物结合结构域和分析物的结合位点之间的结合相互作用结合分析物时，邻近探针才会与彼此极为接近(即，在邻近探针同时结合分析物时)。在代表性实施方式中，在与样品组合之后，邻近探针在反应混合物中的浓度范围为从约1fM至1μM，如从约1pM至约1nM，包括从约1pM至约100nM。

在样品与一组或多组邻近探针组合之后，反应混合物可以被孵育达足够使邻近探针结合样品中的靶分析物(如果存在的话)的一段时间。一旦邻近探针已结合分析物，可以引入许可条件，如上文讨论的，例如通过添加激活寡核苷酸或与之接触。该步骤可以包括孵育步骤。这允许核酸结构域相互作用，以释放HCR起始子。如上文讨论的，HCR单体随后可以被添加以起始HCR反应，或者它们可以在较早阶段被添加，例如在存在允许条件的情况下(例如，具有激活寡核苷酸)。在一些实施方式中，可以存在使样品与主要结合伴侣(中间分子)接触，并且随后与邻近探针接触的初始的第一步骤。可选地，主要结合伴侣和邻近探针可以与样品一起接触。在一些代表性实施方式中，例如原位试验或其中分析物被固定的其他试验，可以在各种接触步骤/添加之间包括洗涤步骤，例如在与主要结合伴侣、邻近探针、激活寡核苷酸(或其他允许条件)等接触的步骤中的一个或更多个之后。以该方式，未结合或非特异性结合的探针或激活寡核苷酸等可以被除去或分离。

在代表性实施方式中，邻近探针和样品可以在范围为从4至约50℃(例如在室温下(例如18-30℃)或者在37℃)的温度下被孵育达范围为从5分钟至约24小时(例如从约20分钟至12小时)的一段时间。反应混合物所维持的条件应该被最优化，以促进邻近探针到分析物的特异性结合，同时抑制非特异性结合。

在引入允许条件之后，反应混合物可以在范围为从约4至约50℃(包括从约20至约37℃)的温度下被孵育达范围为从约5分钟至约48小时(包括从约20或30分钟至约12小时)的一段时间。条件应该允许核酸结构域之间有效的和特异性的相互作用(例如杂交)，如上文描述的。

在某些实施方式中，孵育混合物的有效体积被减少，至少在孵育步骤中邻近探针正被结合样品中的靶分析物(如果存在的话)的那段时间。在这些实施方式中，孵育混合物的有效体积因为一些不同的理由被减少。在某些实施方式中，孵育混合物的有效体积被减少，以便允许培养基和低亲和性分析物结合结构域的使用和/或增加试验的灵敏性。例如，在孵育混合物的体积被减少的某些实施方式中，分析物结合结构域可以是培养基或低亲和性结合物，通过所述低亲和性结合物，意为分析物结合结构域可以针对它们的靶分析物具有小于约10^-4M(如约1mM>d)的亲和性。在某些实施方式中，试验的灵敏性可以被提高，从而试验可以检测少至在1μl的样品中只有约100或更少的靶分析物，包括少至在1μl的样品中只有约75或更少的靶分析物，包括少至在1μl的样品中只有约50或更少的靶分析物。

在某些实施方式中，“拥挤试剂(crowding agent)”或“体积封隔剂(volumeexcluder)”在上文评述过的孵育步骤期间被包括在混合物中，例如，以在邻近探针结合它们的靶分析物期间减少孵育混合物的有效体积。典型地，“拥挤试剂”是水溶性大分子材料。适合的大分子材料宽泛地包括具有从约1500至几百万的平均分子量的生物相容的天然或合成聚合物，所述天然或合成聚合物不会与混合物中的其他试剂或产物特异性地相互作用。这样的聚合物在本领域已知为“体积封隔剂”，因为它们的主要功能是在体外反应介质中占据体积并且为生物化学反应提供高浓度的环境，例如接近体内的条件。体积封隔聚合物必须一定是足够可溶的，以提供需要的浓度。适合的示例性聚合物包括，但是不被限制于：可商购的聚乙二醇(PEG)聚合物，例如，具有大于约2000的平均分子量的那些；FICOLL聚合物，如具有约70,000的平均分子量的那些；牛血浆白蛋白；糖原；聚乙烯吡咯烷酮；右旋糖酐等。在代表性实施方式中可以采用具有较高分子量的PEG聚合物，尤其是分别具有约1450、3000-3700、6000-7500和15,000-20,000的平均分子量的PEG 1450、PEG 3350、PEG6000(也作为PEG 8000出售)和PEG20,000。在代表性实施方式中，取决于聚合物的类型及其分子量，孵育反应中的体积封隔聚合物的浓度落在约5％w/v至约45％w/v的范围内。一般，期望的是，具有较高的分子量的给定类型的聚合物需要以比具有较低分子量的相同类型的聚合物更低的浓度存在，以在酶活性上获得相同的效果。

在采用体积封隔剂的那些实施方式中，取决于存在的体积封隔剂的量、稀释流体的性质等，在所述方法的下一步骤之前，孵育混合物可以被稀释以解释体积封隔剂例如以至少约2倍或更多，如至少约5倍或更多，包括至少约10倍或更多存在，其中在代表性实施方式中，稀释流体是水或一些其他适合的具有水和一种或更多种溶质(例如，盐、缓冲剂等)的水性流体。

代替体积封隔剂的使用或者在这之外，在孵育期间通过(例如)经由蒸发从孵育混合物除去一部分的水，可以减少孵育混合物的体积。在这些实施方式中，流体的体积可以按照期望被减少至少约2倍或更多，如至少约5倍或更多，包括至少约10倍或更多。重要地，在这些实施方式中，并非所有的水都被从孵育混合物除去。为了通过从所述孵育混合物除去选定部分的水来减少孵育混合物的体积，可以采用任何方便的实验流程。可以采用用于通过监控和调节湿度和温度来控制蒸发的仪器，其中在一些实施方式中，通过持续不断地测定孵育混合物的体积来监控孵育混合物的体积，其中当被适当地蒸发时，可以添加另外的试剂(例如，HCR单体)，如上文所描述的。如期望的，加热块可以被用来增强蒸发。可选地，可以通过过滤出水来减少孵育混合物的体积。在代表性实施方式中，尺寸排阻过滤器被用来选择性地包含具有大于阻隔极限的尺寸的分子，而较小的分子和水通过穿过过滤器的通道被除去。可以通过或者离心或者真空抽吸施加力到溶液以使所述溶液移动穿过过滤器。

当邻近探针的分析物结合结构域结合分析物时，邻近探针的核酸结构域紧密邻近于彼此。然而，直至已引入允许条件，核酸结构域将才能够相互作用。

结构域的相互作用释放HCR起始子，并且随后可以允许HCR反应进行。这可以根据本领域熟知和文献中描述的步骤和条件来进行。

HCR反应产物(即聚合物)的产生随后可以被检测到，以便检测靶分析物在正被评估的样品中的存在。

从最广义上来说，HCR产物可以使用任何方便的实验流程来检测。具体的检测实验流程可以取决于所期望的灵敏度以及实践本方法的应用而不同。所得到的聚合物HCR产物可以以一些不同的方式来检测。可以使用已知用于核酸检测的任何方法，例如基于尺寸离析的，例如各种形式的电泳、核酸染色技术、光散射光谱(如动态光散射(DLS))、粘度测定、通过(例如)基于对比色或荧光标记等的检测的表面等离子体共振和分光光度法确定的质量变化。在这方面，HCR聚合物可以通过将标记合并到所述HCR聚合物中而被直接标记，或者所述HCR聚合物可以(例如)通过将标记的检测探针杂交或以其他方式结合所述HCR聚合物而被间接标记。例如，检测探针可以被设计以与存在于一个或更多个HCR单体中的特定序列(例如标签序列)杂交。例如，两个HCR单体都可以被标记。在可选的实施方式中，一个单体可以被标记，而第二个单体可以被提供有5’磷酸基团，从而它可以被连接。

便利地，HCR单体中的一个或更多个可以被直接标记，例如，以荧光方式，或者在其他方面以分光光度法；或者以放射性同位素标记或者使用任何给出信号的标记，从而聚合物产物被直接标记。可选地，HCR单体可以被标记，类似于构象上选择性的探针如分子信标，从而当单体处于单体形式时，信号(例如荧光)淬灭，但是在单体解折叠(即当与聚合物杂交时)时可检测。因此，例如HCR单体可以在茎的一个末端标记有淬灭剂分子，而在双链区域的相对侧标记有荧光团，从而当茎结构存在于单体中时，荧光信号淬灭。当聚合后，荧光团和淬灭剂在聚合物中在空间上是分开的，从而淬灭被解除时，以允许荧光信号被检测到。因此，HCR单体可以以构象上可选择的方式来标记。在可选的实施方式中，针对能量转移反应的受体和供体分子可以被提供在不同的单体上，这在解折叠和彼此杂交时允许形成FRET对，并且因此产生信号。再以进一步的形式，受体和供体分子可以如(例如)LOCI(US 5,340,716、US 6,346,384)中描述的或者如US 8198031中描述的那样来提供，并且检测裂解的部分。HCR因此可以相应地被监控，或者HCR产物的存在可以通过能量转移反应(如FRET)来确定。

可以使用各种染料或染色剂来选择性地检测双链DNA产物，例如经由相互作用。代表性的可检测的分子包括当与核酸复合时给出增强荧光的荧光核酸染色剂，如菲啶染料，包括单体或其同源或异源二聚体。菲啶染料的示例包括乙啡啶、溴化乙锭、碘化丙啶，以及其他烷基被替换的菲啶染料。可选地，核酸染色是或者合并吖啶染料或其同源或异源二聚体，如吖啶橙、吖啶同源二聚体、乙啡啶-吖啶异源二聚体，或9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶；或者吲哚或咪唑染料，如Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580(BIOPROBES 34,Molecular Probes,Inc.Eugene,Oreg.,(2000年5月))、DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)或DIPI(4',6-(二咪唑啉-2-基)-2-苯基吲哚)。其他允许的核酸染色剂包括，但是不被限制于，7-氨基放线菌素D、羟芪巴脒、LDS 751、精选的补骨脂素(呋喃香豆素)、苯乙烯基染料、金属络合物如钌络合物，以及过渡金属络合物(例如，合并Tb³⁺和Eu³⁺)。核酸染料还可以是花青染料，或者当与核酸缔合时给出增强荧光的花青染料的同源或异源二聚体。可以使用授权给Lee的美国专利号4,883,867(1989)、授权给Yue等的美国专利号5,582,977(1996)、授权给Yue等的美国专利号5,321,130(1994)以及授权给Yue等的美国专利号5,410,030(1995)(所有四件专利均通过引用被并入)所描述的染料中的任一种，包括可商购的来自Molecular>

根据其中信号产生系统对于聚合物产物是特异性的实施方式，与双链分子截然相反，一般信号产生系统可以，如上文指出的，包括特异性地结合聚合物产物中存在的序列的检测探针(例如，检测寡核苷酸)，其中探针核酸可以被标记有可直接或间接检测的标记，或者HCR单体本身可以被提供有这样的标记。可直接检测的标记是可以在不使用附加试剂的情况下被直接检测到的一种标记，而可间接检测的标记是通过采用一种或更多种附加试剂可检测的一种标记，例如，其中标记是由两个或更多个组分构成的信号产生系统中的成员。在许多实施方式中，标记是可直接检测的标记，其中感兴趣的可直接检测的标记包括，但不被限制于：荧光标记、放射性同位素标记、化学发光标记等。在许多实施方式中，标记是荧光标记，其中在这样的实施方式中所采用的标记试剂是一个或多个加荧光标签的核苷酸，例如加荧光标签的CTP(如Cy3-CTP、Cy5-CTP)等。可以被用来为核苷酸加标签以用于产生标记的探针核酸分子的荧光部分包括，但不被限制于：荧光素、花青染料，如Cy3、Cy5、Alexa555、Bodipy 630/650等。如本领域已知的，也可以采用其他标记，如上文所描述的那些。

在某些实施方式中，如上文还提到的，HCR单体可以被标记有“能量转移”标记。当在本文使用时，“能量转移”指荧光基团的荧光发射被荧光修饰基团改变的过程。如果荧光修饰基团是淬灭基团，那么来自荧光基团的荧光发射衰减(淬灭)。能量转移可以通过荧光共振能量转移或者通过直接能量转移来发生。在这两个情况下确切的能量转移机制是不同的。要理解的是，在所有即时应用中对于能量转移的任何参考都包含这些机械上独特的现象中的全部。当在本文使用时，“能量转移对”指参与能量转移的任何两个分子。典型地，所述分子中的一个充当荧光基团，而另一个充当荧光修饰基团。“能量转移对”被用来指形成单个复合物的分子的基团，在所述单个复合物内发生能量转移。这样的复合物可以包括，例如，可以彼此不同的两个荧光基团和一个淬灭基团，两个淬灭基团和一个荧光基团，或者多个荧光基团和多个淬灭接团。非荧光基团也可以被用作受体或供体，例如，非荧光淬灭基团包括核苷酸例如鸟嘌呤碱基(例如，参见Marras等,2002,Nucleic Acids Research,30(21),e122.)。在存在多个荧光基团和/或多个淬灭基团的情况下，各个基团可以彼此不同。当在本文使用时，“荧光共振能量转移”或“FRET”指其中由被激发的荧光基团发射的光被荧光修饰基团至少部分地吸收的能量转移现象。如果荧光修饰基团是淬灭基团，那么该基团可以或者将所吸收的光辐射为不同波长的光，或者它可以使所述所吸收的光消散为热量。FRET依赖于荧光基团的发射光谱和淬灭基团的吸收光谱之间的重叠。FRET还依赖于淬灭基团和荧光基团之间的距离。在某些临界距离之上，淬灭基团不能够吸收由荧光基团发射的光，或者仅可以较差地这么做。当在本文使用时，“直接能量转移”指其中在荧光基团和荧光修饰基团之间不存在质子通道的能量转移机制。在没有被单个机制绑定的情况下，人们认为在直接能量转移中，荧光基团和荧光修饰基团干扰彼此的电子结构。如果荧光修饰基团是淬灭基团，这会在淬灭基团中导致甚至阻止荧光基团发射光。

作为标记HCR单体的替换方案，可以使用能量转移标记的检测探针，例如寡核苷酸。这样标记的寡核苷酸探针的具体示例包括类型的探针，如在美国专利号6,248,526中描述的，所述美国专利的公开通过引用并入本文(以及Held等,Genome Res.(1996)6:986-994；Holland等,Proc.Natl Acad.Sci.USA(1991)88:7276-7280；以及Lee等,Nuc.Acids Res.(1993)21:3761-3766)。其他类型的探针结构包括：Scorpion探针(如在Whitcombe等,Nature Biotechnology(1999)17:804-807；美国专利号6,326,145中描述的，所述参考文献的公开均通过引用并入本文)、Sunrise探针(如在Nazarenko等,Nuc.AcidsRes.(1997)25:2516-2521；美国专利号6,117,635中描述的，所述参考文献的公开均通过引用并入本文)、分子信标(Tyagi等,Nature Biotechnology(1996)14:303-308；美国专利号5,989,823中描述的，所述参考文献的公开均通过引用并入本文)。

在本发明的方法中下一步骤为来自感兴趣的标记的聚合物产物的信号检测，其中取决于所采用的具体信号产生系统，信号检测可以不同。在某些实施方式中，在本发明的试验中仅确定和使用可检测的信号(例如，荧光)的存在与否，例如，以经由对拟靶核酸和/或其扩增产物的检测来确定或识别靶核酸的存在与否。取决于所采用的特定标记，对信号的检测可以指示靶核酸的存在与否。

在信号产生系统为荧光信号产生系统的那些实施方式中，信号检测典型地包括检测来自反应混合物的荧光信号的变化，以获得试验结果。换言之，评估由反应混合物产生的荧光信号中的任何调节。取决于所采用的标记的性质，所述变化可以是荧光的增加或减少，但是在某些实施方式中是荧光增加。可以使用任何方便的工具针对荧光增加对样品进行筛选，例如，适合的荧光剂，如热稳定吸收池或分析仪型荧光计，或者在样品是显微镜载玻片上的组织样品的情况下，可以使用荧光显微镜来检测荧光。使用已知的荧光计适当地监控荧光。来自这些器件的信号，例如以光电倍增电压形式的信号，被发送到数据处理器主板并且转变为与每个样品管相关联的光谱。可以同时评估多个管，例如96个管。因此，在一些实施方式中，可以平行检测多种分析物，而在其他实施方式中，可以按顺序检测多种分析物，例如一次一个分析物或者一次一组分析物。

在检测实验流程是实时实验流程的情况下，数据可以在整个反应中以该方式频繁地收集，例如每3分钟一次。通过监控来自样品的反应性分子的荧光，聚合反应的过程可以以各种方式监控。

以该方式产生的光谱可以，例如，使用预先选定的荧光部分(如染料)的“拟合(fits)”来分辨，以形成代表每个信号部分(即荧光团)的峰。峰下的面积可以被确定，所述面积代表每个信号的强度值，并且如果需要的话，被表示为彼此的商。

如上文描述的所产生的数据可以以各种方式解释。例如，简单地可以通过检测聚合物来确定分析物的存在与否。然而，因为HCR产物的大小反比例相关于样品中靶分析物的量，所以定量测定是可能的。因此，可以确定分析物的浓度。这可以通过确定HCR聚合物产物的平均分子量来方便地完成。可以使用标准曲线和对照样品。

以该方式，可以针对一种或多种靶分析物的存在容易地筛选(或评估或分析等)反应混合物。所述方法适合于单种靶分析物以及多种靶分析物的检测，在所述多个靶分析物中在样品中评估两种或更多种靶分析物。在后者这些多元情况下，可以采用的不同组的探针的数目典型地范围为从约2至约20或更高，例如直至100或更高，1000或更高等，其中样品中的多种分析物可以同时或按顺序来检测。

在用具有低亲和性和缓慢结合动力学的邻近探针检测分析物的情况下，邻近探针可以与样品接触并且在足够高的浓度下孵育以促进邻近探针结合分析物。该孵育步骤可以被快速稀释于较大体积的冷的缓冲液(例如，不包括分析物或邻近探针的缓冲液)中，并且该稀释液的一部分随后被使用在该方法的另外的步骤中。

与复杂样品相关联的问题可以进一步通过在分析之前稀释所述复杂样品来解决。

本发明的方法可以如上文描述的同样地采用(即在溶液中)，或者可选地不同地，使用固相，例如其中分析物被固定在固相上，允许洗涤步骤的使用。固相试验的使用提供如下优点，特别是对于不同样品的检测：洗涤步骤可以帮助抑制组分的除去，并且分析物可以从不符合期望的大样品体积浓缩。可以使用较高的浓度和较大量的邻近探针，因为未结合的分析物和探针可以通过洗涤而被除去。通过洗涤除去未结合的探针或者没有相互作用的探针的能力还意为与均相试验比较，固相试验能容许更低纯度的邻近探针。

分析物在固相上的固定可以以各种方式实现。因此，固相邻近探针试验的几个实施方式在预期内。在一个这样的实施方式中，第一或第二邻近探针中的一个(或更多个)可以被(或者可能能够被)固定在固相(或固体支持物)上。分析物首先可以被一个(或更多个)被固定(或可固定的)探针捕获，并且其次被随后添加的一种或多种探针结合。可选地，分析物首先可以被固定的捕获探针捕获，并且随后与邻近探针接触。进一步可选地，分析物可以通过其他工具被固定，例如样品可以固定在固体支持物(如载玻片)上。这特别适用于原位检测程序。

被固定的邻近探针或捕获探针可以以任何方便的方式被固定，即结合支持物。因此固定的方式或工具以及固体支持物可以根据选择从任意数目的固定工具和固体支持物中选定，如本领域众所周知并且参考文献中所描述的。因此，探针可以被直接结合支持物，例如经由分析物结合结构域(例如化学交联的)，它可以借助于衔接物基团或者通过一个或多个中间结合基团(例如借助于生物素-链霉亲和素相互作用)而被间接结合。因此，可以出于用于被提供在支持物上的固定(例如，能够结合它的结合伴侣(即，相应的结合伴侣，例如链霉亲和素或抗体或核酸分子)的亲和结合伴侣，例如生物素或半抗原或核酸分子)的意图来提供邻近探针或捕获探针。探针可以在结合分析物之前或之后被固定。进一步，这样的“可固定的”探针可以与样品以及与支持物一起接触。

固体支持物可以是目前广泛使用于或被提议用于固定、分离等的熟知的支持物或基质中的任何一种。这些固体支持物可以采取颗粒(例如，可以为磁性或非磁性的珠)、片材、凝胶、过滤器、膜、纤维、毛细管，或者微滴定带、管、盘或孔等的形式。

支持物可以由玻璃、二氧化硅、乳胶或聚合材料制成。适合的是呈现用于分析物结合的高比表面积的材料。这样的支持物可以具有不规则表面，并且可以为例如多孔的或粒状的，例如颗粒、纤维、网状物、烧结物或筛。粒状材料(例如珠)由于它们较高的结合能力而是有用的，特别是聚合珠。

便利地，根据本发明所使用的粒状固体支持物将包括球形珠。珠的尺寸不是关键，但是它们可以例如为达到至少1μm和优选地至少2μm的直径的程度，并且具有优选地不超过10μm，并且例如不超过6μm的最大直径。

尺寸基本均匀(例如，具有小于5％的标准偏差的直径的尺寸)的那些单分散颗粒的优点在于：它们能提供非常均匀的反应再现性。代表性的单分散聚合物颗粒可以通过US-A-4336173中描述的技术来产生。

然而，为了帮助操纵和分离，磁性珠是有利的。当在本文使用时，术语“磁性的”意为支持物能够具有在被放置在磁场中时被赋予它的磁矩，即为顺磁性的，并且因此在该磁场的作用下为可替换的。换言之，包括磁性颗粒的支持物可以通过磁聚集容易地被除去，所述磁聚集可以在分析物结合步骤之后提供分离颗粒的快速、简单和有效的方式。

如上文指出的，在一个实施方式中，分析物首先被仅用来将分析物固定在固相上的固定的或可固定的捕获探针捕获，并且随后被固定的分析物与邻近探针一起孵育。在这样的实施方式中，捕获探针可以是能够直接或间接结合分析物的任何结合伴侣(例如，如上文关于邻近探针的分析物结合结构域所讨论的)。更具体地，这样的捕获探针特异性地结合分析物。因为所述方法的该实施方式需要至少三个探针(结合结构域)同时结合分析物或分析物复合物，潜在地至少涉及三个不同的表位，从而赋予试验高特异性。

在进一步的实施方式中，分析物本身可以例如通过非特异性吸收而被固定(或可固定)在固相上。在具体的这样的实施方式中，分析物可以存在于(能够)被附着到固体支持物的细胞内，为任选地固定和/或预先固定的，例如包括分析物的组织样品可以被固定在显微镜载玻片上。

上文描述的方法导致对存在于反应混合物中的邻近依赖型相互作用的检测，所述检测反过来提供对于所分析的样品中的靶分析物的量的测定。所述测定可以是定性的或定量的。

因此，上文描述的检测样品中一种或更多种靶分析物的存在的方法可应用于各种不同的应用中。

本发明的方法可以被用来针对样品中一种或更多种靶分析物的存在与否来筛选样品。如上文指示的，本发明提供检测样品中一种或更多种靶分析物的量的存在或定量的方法。

本发明的方法可以被采用来检测各种不同类型的样品(包括具有大量非靶实体的复合物样品)中一种或更多种靶分析物的存在。本发明的方法是检测样品或复合物样品中一种或更多种靶分析物的高灵敏度的方法。在本发明的方法中分析的样品为，在许多实施方式中，来自生理学来源的，如上文中更详细地讨论的。

除了检测各种各样的分析物，本发明的方法还可以被用来筛选调节邻近探针的分析物结合结构域与分析物的结合区域之间(即分析物结合结构域到分析物的结合)的相互作用的化合物。术语调节包括减弱(例如，抑制)和增强两个分子之间的相互作用。

如上文指出的，本发明的方法特别适用于蛋白和蛋白的相互作用的检测，例如，在蛋白质组学研究中。因为它们可以以无酶形式来提供，它们对于临床或诊断应用是特别有用的，特别是对于护理点的用途。对于这样的用途，试剂盒可以方便地被提供用于实践本发明的方法。

因此，在进一步的方面，本发明还提供如前文所限定的用于使用在本发明的方法中的试剂盒。例如，在一些实施方式中，试剂盒将包括至少一组第一和第二邻近探针，如上文描述的，连同用于进行HCR反应的至少一组HCR单体。这样的试剂盒可以包括另外的组分，例如激活寡核苷酸，或者用于引入允许条件的其他工具，和/或其他反应试剂。这样的附加组分或试剂包括，但是不被限制于以下中的一种或更多种：用于引入允许条件的工具(例如，激活寡核苷酸，或者酶或酶的组合，所述酶如RNAase、切口酶或尿嘧啶-DNA糖基化酶)、用于固定的固体支持物、用于固定的工具、捕获探针、检测工具例如当聚合时检测标记的HCR单体所需要的检测探针或试剂、缓冲液、阳离子等，诸如此类。在某些实施方式中，试剂盒可以包括在减少孵育混合物的有效体积时采用的组成部分，如上文评述的，例如体积封隔剂。试剂盒组分可以存在于单独的容器中，或者组分中的一种或更多种可以存在于相同容器中，其中容器可以是储存容器和/或在试剂盒被设计用于的试验期间所采用的容器。

除了上文组分，试剂盒可以进一步包括用于实践所述方法的说明书。这些说明书可以以各种形式存在于本发明试剂盒中，所述各种形式中的一种或更多种可以存在于试剂盒中。其中这些说明书可能存在的一种形式是适合的介质或底物上的打印信息，例如，其上印有信息的一张或多张纸，所述适合的介质或底物在试剂盒的包装上，在包装说明书中等。再另一种工具是计算机可读的介质，例如，磁盘、CD等，其上已经记录有信息。可能存在的再另一种工具是可以用来经由互联网访问已删除网站的信息的网站地址。任何方便的工具都可以存在于试剂盒中。

因此，在本发明的进一步的方面，提供用于使用在用于检测样品中的分析物的方法中的试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)包括至少第一和第二邻近探针的至少一组邻近探针，所述探针每个包括能够同时直接或间接结合所述分析物的分析物结合结构域和核酸结构域，其中

(i)所述第一和第二邻近探针的所述核酸结构域包括能够在允许条件下介导涉及所述结构域的相互作用的区域；并且

(ii)所述第一和第二探针中的一个的所述核酸结构域包括HCR起始子区域，所述HCR起始子区域包括在亚稳定的二级结构内，从而在从所述亚稳定的二级结构释放之前，所述HCR起始子区域不能起始HCR反应；

(b)任选地，用于引入允许条件以当所述探针两者均已直接或间接结合所述分析物时，允许所述第一和第二探针的所述核酸结构域彼此相互作用的工具，其中所述相互作用使得所述第二探针的所述核酸结构域的所述亚稳定的二级结构解折叠，以释放单链HCR起始子区域；

(c)用于进行HCR反应的工具，所述工具包括至少两个HCR单体，其中所述第一HCR单体包括所述HCR起始子区域的互补性区域；以及

(d)任选地，用于检测所述聚合物的工具。

在更具体的实施方式中，在(a)中，第一探针的核酸结构域包括所述第二探针的所述核酸结构域中的关联第二互补性区域的第一互补性区域，并且保护所述第一互补性区域，从而所述第一和第二互补区域不能够彼此杂交；并且其中在步骤(b)中，用于引入允许条件的所述工具包括用于使所述第一互补性区域脱保护以当所述探针两者均已直接或间接结合所述分析物时，允许所述第一和第二探针的所述核酸结构域的所述第一和第二互补区域彼此杂交的工具，其中所述杂交使得所述第二探针的所述核酸结构域的所述亚稳定的二级结构解折叠，以释放单链HCR起始子区域。优选地，所述脱保护工具是激活寡核苷酸。

试剂盒可以进一步任选地包括用于分析物的被固定的捕获探针，或者被提供有用于固定的工具的捕获探针。可选地，试剂盒可以包括用于分析物的捕获或者结合所述分析物的固相，或者所述第一和第二邻近探针中的一个或更多个可以以用于固定的工具被固定或被提供有所述工具。

同样作为本发明的一部分提供的还有包括至少第一和第二邻近探针的一组邻近探针，所述探针每个包括能够同时直接或间接结合要被检测的分析物的分析物结合结构域，和核酸结构域，其中

(i)所述第一和第二邻近探针的所述核酸结构域包括能够在允许条件下介导涉及所述结构域的相互作用的区域；并且

(ii)所述第一和第二探针中的一个的所述核酸结构域包括HCR起始子区域，所述HCR起始子区域包括在亚稳定的二级结构内，从而在从所述亚稳定的二级结构释放之前，所述HCR起始子区域不能起始HCR反应。

在优选实施方式中，两个邻近探针的核酸结构域均包含亚稳定的二级结构，如上文讨论的，并且具体地两个邻近探针均包括包含(或具有)发夹结构的核酸结构域。

在本发明的再进一步的方面，还提供一种能够直接或间接结合要被检测的分析物并且具有被附着至所述分析物的核酸结构域的抗体，其中所述核酸结构域包括能够与另一个核酸分子相互作用(例如，杂交)的区域，并且所述相互作用区域被包含在所述结构域的亚稳定的二级结构内，所述结构能够被解折叠以释放所述相互作用区域，所述解折叠不由所述核酸结构域的裂解介导。

因此，在本发明的该方面，核酸结构域被核酸结构域的二级结构中的构象改变解折叠，所述构象改变导致相互作用结构域的释放。更具体地，在所述核酸结构域中没有磷酸二酯键的裂解，即没有结构域本身被裂解的情况下，二级结构本身被释放或解折叠。

抗体为优选地邻近探针，并且相互作用区域将优选地为能够与另一个邻近探针的核酸结构域中的关联互补区域杂交的互补区域。

在可选的实施方式中，相互作用区域包括HCR起始子(或可选地被表示为，相互作用区域包括能够充当HCR反应的起始子的序列，或者所述相互作用区域为HCR起始子区域)。

附图说明

本发明将参考以下非限制性实施例并且参考附图进一步描述，在所述附图中：

图1示出为prox-HCR的基础的原理。在该实施方式中，第一探针的第一互补区域被亚稳定的发夹结构保护，并且第一和第二探针不能够相互作用。在添加激活寡核苷酸时，第一探针解折叠，所述激活寡核苷酸包含与第一探针的核酸结构域中的关联互补性区域互补的互补性区域。解折叠的结构域与第二探针的核酸结构域中的互补性区域相互作用并且暴露HCR起始子序列，所述HCR起始子序列随后起始HCR。

图2示出用生物素化的邻近发夹在链霉亲和素涂覆的珠上进行的原理证明实验。这表明HCR可以使用5nM的HCR寡核苷酸进行，并且表明在室温下和在37℃下添加激活寡核苷酸对于HCR进行是必要的。

图3示出如图2中相同的实验程序，但是以50nM的HCR寡核苷酸进行。

图4示出在图2和3中的每个时间点中计算的信噪比。

图5示出使用图2的反应条件时，prox-HCR产物随着时间的稳定性。图5A示出直至添加HCR寡核苷酸之后24小时，荧光信号仍是可检测的，并且(+)样品的荧光信号高于(-)样品的荧光信号。图5B示出在2、5和24小时后(+)和(-)样品的荧光强度。

图6示出针对检验HCR上的离子强度的效果的各种缓冲液条件的信噪比。

图7示出对经由使用生物素化的邻近发夹的prox-HCR被固定在显微镜载玻片上的链霉亲和素的检测。这表明HCR可以被用来特异性地检测固相试验中的分析物。

图8示出使用抗体偶联的邻近发夹对特异性分析物的检测。图8A示出干燥的兔抗体可以经由HCR被检测到。图8B示出检测依赖于分析物结合结构域对分析物的特异性识别。

图9示出使用prox-HCR对细胞样品内的特异性分析物的检测。这表明可以检测细胞样品内一系列不同的分析物。

图10示出对细胞样品中的蛋白-蛋白复合物的检测。这表明prox-HCR可以被用来使用偶联于靶向复合物中的不同组分的抗体的邻近探针来检测样品内的蛋白-蛋白复合物。

图11示出在非特异性激活上向第二互补区域引入错配的效果。A)PH2中的第二互补区域与激活寡核苷酸互补的序列。B)PH2中的第二互补区域与激活寡核苷酸互补的序列，但是包含2个错配。在不存在PH1序列时，错配的存在减少激活寡核苷酸的假阳性激活。

图12更详细地示出为prox-HCR的基础的原理。A)初级抗体结合它们各自的靶，并且被邻近探针结合。B)激活寡核苷酸结合在第一邻近探针的核酸结构域的发夹的环中并且干扰茎，由此释放第一互补性区域。C)第一互补性区域结合第二邻近探针的核酸结构域的发夹的环，从而释放HCR起始子区域。D)HCR起始子区域结合第一HCR单体。E)第一HCR单体结合第二HCR单体。F)第一和第二HCR单体的顺序结合形成HCR聚合物。

图13示出适合于使用在本发明的prox-HCR中的代表性寡核苷酸分子。A)和B)示出第一和第二邻近探针的分别具有30bp的茎和18nt的环以及24bp的茎和19nt的环的代表性核酸结构域。C)和D)示出具有短的粘性末端、茎和环结构(分别为9nt的5’末端，15bp的茎和11nt的环；以及11nt的3’末端，15bp的茎和9nt的环)的代表性HCR单体。寡核苷酸序列被示出于表2中。

图14示出通过表面等离子体共振监控的HCR方法的进行。A)滴定系列示出激活寡核苷酸结合固定的邻近发夹1。B)邻近发夹2随后结合邻近发夹1。C)滴定系列表明HCR单体1结合固定的“钓竿(ishing>

图15示出用于HCR反应的进行的时间进程实验。A)确定不同浓度下荧光在珠上的积累的Opera高通量筛选系统。这表明在37℃孵育仅30min之后荧光的强健的增加。甚至早至5min的孵育时间已足够看到荧光的剂量依赖型(HCR寡核苷酸的浓度)增长。B)在50nM的HCR寡核苷酸的存在下孵育的珠的表位荧光显微图像。30min后达到最大荧光，并且不会随着更长的孵育时间而增加。在最早的时间点(10min)之后，信号已经是与阴性对照可区分的。此外，阴性对照不会在整个时间段中产生可见量的信号。C)珠的图像。

图16示出prox-HCR的原位数据。A)-D)针对对细胞和组织样品中的E-钙粘素和β连环素之间的相互作用的检测，prox-HCR((A)和(C))和原位PLA((B)和(C))的比较。A)和B)分布模式类似于DLD1细胞中的prox-HCR和原位PLA。C)和D)分布模式还类似于结肠组织切片。当观察所产生的信号的实际数量时，清楚的是prox-HCR比原位PLA更有效。在另一方面，PLA中产生的信号比由prox-HCR产生的那些信号强得多。E)和F)在未处理的细胞和用100ngmL-1的PDGF-BB刺激的BjhTert细胞中PDGFR-β的磷酸化的可视化。G)HG3细胞中Syk的磷酸化的可视化。H)阴性对照(没有初级抗体)。两个实验都示出阳性样品中的强信号，同时荧光在生物阴性对照中为低的，并且在阴性对照中不存在。

图17示出在刺激后A431细胞中AlexaFluor488-EGF/EGFR复合物的内化的流式细胞仪读出结果。Prox-HCR试验被用来在670nm(Cy5)处检测细胞膜处的AlexaFluor488-EGF/EGFR，而AlexaFluor488单独检测。(B)对流式细胞仪数据的分析表明在在37℃下用AlexaFluor488-EGF刺激1min后，在525nm(AlexaFluor488)处的荧光有小的瞬移。(C)在37℃下、10min后，该瞬移增加。相反，我们可以看到在37℃下、1min后Cy5荧光的增加((B)，右手边柱状图)，这可能在10min之后不能再观察到((C)，右手边柱状图)。在与AlexaFluor488-EGF一起孵育30min之后，在525nm或者在670nm处的荧光都没有可观地改变(数据未示出)。

具体实施方式

实施例1–寡核苷酸系统的计算机模拟分析

用于邻近依赖型HCR(prox-HCR)的寡核苷酸系统被设计并且仔细调整。发夹被设计用于作为邻近探针的核酸结构域(邻近发夹)使用。

邻近发夹被设计为足够稳定的，从而它们不会自己打开，同时仍然能够在一经发生邻近结合时就打开，以获得良好的实验表现。因此在该设计中，邻近发夹不包含粘性末端，所述粘性末端是常规的HCR系统固有的特征，并且我们还考虑并且平衡了发夹的茎和环的长度，以及茎的C/G比率。为该方法设计了总共5种寡核苷酸(参见表1)。

表1：邻近HCR寡核苷酸系统。

首先用NUPACK(www.nupack.org)在计算机中构建所有的寡核苷酸。以这样的方式来设计寡核苷酸系统，在所述方式中，起始子寡核苷酸(“激活子”)将干扰第一邻近发夹的发夹结构，所述第一邻近发夹在邻近时可以干扰第二邻近发夹。两个邻近发夹都被设计为在不存在激活寡核苷酸时在动力学上被限制在它们的发夹结构中。处于它的打开形式的第二邻近发夹的3’末端可以干扰HCR发夹1，所述HCR发夹1是两个HCR扩增寡核苷酸(HCR单体)中的第一个。通过干扰彼此，两个HCR发夹将积累荧光标记的检测分子，即实质上缺口和荧光标记的双链DNA。类似于邻近发夹，HCR发夹被设计为在不存在起始的邻近发夹时被限制在它们的发夹结构中，由此避免反应的自身起始(参见图1)。

设计了一条44nt的起始子寡核苷酸。第一邻近发夹被设计为包含30bp的发夹和18nt的环，同时第二邻近发夹包含24bp的发夹和19nt的环。两个发夹的吉布斯自由能分别为-144kJ/mol和-105kJ/mol。两个HCR发夹(HCR单体)具有类似的结构(对于HCR发夹1，15bp的茎，9nt的环，11nt的粘性末端；以及对于HCR发夹2，15bp的茎，11nt的环，9nt的粘性末端)，并且具有类似的吉布斯自由能值(分别为-70kJ/mol和-75kJ/mol)。所有的能量计算都是使用NUPACK在37℃下，在用10mM的MgCl₂增补的PBS中进行的。

实施例2–溶液实验

试验被开发来证明上述方法可以被用来产生HCR产物，并且最优化起始和延伸所需要的反应条件，以最大化信噪比。

通过在室温下(RT)在反应缓冲液(PBS+10mM的MgCl₂)中孵育30分钟，生物素化的第一和第二邻近发夹被混合并且偶联到链霉亲和素涂覆的珠(Dynabeads>

使用Zeiss Axioplan 2成像显微镜来进行图像采集，所述成像显微镜装备有针对德克萨斯红(Texas Red)和DAPI优化的滤波器，使用20x(0.8NA)和40x(1.3NA)的物镜以及Zeizz AxioCam Mrm照相机。对于每个实验内所有样品，曝光时间被保持为相等的。对于所有数据集，用于采集的位点都是随机挑选的。

对图像中的荧光的测定是使用CellProfiler 2.1.0进行的。荧光珠被识别为原始对象，而针对被识别的对象的所有像素的中等强度值被计算并且转译为荧光单位(FU)值(即，记录为8比特的强度值归一化为从0至1的标度)。所有统计分析都是使用SPSS22(IBM；Release 22.0.0.0)实施的。

在存在起始子寡核苷酸的情况下孵育珠，荧光信号是在其中产生的，而不是在(-)样品中(参见图2和3)。整体荧光被发现在37℃时比在室温时更高并且更稳健(在孵育2小时之后，对于50nM，1.00FU对0.32FU；并且对于5nM，0.53FU对0.08FU)(参见图2D对B，以及图3D对B)。在37℃下，荧光在2小时之后达到峰值，并且不会进一步增加。信噪比(由具有(+)和没有(-)起始子的样品之间的比率限定的)在2小时之后达到峰值(50nM的11.5对5nM的15.1)(参见图4)。

实施例3–HCR构建体的长期稳定性

在上述试验中形成的HCR产物的长期稳定性是通过测定上述反应随着时间的荧光强度和信噪比来评估的。

生物素化的邻近发夹被偶联到珠，如实施例2中概述的。在洗掉残留的未结合的寡核苷酸之后，珠与5nM的起始子寡核苷酸在37℃(+)或者被留在反应缓冲液(-)中孵育15分钟。在两个另外的洗涤步骤之后，珠与5nM的HCR寡核苷酸在37℃下在反应缓冲液中孵育2、5和24小时。如实施例2中概述的进行可视化。

检验表明实施例1的四种不同的发夹种类稳定达至少五小时。在邻近HCR反应中产生的荧光信号在整个实验时期中持续，但是在24小时之后在(-)样品中可检测到低水平的荧光(参见图5A)，表明低水平的非特异性的HCR产物形成。荧光信号被发现随着时间而增加，直至24小时的时间结束。然而，在(-)样品中的非特异性荧光也被发现在24小时之后为最高(参见图5B)。

实施例4–离子强度和盐浓度的作用

上述实验是在不同的缓冲液中进行的，以确定离子强度对试验的作用。使用2xSSC缓冲液，用10mM的MgCl₂增补的1x>2增补的1xPBS，以及用1M的NaCl增补的50mM的Na₂HPO₄。

5nM的生物素化的第一和第二邻近探针与链霉亲和素涂覆的珠在分别的缓冲液中的每种中在RT下孵育30分钟。在洗涤两次之后，珠与5nM的起始子寡核苷酸在37℃(+)或者被留在反应缓冲液(-)中孵育15分钟。在两次另外的洗涤步骤之后，每个珠样品被劈开并且与5nM的HCR寡核苷酸在37℃下在它们各自的缓冲液中孵育。在2小时之后，样品被洗涤两次并且被固定在poly prep载玻片上以使信号可视化。

中值荧光从2x SSC缓冲液的0.009FU增加到用10mM的MgCl₂增补的1x>2HPO₄+1M>2：1.12；2x>2HPO₄+1M>2的中值荧光信号(从0.011FU至0.018FU；p<0.001[用Bonferroni事后检验进行单向方差分析])，导致2.124的信噪比，所述信噪比与50mM的Na₂HPO₄+1M的NaCl没有显著不同(p＝1.000[用Bonferroni事后检验进行单向方差分析])，然而所述信噪比显著不同于1x>2(p,1.000[用Bonferroni事后检验进行单向方差分析])。

实施例5–固相实验

上述反应检测被固定在固相表面上的分子的能力是通过将链霉亲和素固定在载玻片上并且使用生物素化的邻近发夹来检测所述链霉亲和素来评估的。

5nM的生物素化的邻近发夹在链霉亲和素涂覆的载玻片上在37℃下孵育30分钟。残留的寡核苷酸被用反应缓冲液洗掉。载玻片与起始子寡核苷酸在37℃(+)或者被留在反应缓冲液(-)中孵育15分钟。在洗涤之后，载玻片与5、10、20或50nM的HCR寡核苷酸在37℃下孵育2小时。载玻片再次被洗涤，在乙醇中干燥并且安装好。

在2小时之后，载玻片被可视化并且针对每个浓度的HCR寡核苷酸评估整体荧光(参见图7A)。尽管在每个浓度的HCR寡核苷酸的信号都是可检测的，但是更高的浓度导致更高水平的荧光。在针对50nM的寡核苷酸的(-)样品中信号是可检测的，表明低水平的非特异性的HCR产物形成。

实施例6–干燥的初级抗体的检测

开发试验来评估抗体偶联的邻近探针是否可以被用来检测原位情况下的分析物。兔抗体被固定在显微镜载玻片上，并且使用偶联于抗兔IgG的第一和第二邻近探针检测。

邻近发夹寡核苷酸被共价地偶联于IgG分子。使用SANH在室温下激活抗体达2小时。使用Zeba脱盐柱除去过量的SANH。使用10mM的苯胺作为催化剂，以超过三倍的量添加乙醛修饰的邻近发夹，并且在将成功偶联的邻近探针通过HPLC纯化之前，在室温下孵育2小时。

在干燥环境中，使兔抗-HIF1的1:100的稀释液在SuperFrost载玻片上在37℃下孵育过夜，并且用PBS洗掉残留的抗体。偶联于第一和第二邻近探针的驴抗兔抗体在载玻片上在37℃下孵育1小时；载玻片与起始子寡核苷酸(+)或者被留在反应缓冲液(-)中孵育。在洗涤之后，载玻片与10nM的HCR寡核苷酸在37℃下孵育2小时。载玻片被再次洗涤，在乙醇中干燥并且装好。

在进一步的实验中，鼠抗体被固定在载玻片上并且重复检测步骤。按照上文制备载玻片以估算HCR探针的非特异性结合。

在第一和第二邻近探针偶联于抗兔IgG并且在存在起始子寡核苷酸时孵育的样品中产生荧光信号。在(-)样品中没有检测到信号(参见图8A)。在鼠抗体被固定在载玻片上的样品中没有检测到信号，表明邻近HCR系统可以检测到样品内的特异性分析物(参见图8B)。

实施例7–原位实验

上述方法适合于检验细胞样品内的特异性分析物(组蛋白H3，核糖体蛋白L3a和hTert)是否可以经由邻近HCR被检测到。

BjhTert细胞在用10％v/v的FCS、2mM的谷氨酰胺和100U/ml的青霉素-链霉素增补的最小必需培养基(Gibco)中生长。在5％的CO₂气氛中、37℃的加湿孵育器中。在制备载玻片之前，细胞被胰蛋白酶化，被接种到八孔室的载玻片(Lab-Tek,Nunc)中，并且在显微镜载玻片制备之前被留下附着48小时。抽出培养基并且洗涤细胞，之后在3.7％的甲醛中冰上固定30分钟。在洗涤之后，残留的甲醛载玻片在96％的EtOH中干燥，并且被储存在-20℃用于进一步使用。

固定在显微镜载玻片上的BjhTert细胞在PBS中再水化，并且用0.1％的TritonX弥散5分钟。细胞在37℃下阻断30分钟。细胞与初级抗体(分别为兔抗组蛋白H3、核糖体蛋白L3a和hTert)一起在4℃下孵育过夜。在用PBS在室温下洗涤2次共2分钟之后，载玻片与偶联于抗兔IgG的第一和第二邻近探针在37℃下孵育1小时，如上述。在两次另外的洗涤之后，载玻片与10nM的起始子寡核苷酸孵育30分钟(+)或者被留在反应缓冲液中孵育(-)。在快速洗涤之后，细胞与20nM的HCR寡核苷酸在反应缓冲液中在37℃下孵育2小时。载玻片用反应缓冲液洗涤两次，之后用Hoechst进行核酸染色，并且载玻片被装有SlowFade。细胞如实施例2中被成像，并且获得之间具有480nm的4组z-水平。

组蛋白H3、核糖体蛋白L3a和hTert每个使用上述方法检测(参见图9A-C)。右手边的柱表示出信号从邻近HCR反应上升，而左手边的柱示出与DAPI通道合并的图像。每个切片的上片示出没有起始子寡核苷酸的反应(-)，而下片示出具有起始子寡核苷酸的反应(+)。

实施例8–原位邻近-HCR

进一步调整上述方法，以便评估邻近-HCR是否能够检测原位环境中的特异性蛋白-蛋白相互作用(PPI)。HIF-1α和HIF-1b之间的相互作用被选作模型系统。尽管HIF-1b/ARNT基本上在DLD1细胞中表达，但是HIF-1α的表达，以及由此HIF-1α/HIF-1b复合物的形成是可由CoCl₂诱导的。

DLD1细胞在如上述的用10％v/v的FCS、2mM的谷氨酰胺和100U/ml的青霉素-链霉素增补的McCoy’s 5a(修饰的)培养基(Gibco)中生长。细胞以6x10⁴细胞/cm²的密度被接种在八孔室载玻片中，并且被留下附着24小时。HIF-1α表达是通过在细胞如上文描述的被洗涤和固定之前用溶解在PBS中的150μM的CoCl₂(Sigma-Aldrich)处理细胞4小时来诱导的。

DLD1细胞如上述的再水化和弥散。细胞在37℃下用DuoLink(Olink)阻断1小时。细胞与鼠抗-HIF-1α(Abcam)和兔抗-HIF-1b(Santa Cruz Biotechnology Inc.)一起在4℃下孵育过夜。在用TBS-0.05％的Tween-20洗涤2次之后，细胞被阻断额外15分钟，并且与偶联于兔和鼠IgG的邻近探针在37℃下孵育1小时。如上述进行HCR产物的起始和扩增以及细胞程序。

HIF-1α/HIF-1b复合物可以使用邻近HCR试验来检测(参见图10)。图片左侧示出在已经用CoCl2处理细胞之后获得的图像，诱导HIF-1α的表达。HIF-1α和HIF-1b之间的相互作用用强信号可视化，而在右侧，在CoCl2不存在(即，没有表达HIF-1α)时，没有观察到信号——仅来自DAPI通道的信号是可检测的。

实施例9–可选的寡核苷酸设计

如实施例1中的为邻近依赖型HCR(prox-HCR)设计四组进一步的寡核苷酸(参见表2-5)。为两个邻近发夹序列(SEQ ID NOs:6和7)设计寡聚-A(oligo-A)衔接物序列，设计较短的激活子序列(SEQ ID NO:8)。还设计在激活寡核苷酸(SEQ ID NO:11)和PH2(SEQ IDNO:7)中的第二互补区域之间(并且因此在PH1(SEQ ID NO:12)中的第一互补区域之间)具有错配的寡核苷酸组(表4和5)。较短的激活子序列还被设计用于使用在该系统(SEQ IDNO:13)中。错配被以粗体示出在表4和5中。

表2：邻近HCR寡核苷酸系统——没有错配，长的激活子，寡聚-A。

表3：邻近HCR寡核苷酸系统——没有错配，短的激活子，寡聚-A。

表4：邻近HCR寡核苷酸系统——错配，长的激活子，寡聚-A。

表5：邻近HCR寡核苷酸系统——错配，短的激活子，寡聚-A。

NUPACK模拟指示以6nt减少起始子寡核苷酸的长度不应该影响信号产生，同时显著地减少激活寡核苷酸到PH2的杂交。这还被发现在错配被引入到系统中时。

错配降低PH1和PH2之间的杂交效率，但是旨在抑制激活寡核苷酸到PH2的杂交。NUPACK分析表明非特异性激活被减少。

使用基于珠的试验检验错配对非特异性激活的作用。对应于SEQ ID NO:7的PH2被固定在珠上。在与激活寡核苷酸(或者没有错配(SEQ ID NO:1)或者有错配(SEQ ID NO:11))一起孵育之后，使用100nM的HCR单体实施HCR反应。因为该试验是在不存在PH1寡核苷酸时进行的，任何激活都表示由激活寡核苷酸的非特异性激活。其中在激活寡核苷酸和PH2中的第二互补性区域之间存在错配的情况下，非特异性激活的程度显著低于其中没有错配的情况(比较图11中(B)部分(错配)和(A)部分(没有错配))。

实施例10–使用prox-HCR的进一步发展

结果

在以下实验中，使用表4中示出的寡核苷酸。

prox-HCR系统需要四种发夹种类和激活子，而不是仅两种发夹种类。两个邻近探针结合靶分析物(图12A)。在我们设计的第一步，激活寡核苷酸需要干扰第一邻近发夹(PH1)(图12B)。被释放的第一邻近发夹将干扰第二邻近发夹(PH2)(图12C)，由此释放用于HCR扩增的起始子序列。HCR扩增通过HCR单体1和2的交替结合发生(图12D-F)。

两个邻近探针包括核酸结构域(具有亚稳定的二级结构-发夹)。发夹包括长的茎(PH1和PH2分别为30bp和24bp)，以及相对大的环(对于两个邻近发夹分别为18nt和19nt(图13A-B))。对于两种二级结构的负的吉布斯自由能(–ΔG)均被估算为相当高的(在1M的NaCl中在37℃下为39.51kcal>–1和27.35kcal>–1)。HCR发夹具有与通常使用的HCR寡核苷酸类似的结构，即短的粘性末端(对于H1为9nt的5’末端，并且对于H2为11nt的3’末端)，对于两种寡核苷酸茎均为15bp，并且环由H1的11nt和H2的9nt组成(图13C-D)。

实验参数的优化

使用表面等离子体共振进行第一轮实验，以便检验寡核苷酸系统的动力学性能。

实验示出在梯度浓度下激活寡核苷酸到被固定的PH1的有效结合(图14A)。此外，随后打开的PH1到PH2的结合在没有任何可测定的解离的情况下也有效地发生(图14B)。由于prox-HCR的固有性能，传感图不能被拟合来获得针对缔合常数或解离常数的定量数据。

“钓竿”序列，(与突出于激活子-PH1-PH2复合物的HCR起始子区域一致，并且充当用于杂交链式反应的起始寡核苷酸)，被固定并且针对到HCR单体1的结合进行检验(图14C)。结果示出H1与钓竿的快速缔合，同时再次几乎观察不到解离。打开的H1到H2的随后结合在没有任何可测定的解离的情况下也有效地发生(图14D)。两个反应都不能被拟合，从而不能获得定量数据。

我们的数据进一步表明在PH2自身和H1或H2之间没有可见的关联。同样，PH1-激活子复合物自身不与H1或H2反应(数据未示出)。

为了进一步表征扩增反应的行为，我们使用Opera高通量筛选系统来确定在较短反应时间内荧光在珠上的积累。我们的数据示出在37℃下孵育仅30min之后荧光的稳健增加。甚至早至5min的孵育时间已足够看到荧光的剂量依赖型(HCR寡核苷酸的浓度)增加(图15A)。

基于这些实验以及来自Biacore的动力学计算，我们决定针对HCR寡核苷酸中的每种使用50nM的浓度用于随后的珠上的实验。

通过使用荧光显微镜，我们可以示出50nM的HCR寡核苷酸的反应在30min之后达到它的最大荧光，并且没有随着更长的孵育时间而增加。在最早的时间点(10min)之后，信号已经是可与阴性对照可区分的(图15B)。此外，在整个时间段中阴性对照都没有产生可见量的信号。示出荧光信号的发展的图像为图示说明的目的被示出(图15C)。

使用prox-HCR对蛋白相互作用进行原位分析

DLD1细胞和结肠组织中的钙粘蛋白和β连环蛋白之间的相互作用被用作模型系统，来示出当与原位PLA比较时prox-HCR的可行性(图16)。

结果示出对于prox-HCR(图16A)和细胞中的原位PLA(图16B)，信号定位的相同的特异性模式。类似地，prox-HCR在新鲜冷冻的结肠组织中的应用示出与原位PLA可比较的结果(图16C-D)。当观察所产生信号的实际数目时，清楚的是，prox-HCR比原位PLA更有效。在另一方面，在原位PLA中产生的信号比由prox-HCR产生的那些信号强得多。

Prox-HCR反应的特异性可以在(图16E-F)中评估出。我们使PDGFR-β在未处理的细胞(图16E)和用100ng>-1的PDGF-BB刺激的BjhTert细胞(图16F)中的磷酸化可视化。此外，我们检测了Syk在HG3细胞中的磷酸化(图16G)，并且将结果与技术性阴性对照(没有初级抗体)相比较(图16H)。两种试验都在阳性样品中示出强信号，而在生物学阴性对照中荧光较低，并且在技术性对照中不存在荧光。

流式细胞仪中的EGF-EGFR复合物的内化

图17示出刺激之后，在A431细胞中AlexaFluor488-EGF/EGFR复合物的内化的流式细胞仪读出结果。prox-HCR试验被用来在670nm(Cy5)下检测在细胞表面的AlexaFluor488-EGF/EGFR复合物，同时AlexaFluor488单独检测。对流式细胞仪的数据的分析示出相较于未被刺激的细胞，在用AlexaFluor488-EGF在37℃下刺激1min之后，在525nm(AlexaFluor488)处的小的荧光移位(图17A-B，左手边柱状图)。该移位在37℃下在10min后增加(图17C，左手柱状图)。相反，我们可以看到在37℃下1min之后Cy5荧光的增加(图17A-B，右手边柱状图)，这可能在10min后不能再观察到(图17C，右手边柱状图)。不管怎样，在与AlexaFluor488-EGF一起孵育30min之后(数据未示出)，在525nm或者670nm处的荧光都没有可观地改变。

讨论

在该研究中，我们呈现了用于以基于HCR的无酶试验检测蛋白相互作用和PTM的技术。我们可以展示它用于载玻片上原位反应的可行性以及它在流式细胞仪中的用途。

我们的prox-HCR寡核苷酸系统经历若干优化步骤，以便产生显示出合理的快速扩增速率而不产生假阳性信号的系统。所包括的特征中的一个是PH1和PH2之间的两个碱基错配。该错配降低PH1-PH2复合物的稳定性，这反过来使系统为较低效率的。然而，错配减少了激活寡核苷酸结合PH2的能力，并且阻止H1和H2结合I-PH1复合物，所述两种结合都可能导致非特异性信号。

当将我们的方法与经典的HCR比较时，寡核苷酸系统的主要区别中的一项是是不同的茎/环长度。Dirks和Pierce在他们最初的论文中提出18bp的茎和6nt的环的系统(Dirks,R.M.和Pierce,N.A.2004.PNAS 101,15275-15278)，所述系统与我们的系统不同，我们的系统使用15bp/9nt和15bp/11nt的HCR发夹，以及24bp/18nt和29bp/18nt的邻近发夹。当评估茎与环的比率时，我们可以看到这两个系统之间的可观的区别(常规的HCR：3相对prox-HCR：1.4和1.7)。Dirks和Pierce测试了具有不同的茎与环的比率的一系列发夹。所有他们的发夹变体或者是不稳定的，或者是在开始反应方面太慢。然而，我们呈现的系统在较长时间内是稳定的，并且提供合理的扩增速率。

然而，该扩增速率不能被定量确定。我们的Biacore数据不能被拟合，很可能是因为置换部分被释放时的构象改变。然而，我们可以估算缔合常数在10⁶M^–1s^–1附近，并且解离常数在10^–10s^–1附近。尽管我们不能提供精确值，但是我们可以推断扩增反应以合理的速度进行，并且没有可见的解离发生。这也与我们在磁珠上构建的实验一致。因为缺少返回反应，我们可以假设扩增开始直到用于杂交链式反应的标志HCR寡核苷酸中的一个或两个被耗尽为止。

用于使蛋白相互作用原位即时可视化的黄金标准是邻近连接试验(Soderberg,O.等2006.Nature methods 3,995-1000)。在原位PLA中，两个寡核苷酸与两个邻近探针杂交，并且随后被连接以形成圆形。该圆形随后在称作滚环扩增的过程中被扩增，以形成称作滚环产物(RCP)的亚μm结构。RCP可以通过杂交结合荧光团的检测寡核苷酸被视觉化。以该方式，原位PLA产生比可以被数字化定量的更明亮和更大的信号，所述信号连同它的特异性和灵敏度一起是PLA的主要优势之一。另一方面，因为PLA很大程度上依赖于酶促步骤(即，连接和酶促聚合)，运行是昂贵的。同样，非圆环的连接产物的可能产生可以是原位PLA的低效率的原因。

说到所述方法相较于原位PLA的特异性，就信号定位而言，Prox-HCR的行为类似于原位PLA。此外，生物学阴性对照以及技术性对照示出没有或很少的非特异性信号的产生。就各个信号的信号强度而言，变得清楚的是，酶辅助的原位PLA的扩增反应产生更大且更明亮的信号，而prox-HCR仅产生非常小的荧光点。这是PLA技术的优点，因为它允许它的结果的数字量化。然而，因为prox-HCR的更高的效率(产生多得多的荧光信号)，所产生的信号更多地类似于仍然使它能够可视化相互作用均匀的扩散染色。

除了被固定在载玻片上的细胞和组织之外，我们可以证明prox-HCR在FACS中的可行性。我们不仅可以经由流式细胞仪区分受刺激和未受刺激的细胞，而且还能视觉化EGFR到细胞内的内化。具体地，我们可以证明，尽管AlexaFluor488-EGF/EGFR复合物在1min的刺激之后在细胞表面是可检测的，而在10min之后它不再能被检测。同时，AlexaFluor488信号从1min上升至10min，指示AlexaFluor488-EGF/EGFR复合物中的大部分已经在10min之后内化。

在保持PLA的特异性的同时保持酶促步骤的独立性是prox-HCR方法的最大优势。这可观地减少了试验的成本，使得所述方法更适合于蛋白相互作用的高通量筛选。此外，它通过消除对质量和储存方面的考量来提供优点。很可能prox-HCR的最大影响将是作为关于护理器件的方法。这是因为试验的无酶环境对于储存(即，器件可以被储存在室温下较长时间)和处理(即，器件可以完全在37℃下运行而不需要循环温度)仅具有很少的要求。除了这点之外，prox-HCR理论上服从HCR的其他变体，如用于绝对定量的实时HCR，以及可能由于它的指数信号生长而提供更好的信噪比的支化型HCR扩增。此外，邻近探针的本质，即它们具有二级结构的事实，使得它们对于寡核苷酸序列的变化非常敏感。这暗示prox-HCR可以适合于多重体，这将是所述技术的另一个优点。

总而言之：我们已经在本文中描述了结合在产生局部信号的非酶促过程中，针对PPI和PTM的增加的选择性或检测的双重识别的方法。

方法

寡核苷酸系统的设计

我们首先用NUPACK(www.nupack.org)在计算机模拟分析中构建所有的寡核苷酸。我们以这样的方式设计了寡核苷酸系统，在所述方式中，激活寡核苷酸将干扰第一邻近发夹的发夹结构，所述第一邻近发夹在邻近时可能干扰第二邻近发夹。关于两个邻近发夹，我们将它们设计为在不存在激活寡核苷酸时在动力学上被困在它们的发夹结构中。处于它的打开形式的第二邻近发夹的3’末端充当钓竿，并且可以干扰两个HCR-扩增寡核苷酸(HCR发夹H1和H2)中的第一个。通过干扰彼此，H1和H2将积累荧光标记的检测分子，实质上为缺口和荧光标记的双链DNA。类似于邻近发夹，HCR-发夹被设计为在不存在起始邻近发夹时被困在它们的发夹结构中，由此避免反应的自我起始。

细胞培养

细胞在37℃、5％的CO₂气氛中在加湿孵育器中生长。BjhTert细胞在用10％v/v的胎牛血清、2mM的谷氨酰胺和100U/ml的青霉素-链霉素增补的Gibco最小必需培养基中生长。为制备载玻片，细胞被胰蛋白酶化并且被接种到八孔室的载玻片(Lab-Tek,Nunc)中，之后被允许粘附48h。第二天，培养基被换成饥饿培养基(具有2mM的谷氨酰胺和100U/ml的青霉素-链霉素的DMEM)，并且细胞被孵育24h。为进行刺激，100ng>–1的PDGF-BB被添加到细胞，并且细胞在37℃下孵育5min。随后抽出培养基，并且细胞被在3.7％的甲醛中冰上固定30分钟。在洗掉残留的甲醛之后，载玻片在96％的EtOH中干燥，并且被储存在-20℃直至进一步使用。

DLD1细胞被维持在用10％v/v的胎牛血清、2mM的谷氨酰胺、100U/ml的青霉素-链霉素增补的McCoy’s 5A(修饰的)培养基(Gibco)中。为了使钙粘蛋白/β-连环蛋白的相互作用视觉化，细胞被接种在在八孔室载玻片中，以在粘附之后接近融合。抽出培养基之前，细胞辈孵育24h，用PBS洗涤并且用3.7％的甲醛溶液在冰上固定30min。如上文描述的，细胞被干燥并储存在–20℃直至进一步使用。

HG3细胞被保持在用10％v/v的胎牛血清、2mM的谷氨酰胺、100U/ml的青霉素-链霉素增补的RMPI 1640培养基中。为了制备载玻片，细胞被快速离心(280g，10min)，并且用PBS洗涤。150,000个细胞被转移到PBS中的每个细胞漏斗中，并且使用来自Tharmac的Cellspin1创建细胞离心涂片器。细胞用3.7％的甲醛固定，洗涤并且干燥，如上文描述的。它们可以被储存在–20℃直至进一步使用。

A431细胞在用10％v/v的FBS、2mM的谷氨酰胺、100U/ml的青霉素-链霉素增补的DMEM中生长，之后被接种到6孔板中并且被保留粘附过夜。第二天，细胞在如上文描述的用于上文BjhTert细胞的饥饿培养基中进行饥饿处理。为流式细胞仪分析，使用accutase酶(Sigma)在37℃下处理10min分离细胞。用PBSB(用0.5％的BSA增补的1xPBS)洗涤细胞两次，并且用40ng>–1的AlexaFluor488-EGF在37℃下刺激细胞达1min、10min和30min。通过添加1％的甲醛溶液终止反应。细胞被洗涤并且随后用1％的甲醛溶液在冰上固定10min。残留的甲醛被洗掉，之后细胞立即用于prox-HCR。

抗体偶联–邻近探针的产生

按照先前描述的进行二级抗体的偶联(Jarvius,M.et al.2007.Molecular&cellular proteomics 6,1500-1509)。简单地说，用SANH(VWR)在室温(RT)下激活抗兔和抗鼠抗体(目录号分别为：711-005-152和715-005-150，Jackson ImmunoResearchLaboratories,West Grove,PA)2h。使用Zeba脱盐柱(Thermo Scientific)除去SANH，并且以超过三倍的量将每批次单独地与乙醛修饰的邻近发夹混合。在添加之前，邻近发夹被加热到95℃达2min，以便摧毁可能已经形成的任何四级结构。使用10mM的苯胺作为催化剂，反应在通过高压液相层析纯化所产生的邻近探针之前，被保留在RT下额外孵育2h。所以的偶联都是在SDS胶上验证的。

固相实验

使用表面等离子体共振的杂交动力学实验

所有实验均使用Biacore 2000或Biacore S51仪器进行。实验中使用的所有缓冲液都是0.22μm过滤和脱气的。经由结合有1000-1500RU的固定水平的胺，以被固定在CM5传感器芯片上的链霉亲和素开始。每个传感器芯片上的一个流动池在没有担保固定作为参照的情况下被激活或失活。链霉亲和素涂覆的表面是以50mM的NaOH、1M的NaCl的脉冲注射为先决条件的，以建立稳定的基线。为了分析不同的相互作用，150-200或50-100RU的生物素化的寡核苷酸(钓竿，PH1或PH2)被捕获在链霉亲和素涂覆的表面上。我们在37℃下在用0.05％(v/v)的Tween-20增补的HCR缓冲液(50mM的Na₂HPO₄、1M的NaCl，pH＝7.4)中进行所有的动力学试验。在固定之后，0.5-250nM的浓度系列的对应的寡核苷酸(激活子、PH2、H1或H2)以45uL>–1的流速被注射在表面上。为进行三元复合物研究(PH2-PH1-I和H2-H1-钓竿)，我们在样品注射之前捕获了配体。所有的缔合都被监控达3min，同时解离被评估1min。在每个循环结束时，表面用30-sec的脉冲注射10mM的NaOH来再生。表面衰减小于每个循环1％。对于所有实验的传感图是使用Biaevaluation>

使用Opera高通量筛选系统对磁珠上的荧光积累进行成像。

链霉亲和素涂覆的磁珠(Dynabeads M-280链霉亲和素，Invitrogen)被装载有2nM的生物素化的钓竿，并且在RT孵育它们达30min。同时，H1和H2被解冻并且单独保留以调整室温达30min。珠被洗涤两次，并且以增加浓度的H1和H2在37℃下孵育。珠被转移到384孔板(Molecular Machines and Industries AG,MMI,Switzerland)中，并且在Opera高通量筛选系统(Perkin Elmer)中成像。使用488nm的激光在2mW下对每个条件取16幅图像，以通过具有NA1.2的60x UPLSAPO的水浸物镜激发样品。图像的曝光时间为160ms，并且曝光高度被设置为超过孔底部1.5μm。使用具有520(+/-35)的带通滤波器的冷却的CCD照相机捕获图像。

通过荧光显微镜进行Opera HCSS校验

链霉亲和素涂覆的磁珠装载有10nM的生物素化的PH1和PH2。在洗去残留的未结合的发夹之后，反应物被分成两半，一半与10nM的激活寡核苷酸在37℃下孵育30min，同时另一半被留在反应缓冲液中。在两个额外的洗涤步骤之后，两个样品都与50nM的扩增寡核苷酸一起孵育。在预定的一段时间(10min、30min、60min和150min)之后，样品被收取、洗涤、固定在聚L-赖氨酸涂覆的玻璃载玻片(Sigma)上，并且在显微镜下(Axioplan,Zeiss)可视化。

被固定的细胞中的原位实验

Prox-HCR实验

BjhTert载玻片在PBS中再水化，并且用0.1％的TritonX-100弥散5分钟，并且再次在PBS中洗涤。使用DuoLink封闭试剂(Olink Bioscience)在37℃下封闭细胞45分钟。其后，细胞与针对PDGFR(1:100,#3169S,Cell Signaling)的初级抗体和总含磷络氨酸(1:100,pY-100,#9411S,Cell Signaling)一起在4℃下孵育过夜。在室温下用PBS洗涤2分钟共2次以及用HCR缓冲液洗涤一次之后，载玻片与指向兔IgG和鼠IgG的10μg>–1的邻近探针在HCR缓冲液中在37℃下孵育1小时。在两个或更多个用HCR缓冲液的洗涤步骤之后，载玻片与10nM的起始子寡核苷酸孵育30分钟。在快速洗涤之后，细胞与20nM的HC>

关于DLD1和HG3细胞，细胞如上述的再水化和弥散。用DuoLink封闭试剂在37℃下封闭非特异性结合位点1小时，之后细胞与用于DLD1细胞的指向钙粘蛋白(1:100,610182,BD Biosciences)和β-连环蛋白((1:300,Sc7199,Santa-Cruz)的初级抗体，以及用于HG3细胞的指向总酪氨酸(1:100,Sc1240,Santa-Cruz)和p-酪氨酸(1:200,AP3271a,Abgent)的初级抗体一起在4℃下孵育过夜。在用TBS-0.05％Tween-20洗涤5min后，非特异性结合位点被再次封闭15分钟，并且载玻片与指向兔和鼠IgG的10μg>–1的邻近探针在37℃下孵育1小时。最后，如上文描述的进行prox-HCR的起始和扩增。

原位PLA实验

对于原位PLA实验，根据制造商建议使用DuoLink试剂盒(Olink Bioscience)。简单地说，DLD1细胞如针对prox-HCR描述的那样再水化和弥散。在用DuoLink封闭试剂在37℃下封闭非特异性结合位点1小时后，细胞与指向钙粘蛋白(1:100)和β-连环蛋白((1:300)的初级抗体一起在4℃下孵育过夜。用DuoLink洗涤缓冲液A洗涤细胞5min共两次，并且细胞与邻近探针(PLUS and MINUS,Olink Bioscience)在抗体稀释液中在37℃下孵育1h。在新一轮的洗涤步骤之后，连接混合物被施加到细胞并在37℃下孵育30min。额外的洗涤之后是RCA和对滚环产物的荧光检测。用Hoechst对细胞进行复染，并且如上文描述的安装好。

组织实验

使用3.7％的甲醛溶液在室温下对新鲜冷冻的健康结肠组织进行固定15min。用PBS洗涤载玻片两次，并且随后使用DuoLink封闭试剂在37℃下封闭载玻片60分钟。在封闭载玻片之后，将载玻片与PBS中针对钙粘蛋白(1:100)和β-连环蛋白((1:300)的初级抗体一起在4℃下孵育过夜。第二天，用PBS洗涤载玻片3次，每次2min，并且再次封闭30min。载玻片与指向兔和鼠IgG的邻近探针在HCR缓冲液中在37℃下孵育1小时。在两个或更多个用HCR缓冲液的洗涤步骤之后，载玻片与激活寡核苷酸在37℃下孵育30分钟。再次用HCR缓冲液洗涤载玻片两次，并且载玻片与20nM的HCR发夹在HCR缓冲液中在37℃下孵育1小时。随后，载玻片用HCR缓冲液洗涤，并且用PBS洗涤一次，之后用Hoechst对核酸进行复染。载玻片被装有SlowFade。

为了对在细胞和组织上进行的试验进行荧光显微镜图像采集，使用ZeissAxioplan2成像显微镜，所述成像显微镜装备有针对德克萨斯红(Texas Red)、AlexaFluor488、Cy5和DAPI优化的滤波器，40x(1.3NA)的物镜，以及Zeizz AxioCam MRm照相机。在每个实验内曝光时间被保持为对于所有样品相同的。对于原位实验，我们用330nm获得中间的10z-水平。对于所有数据集，我们随机选择用于采集的位点。

流式细胞仪

使用Olink封闭剂对细胞封闭45min，之后细胞与指向EGFR(1:500,M723901,Dako)和Alexa Fluor 488(1:500,A-11094,life technologies)的初级抗体一起在4℃下孵育过夜。在洗涤之后，如上文描述的进行prox-HCR实验流程，并且使用LSR-II(BD Bioscience)读出荧光。

图像分析

为了在图像中获得对磁珠的荧光的测定，所述图像经由HCR转化成信号产生，我们使用了CellProfiler 2.1.0。荧光珠被识别为原始对象。随后我们针对所识别的对象的所有像素测定了中间强度值，所述中间强度值被转化为荧光单元(FU)(即对以8比特记录的强度值按从0到1的比例进行的标准化)。